ДНК-гидролизующие аутоантитела и их влияние на рост клеток in vitro

Актуальность проблемы.

Выяснению роли аутоантител (ААТ) в системе иммунного ответа при аутоиммунной патологии и в норме посвящено много исследований в области биохимии, иммунологии, аллергологии. На сегодняшний день идентифицировано большое число антигенов, к которым чаще всего обнаруживаются ААТ — энзимы основных метаболических путей, рецепторы различных клеток, внутриклеточные компоненты, нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды, фосфолипиды и др (Габибов и др., 1991; Насонова, 1995).

При многих вариантах системных аутоиммунных заболеваний (ревматоидном артрите, синдроме Шегрена, антифосфолипидном синдроме и, особенно при системной красной волчанке) у больных наблюдается гиперпродукция аутоантител с ДНК-гидролизующей активностью (Шустер, Гололобов, Габибов, 1991).

Системная красная волчанка — тяжелое хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание соединительной ткани. Клинические проявления зависят от остроты болезни и локализации поражений. Возможны изменения со стороны кожи, суставов, легких, сердца, ЦНС. Более чем в 50% случаев СКВ развивается тяжелое поражение почеклюпус-нефрит. При длительном течении болезни возникают необратимые изменения со стороны внутренних органов. В особо тяжелых, запущенных, поздно распознанных случаях волчанка может приводить к смертельному исходу в короткие сроки. В многочисленных исследованиях было показано, что важное значение в патогенезе этого заболевания играют аутоантитела. Отмечено, что одним из характерных клинических признаков данного заболевания является появление так называемых анти-нуклеарных антител (Чучалин, 1997; Pisetsky, 1998). Однако, биологическая роль аутоантител к ДНК при СКВ остается до конца не ясной, в частности, не выяснено их действие на ткани почки при люпус-нефрите.

Полученные разными авторами (Vlahakos, Foster, 1992; Reichlin, Hahn, Koren, 1995) данные свидетельствуют о том, что AT к ДНК, обнаруживаемые у больных СКВ, способны действовать на живые клетки, связываясь с их поверхностью или проходя внутрь клеток. Результатом этого может быть повреждение и последующее разрушение клеток.

Известно, что ААТ к ДНК могут иметь прямое отношение к развитию патологического процесса при люпус-нефрите. Поэтому всесторонние исследования ААТ к ДНК при СКВ необходимы как для диагностики и понимания патогенеза данного заболевания, так и для постоянного контроля за эффективностью проводимого лечения. Исследования ферментативной активности ААТ к ДНК несомненно будут способствовать расширению наших познаний о биологической роли каталитических антител и при нормальном развитии организма.

До сих пор не существует общепринятого способа выделения ААТ к ДНК из крови, что является одной из причин противоречивости результатов о содержании ААТ к ДНК у больных СКВ, получаемых разными авторами (Ермекова, 1981; Козырь, 1996). Актуальной также является разработка методов оценки ДНК-гидролизующей активности аутоантител. Как показали наши исследования, данный иммунологический показатель может быть использован как для наблюдения за динамикой патологического процесса, так и для оценки эффективности проводимого лечения.

Целью данной работы является исследование влияния ДНК-гидроли-зующих аутоантител из крови больных системной красной волчанкой на рост клеток in vitro. При этом необходимо решить следующие задачи:

• получение из сыворотки крови больных СКВ высокоочищенных фракций IgG, содержащих аутоангитела к ДНК;

• определение ДНК-гидролизующей способности полученных фракций IgGв характеристика ДНК-гидролизующей активности фракций ААТ к ДНК;

• исследование влияния фракций ААТ на рост клеток in vitro.

Научная новизна.

Установлено, что популяция аутоантител к ДНК у больных СКВ гетерогенна: существуют по крайней мере два типа (субклона) ААТ к ДНК, различающихся по способности связываться с анионообменником. Показано, что аутоантитела к ДНК, аффинно связывающиеся с ПротеинА-сефарозой являются каталитическими антителами с дезоксирибо-нуклеазной активностью. Установлено, что ДНКазная активность аутоантител к ДНК при СКВ термостабильна, является металлозависимой и имеет оптимум рН — 7,5. Впервые показано, что ААТ к ДНК при СКВ обладают рост стимулирующей активностью в отношении клеток линии СПЭВ в условиях in vitro. Аутоантитела предотвращают гибель клеточного монослоя в бессывороточной среде, стимулируют деление клеток и рост клеточной культуры в среде со стандартным содержанием сыворотки. Установлена корреляция между степенью ДНК-гидролизующей активности аутоантител и их способностью стимулировать рост клеток in vitro. При ремиссии СКВ у больных, прошедших краткий курс гормональной терапии, ДНКазная активность AT снижается и антитела теряют способность стимулировать пролиферацию клеток.

Практическая значимость.

Разработан метод многоступенчатой очистки аутоантител к ДНК из сыворотки крови больных СКВ. Метод позволяет получать две фракции антител, различающиеся по способности связываться с анионообменником и содержанию ДНК-гидролизующих антител. Показано, что ферментативная активность аутоантител к ДНК, в отличие от активности ДНКазы сыворотки крови, термостабильна. При инкубации сыворотки крови больных СКВ при в течение 40 минут ДНКазная активность аутоантител к ДНК сохраняется, что может иметь диагностическое и прогностическое значение для медицины. Разработана методика и соответствующее программное обеспечение для анализа электрофореграмм с использованием компьютерного сканера. Методика оценки ДНК-гидролизующей активности антител может быть использована при наблюдении за течением болезни и ходом проводимого лечения.

Апробация работы.

Основные результаты исследования докладывались на III Республиканской научно-технической конференции молодых ученых и специалистов (г. Казань, 1997) — IX Международной конференции молодых ученых «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений», (г. Казань, 1998) — III Пущинской конференции молодых ученых (г. Пущино, 1998) — Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (г. Санкт-Петербург, 1998) — V Международной конференции «Биохимия здоровья и болезней» (г. Иерусалим, Израиль, 1998) — XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (г.Санкт-Петербург, 1999) — I научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2000) — Международной научно-практической конференции «Современная техника и технологии в медицине и биологии» (г. Новочеркасск, 2001), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 1997;2000 гг.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ.