Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере ?-эндотоксинов Cry3A и Cry9A
Диссертация
Применение химических методов борьбы с насекомыми-вредителями в большинстве случаев не возможно, так как делает продукцию не пригодной к употреблению. Значительно более перспективными являются биоинсектициды, и, прежде всего, — препаратыполученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных, подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (5-эндотоксинов… Читать ещё >
Содержание
- 1. Введение
- 2. Обзор литературы
- 2. 1. Организация Cry-белков
- 2. 1. 1. Физико-химические свойства Cry-белков
- 2. 1. 2. Сравнение первичной структуры Cry-бел ков
- 2. 1. 3. Пространственная организация молекулы Cry-белков
- 2. 1. 4. Механизм действия Cry-белков
- 2. 2. Пищеварительные эндопептидазы насекомых
- 2. 2. 1. Общая характеристика ферментов
- 2. 2. 2. Связь между набором кишечных протеиназ и рН. Компартментализация средней кишки
- 2. 2. 3. Множественные формы кишечных протеиназ насекомых
- 2. 2. 4. Изменение спектра кишечных протеиназ в ходе развития насекомого
- 2. 2. 5. Индуцибельный характер синтеза протеолитических ферментов насекомых
- 2. 2. 6. Эволюция кишечных протеиназ
- 2. 3. Ограниченный протеолиз Cry- белков
- 2. 3. 1. Ход ограниченного протеолиза Cry-белков определяется особенностями их пространственной структуры
- 2. 3. 2. Особенности действия пищеварительных протеиназ насекомых на 8-эндотоксины ВТ
- 2. 4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых
- 2. 4. 1. Связывание Cry-белков с мембранами кишечного эпителия чувствительных насекомых
- 2. 4. 2. Кадгериноподобный рецептор Сгу-белков
- 2. 4. 3. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков
- 2. 4. 4. Элементы структуры Сгу-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором
- 2. 4. 5. Доказательство участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo<
- 2. 4. 6: Токсинсвязывающие свойства аминопептидазы N
- 2. 4. 7. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N
- 2. 4. 8. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Сгу-белков
- 2. 4. 9. Щелочная фосфатаза
- 2. 4. 10. ADAM металлопротеиназа
- 2. 4. 11. Альфа-амилаза
- 2. 4. 12. Так что же является рецептором 8-эндотоксинов ВТ в организме чувствительных насекомых?
- 2. 4. 13. Механизм бивалентного взаимодействия токсина с апикальной мембраной клеточного эпителия
- 2. 4. 14. Другие кандидаты на роль рецептора Cry-белков
- 2. 4. 15. Альтернативные представления о механизме действия токсинов
- 2. 5. Изучение способности токсинов ВТ образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах
- 2. 5. 1. Участие а-спиралей домена I в образовании пор
- 2. 5. 2. Изучение взаимодействия с мембранами синтетических пептидов, соответствующих а-спиралям N-концевого домена
- 2. 5. 3. Мутагенез спирального домена
- 2. 5. 4. Свойства пор, образуемых активированными токсинами ВТ в искусственных фосфолипидных мембранах и мембранах чувствительных клеток
- 2. 1. Организация Cry-белков
- 2. 5. 5. Олигомсризация Cry-белков и ее связь с порообразованием
- 3. 1. Материалы
- 3. 2. Получение кишечного экстракта гусениц G. mellonella
- 3. 3. Определение общей протеолитической активности
- 3. 4. Определениетриптической активности!
- 3. 5. Определение активности химотрипсина1. 74'
- 3. 6. Определение активности пролинэндопептидазы
- 3. 7. Определение активности металлопротеиназ
- 3. 8. Изучение влияния рН на протеолитическую активность экстракта средней кишки <7. те11опе11а
- 3. 9. Изучение влияния ингибиторов на протеолитическую активность кишечного экстракта гусениц (т. теПопеПа
- 3. 10. Определение постэлектрофоретической активности методом зимографии
- 3. 11. Электрофорез в денатурирующих условиях
- 3. 12. Выделение трипсина из кишечного экстракта & теПопеПа
- 3. 13. Определение Ы-копцевой аминокислотной последовательности
- 3. 14. Выделение химотрипсина из кишечного экстракта О. теПопеПа
- 3. 15. Выделение 8-эндотоксинов
- 3. 16. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков
- 3. 17. Вестерн-блотгинг
- 3. 18. Определение концентрации белка
- 3. 19. Биотинилирование белков
- 3. 20. Получение препаратов везикул апикальных мембран (ВВМУ) кишечного эпителия личинок Т. тоШог и гусениц & теПопеПа
- 3. 21. Определение активности лейцинаминопептидазы
- 3. 22. Определение активности щелочной фосфатазы
- 3. 23. Изучение белкового состава апикальной мембраны клеток кишечного эпителия
- 3. 24. Синтез аффинных сорбентов СгуЗА^кДа- и Сгу9А65кда-аминогексилагарозы
- 3. 25. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков Т. тоШог
- 3. 26. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков С. те11опе11а
- 3. 27. Лиганд-блотгинг
- 3. 28. Изучение связывания белков, элюированных с аффинных сорбентов
- 3. 29. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции
- 3. 30. Масс-спектрометрическое исследование
- 3. 31. Регистрация изменений мембранного потенциала и трансмембранного градиента рН на везикулярной мембране
- 3. 32. Определение токсичности СгуЗА и продуктов его протеолиза для насекомых
- 4. 1. Изучение комплекса протеиназ средней кишки гусениц G. mellonella (состав, свойства, ограниченный протеолиз 5-эндотоксина Сгу9А B. thuringiensis)
- 4. 1. 1. Изучение суммарной протеолитической активности экстрактов, полученных из различных отделов средней кишки гусениц
- 4. 1. 2. Анализ ферментного состава протеолитического комплекса средней кишки G. mellonella с помощью специфических субстратов протеиназ
- 4. 1. 3. Ингибиторный анализ протеиназ средней кишки G. mellonella
- 4. 1. 4. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса кишечного экстракта G. mellonella методом зимографии
- 4. 1. 5. Изучение ферментного состава протеолитического комплекса кишечного экстракта G. mellonella методом ионообменной хроматографии
- 4. 1. 6. Выделение и характеристика фермента с триптической активностью из кишечного экстракта G. mellonella
- 4. 1. 7. Получение препарата частично очищенного химотрипсина из экстракта средней KmniaiG. mellonella
- 4. 1. 8. Протеолиз белков кристаллов подвида galleriae ВТ кишечным экстрактом гусениц G. mellonella и некоторыми присутствующими в нем ферментами
Список литературы
- Akerman K.E.O. and' Wikstrom, K.F. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential. FEBS Letters, 68, 191−197.
