Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Очистка и изучение физико-химических свойств медьсодержащей аминоксидазы из кровеносных сосудов

Диссертация: Очистка и изучение физико-химических свойств медьсодержащей аминоксидазы из кровеносных сосудов
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Абсолютная необходимость этих соединений в процессах роста, дифференциации и специализации клеток стала очевидной в результате работ, выполненных в последнее двадцатилетие, которые установили также, что алифатические дии полиамины в избыточных концентрациях являются токсическими соединениями. Деградация этих полиаминов осуществляется главным образом путем окислительного дезаминирования… Читать ещё >

Содержание

  • ВВВДЕНИЕ
  • ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ
    • I. Биологические пути образования аминов
    • 2. Пути катаболизма аминов
    • 3. Классификация аминоксвдаз
    • 4. Медьсодержащие аминоксидазы из микроорганизмов
    • 5. Медьсодержащие аминоксидазы в растениях
    • 6. Аминоксидазы из почек
    • 7. Медьсодержащие аминоксидазы из других органов животных
    • 8. Медьсодержащие аминоксидазы из крови и других жидкостей организма
    • 9. Лизилоксидаза — специфическая медьсодержащая аминоксидаза
    • 10. Медьсодержащие аминоксидазы из сосудистой ткани
  • ГЛАВА II. МЕТОДЫ ИССЛБЩОВАНИЯ
    • I. Использованные реактивы
    • 2. Аппаратура
    • 3. Биологический материал
    • 4. Определение аминоксидазной активности
    • 5. Определение СОД-активности
    • 6. Определение белка, липидов и углеводов и тиоловых групп
    • 7. Определение металлов
    • 8. Электрофорез, гель-фильтрация, хроматография
  • ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
    • I. Очистка бензиламиноксидазы из аорты
    • 2. Очистка бензиламиноксидазы из капилляров мозга
    • 3. Макромолекулярные свойства БАО из аорты капилляров .*
    • 4. Кинетические характеристики фермента и его ингибирование
    • 5. Оптические и магнитные свойства БАО из сосудов
    • 6. ]^ругие медьсодержащие ферменты сосудистой ткани
    • 7. Аминоксидаза из плаценты
  • ГЛАВА 1. У. 0БСУ1ЩШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
  • ВЫВОда

Очистка и изучение физико-химических свойств медьсодержащей аминоксидазы из кровеносных сосудов (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Медьсодержащие аминоксидазы обнаружены в некоторых животных тканях, а также в растениях и микроорганизмах. В отличие от мо-ноаминоксидаз, являющихся флавиновыми ферментами, медьсодержащие аминоксидазы катализируют главным образом окисление алифатических дии полиаминов.

Абсолютная необходимость этих соединений в процессах роста, дифференциации и специализации клеток стала очевидной в результате работ, выполненных в последнее двадцатилетие, которые установили также, что алифатические дии полиамины в избыточных концентрациях являются токсическими соединениями. Деградация этих полиаминов осуществляется главным образом путем окислительного дезаминирования, катализируемого медьсодержащими аминокси-дазами. Отсюда очевидно, что эти ферменты выполняют функцию защиты клеток и тканей от токсических концентраций дии полиаминов.

В последние годы придается большое значение изучению кровеносных сосудов как биохимически активной системы, ответственной за процессы транспорта веществ через гемато-тканевые барьеры, а также детоксификацию тканей. В связи с этим становится актуальным изучение ферментов, регулирующих уровень поступающих в ткани полиаминов, и в частности, медьсодержащих ферментов сосудистой системы, участвующих в метаболизме полиаминов.

Однако к настоящему времени единственной изученной медьсодержащей аминоксидазой сосудистой системы является лизилоксида-за, физиологическое значение которой состоит в образовании поперечных сшивок в полипептидных цепях структурных белков соединительной ткани: коллагена и эластина. Благодаря этому лизилоксидаза является ферментом, активность которого в значительной мере определяет эластические свойства сосудов.

Имеются указания, что сосуды обладают также полиаминокси-дазной активностью. В 70-ых годах была предпринята попытка очистить этот фермент из аорты, однако полученный препарат обладал низкой активностью и был гетерогенен. Это было практически единственным сообщением о свойствах этого фермента, поскольку в дальнейшем новых данных о нем не было опубликовало. В связи с этим основная задача настоящей работы состояла в разработке метода получения в высокоочищенном состоянии полиаминоксидазы из аорты и других сосудов и изучении ее свойств.

В результате проведенной работы впервые удалось получить высокоочшценные и гомогенные препараты полиаминоксидазы из аорты и капилляров мозга, изучить содержание фермента и его активность в крупных и мелких сосудах, определить физико-химические характеристики фермента, изучить особенности окружения меди в активном центре полиаминоксидазы, выявить ее ингибиторы. Удалось также обнаружить природный белковый ингибитор аминоксидазы. На основании проведенной работы предложен тезис о связи уровня полиаминов с уровнем меди в организме.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод получения в высокоочизценном состоянии медьсодержащей бензиламиноксидазы из аорты и капилляров мозга. Определение содержания фермента в сосудах этих двух типов показало, что капилляры мозга примерно в 15 раз более обогащены этим ферментом по сравнению с аортой. Метод позволяет также получать из сосудов медьсодержащую лизилоксидазу. Установлено, что бензиламиноксидаза сосудов принадлежит к классу «несиних» медьсодержащих оксидаз, катализирующих восстановление кислорода до перекиси водорода.