- Apell, H.-J. and Bersch, B. (1987) Oxonol VI as an optical indicator for membrane potentials in lipid vesicles. Biochim: Biophys. Acta, 903(3), 480−94.
- Alcantara, E.P., Alzate, O., Lee, M.K., Gurtiss, A., and Dean, D.H. (2001) Role of a-helix seven of Bacillus thuringiensis CrylAb 5-endotoxin in membrane insertion, structural stability and ion channel activity. Biochemistry, 40,2540−2547. —-—~~"
- Alzate, O., You, T., Claybon, M., Osorio, C., Curtiss, A. and Dean, D.H. (2006) Effects of Disulfide Bridges in Domain I of Bacillus thuringiensis CrylAa delta-Endotoxin on Ton-Channel Formation in Biological Membranes. Biochemistry, 45(45),
- Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, DJ. (1991) Cytotoxicity of a cloned Bacillus thuringiensis subsp. israelensis CrylVB toxin to an Aedes aegypti cell line. FEMS Microb. Lett., 83,273−276.
- Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, DJ. (1992) Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo. FEMS Microb. Lett., 94, 63−68.
- Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1993) Effects on toxicity of eliminating a cleavage site in a predicted interhelical loop in Bacillus thuringiensis CrylVB 8-endotoxin. FEMS Microb. Lett., Ill, 255−262.
- Angus, T.A. (1954) A bacterial toxin paralysing silkworm larvae. Nature, 173,
- Arenas, I., Bravo, A., Soberon, M., and Gomez, I. (2010) Role of alkaline phosphatase from Manduca sexta in the mechanism of action of Bacillus thuringiensis CrylAb toxin. J. Biol. Chem., 285(17): 12 497−12 503.13597−605.545.546.
- Aronson, A.I., Wu, — D, and Zhang, C. (1995) Mutagenesis of specificity and" toxicity regions of- Bacillus thuringiensis protoxin gene. J. Bacteriol., 177, 4059−4065.
- Aronson, A.I., Geng, C., and Wu, L. (1999) Aggregation of Bacillus thuringiensis CrylA’toxins upon binding to target insect larval midgut vesicles. Appl. Invironment. Microb., 65, 2503−2507.
- Aronson, A.I. and Shai, Y. (2001) Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiol. Lett., 195, 18.
- Azuma, M., Harvey, W.R., and Wieczorek, H. (1995) Stoichiometry of K+/H+ antiport helps to explain extracellular pH 11 in a model’epithelium. FEBS Letters, 361, 153−156.
- Bah, A., Frankenhuyzen, K. van, Brousseau, R., and Masson, L. (2004) The Bacillus thuringiensis CrylA toxin: effects of trypsin and chymotrypsin site mutations on toxicity and stability. J. Invertebrate Pathol., 85, 120−127.
- Barbehenn, R.V. (2003) Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species. J. Chem. Ecol., 29, 683−702.
- Barrows, B.D., Griffitts, J.S., and Aroian- R.V. (2007) Resistance is non-futile: resistance to Cry5B in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Invertebr. Pathol., 95(3), 198−200.
- Belfiore, C.J., Vadlamudi, R.K., Osman, Y.A., and Bulla, L.A., Jr. (1994) A specific binding protein from Tenebrio molitor for the insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Biochem Biophys Res Commun., 200(1), 359−364.
- Blankemeyer, J.T. Demonstration of a pump-mediated efflux in the epithelial potassium active transport system of insect midgut (1978) Biophys. J., 23,313−318.
- Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method’for the quantitation* of microgram* quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. AnalytBiochem., 72, 248−254.
- Broehan, G., Kemper, M., Driemeier, D, Vogelpohl, I., and Merzendorfer, H. (2008) Cloning and expression analysis of midgut chymotrypsin-like proteinases in the tobacco hornworm. J. Insect. Physiol., 54(8), 1243−1252.
- Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. (2005) Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications. J. Mol. Biol., 348, 363−382.
- Candas, M., Francis,. B.R., Griko, N.B., Midboe, E.G., and Bulla, L.A. (2002) Proteolytic cleavage of the developmentally important cadherin BT-Rj in the midgut epithelium of Manduca sexta. Biochermistry, 41:13 717−13 724.
- Candas, M., Loseva, O., Oppert, B., Kosaraju, P., and Bulla, L.A. Jr. (2003) Insect resistance to Bacillus thuringiensis. Alterations in the indianmeal moth larval gut proteome. Mol. Cell Proteomics, 2(1), 19−28.I