2. Изучены физико-химические свойства бензиламиноксидазы из сосудов. Показана способность фермента к образованию олигоме-ров, определены молекулярная масса, содержание меди и тиоловых групп, а также каталитическая активность субъединицы фермента. Изучены влияние температуры и рН на активность фермента, стационарная кинетика ферментативной реакции. Установлено ингибирова-ние фермента высокими концентрациями субстрата. Изучены оптические и люминесцентные свойства бензиламиноксидазы из сосудов. Показано, что спектр поглощения фермента значительно отличается от спектров большинства белков и отражает низкое содержание ароматических аминокислот в ферменте.

3. Установлено, что фермент ингибируется не только высокими концентрациями субстрата, но также продуктами реакции — бен-зальдегидом, а также тиоловыми реагентами и восстановителями. Ингибиторами фермента являются также хелаторы меди и анионы с высоким сродством к меди. Помимо бензиламина, медьсодержащая аминоксидаза из аорты и капилляров способна эффективно окислять также полиамины: спермин и спермидин, которые могут рассматри.

— 123 ваться как физиологические субстраты этого фермента.

4. Методом ЭПР изучены магнитные свойства фермента. Обнаружены изменения в окружении меди, входящей в состав активного центра фермента под влиянием рН, ингибиторов и субстратов. Показано, что эти изменения в окружении коррелируют с изменением активности. Необратимые изменения в окружении меди сопровождаются также необратимыми изменениями в активности. Обнаружен новый парамагнитный центр в ферменте, возникающий под влиянием субстрата и ингибитора (j^-аминопропионитрил), принадлежащий органической группе фермента, либо супероксидному радикалу.

5. Из плаценты выделена медьи марганецсодержащая аминоксидаза, способная окислять гистамин и кадаверин и неактивная в отношении бензиламина. Изучены физико-химические свойства этого фермента (молекулярная масса, субъединичный состав, оптические и магнитный свойства) и показаны различия в свойствах этого фермента и аминоксидазы из сосудов.

6. Результаты изучения медьсодержащих аминоксидаз сосудов, способных окислять дии полиамины, позволили предложить тезис о регулирующей роли уровня меди в организме на содержание алифатических дии полиаминов в тканях.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Methods in Enzymology (eds Tabor H., Tabor C.W.) Acad. Press, New-York, I983, v.94,-544p.
  2. Cohen S.S. Introduction to the polyamines. Inc. Englewood Cliffs, New Jersey, Prentice Hall, 1971,-179p.
  3. Janne J., Poso H., Raina A. Polyamines in rapid growth and cancer. Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.473,N¾, p.241−293.
  4. Bachrach U. Function of naturally occurring polyamines. Acad. Press, New York, 1973,-21lp.
  5. Seiler N., Kn6dgen B. Die Umwandlung von Glutaminsaure, Putrescin una Ornitin in die^-Aminobuttersaure in Gehirn. iioppe-Scylers.-Z.Physiol.Chem., 1971, v.352,Ni, p.97−105.
  6. Oxygen radicals in chemistry and biology (eds.Bors W., Saran M., Tait D.) Walter de Gruyter & Co. Berlin-New-York, 1984,-?34p.
  7. Dykstra W.G., Herbst E.J.Spermidine in regenerating liveriregula-tion to rapid synthesis of ribonucleic acid.-Science, 1965, v.149, N3682, p.428−429.
  8. Russel D.H., Durie B.G.M. Polyamines as biochemical markers of normal and malignant growth. Raven Press, New-York, 1978,-178p.
  9. Bachrach U., Don S., Wiener H. Polyamines. Tumor cells.Effect of- 125 transfomation of chick embryo fibroblasts by Rous sarcoma virus on polyamine levels.-Biochem.Biophys.Res.Commun., 1973, v.55″ N3, p. Ю35-Ю43.
  10. C.W., Tabor H. 1,4-Diaminobutane (putrescine), spermidine and spermine. In: Annu.Rev.Biochem. (eds.Snell E.E., Boyer P.D., Meister A., Richardson Ch.C.) 1976, v.45,p.285−306.
  11. Ham R.G.Putrescine and related amines as growth factors for a mammalian cell line.-Biochem.Biophys.Res.Commun., 1964, v. 14, Hi, p.44−48.
  12. Robinson R. The structural relations of natural products. Oxford Univ.Press, London, 1955,-12Sp.17*Bowman M.B., Levas M.S. The copper hypothesis of schizophrenia. A review.-Heuroscience and Biobehavioural Reviews, 1982, v.6., H3, p.321−328.
  13. Hare M.L.C. Tyramine oxidase I. A new enzyme in liver.-Biochem. J., 1928, v.22,N5,p.968−979.
  14. Best C.H. The disappearance of histamine from autolysing lung tissue.-J.Physiol., 1929, v.67,N2,p.256−263.
  15. Blascnko H., Friedman P.J., Hawes R., Nilsson К. The amine oxidase of mammalian plasma.-J.Physiol., 1959, v.145,N3,p.384−404.
  16. Akopyan Z.I., Stesina L.N., Gorkin V.Z. Hew properties of highly purified bovine liver mitochondrial monoamine oxidase.-J.Biol. Chem., 1971, v.246,N14,p.4610−4618.
  17. Stessina L.N., Akopyan Zh.I., Gorkin V. Z. Modification of catalytic properties of amine oxidases.-FEBS-Lett., 1971, v.16,N4,p.349−351.
  18. Горкин B.3., Акопян Ж. И., Веревкина И. В., Гриднева Л. И., Стеси-на Л.И. О дезамннировании некоторых биогенных аминов и других азотистых соединений митохондриями печени. Биохимия, 1970, т.35, № I, с.140−151.
  19. Bieganski Т., Kusche J., Lorenz W., Hesterberg R., Stahlknecht C.-D., J? eussner K.D. Distribution and properties of human intestinal diamine oxidase and its relevance for histamine catabolism.
  20. Biochim.Biophys.Acta, 1983, v.756,N2,p.196−203.
  21. Vogel W.H., Gentile N.T., Ivlenduke H., Boehme D.H. Inter-and intra-individual differences in monoamine oxidase A and В activities in human central and peripheral tissues.- Biochem. Medicine, 1983, v.29,p.392−397.- 127
  22. Gomes B., Igane I., Kloepfer H.G., Yasunobu K.T. Amine oxidase.XIV. Isolation and characterization of the multiple beef liver amine oxidase components.-Arcn.Biocliem.BiopJays., 1969, v. 132, N1,p. 1627.
  23. Hc51tta E. Oxidation of spermidine and spermine in rat liver: pu-rification and properties of polyamine oxidase.-Biochemistry, I977, v.16,N1,p.91−100.
  24. Van Dijken J.P., Bos P. Utilization of amine by yeasts.-Arch. Microbiol., 1981, v. 128,1*4,p.320−324.
  25. Ю.В. Патогенные ферменты бактерий. М. Медицина, 1968,115 с.
  26. Kximagai Н., Kishimoto N., Yamada Ы. Subunit structure of amine oxidase from Aspergillus niger.-Agric.Biol.Chem., 1978, v"42,2T4, p.693−894.
  27. Haywood G.W., Large P.J. Microbial oxidation of amines. Distribution, purification and properties of two primary-amine oxidase from yeast Candida boidinii grown on amines as a sole nitrogen source.-Biochem.J., 1981, v.199,N1,p.187−201•
  28. Srivastava S.K., Prakash V. Purification and properties of pea cotyledons and embryo diamine oxidase.-Phytochemistry, 1977, v. 16, N1,p.189−190.
  29. Mondovi B., Rotilio G. jPinazzi-Agro' A., Antonini E. Amine oxi-dases:a new class of copper oxidases. In: Magnetic resonanes in biological research (ed.Franconi C.) Gordon & Breach Sci.Publ. New-York, 1971, p.233−246.- 129
  30. Kleutz M.D., Schmidt P.G. Proton relaxation study of the hog kidney diamine oxidase active center.-Biochemistry, 1977, v.16, N24, p.5191−3196.
  31. Goryachenkova E.V., Ershova E.A. In: Chemical and biological aspects of pyridoxal catalysis (eds.Snell E.E., i*asella P.M., Braun-stein A., Rossi-Fanelli A.) Pergamon Press, Oxford, 1963, p.44?•
  32. Kappler-Adler R., Mac i? arlane H. Purification and identification of hog kidney nistaminase.-Biochim.Biopnys.Acta, 1963, v.67,N4, p.542−565.
  33. Bieganski T., Kurcne J., Lorentz W., Hesterberg R, Stanlknecht C-D. i? eusner K.-D. Distribution and properties of human intestinal- 130 diamine oxidase and its relevance for tlie histamine catabolism. Biochim.Biophys.Acta, 1983, v.756,N2,p.196−203.
  34. Bunce K.T., Parsous M.E. Investigation of the role of histamine H^ receptors in the control of gastric acid secretion.-J.Pnarm.
  35. Pharmacol., 1978, v.30,p.247−249.
  36. Kusche J., Lorenz W., Stahlkne’cht C-D., Richter H., Hesterberg R., Schmal A., Hinterland E., Weber D., 0nman C. Intestinal diamine oxidase and histamine release in rabbit mesenteric ischemia.-Gastroenterology, 1981, v.80,N6,p.980−987″
  37. Wollin A., Havert H. Release of intestinal diamine oxidase by histamine in rats.-Can.J.Physiol.Pharmacol., 1983, v.61,N4,p.349−355
  38. Cuffroy Ch., Fowler Ch.J., Benedetti M.S. The aeamination of n-pentylamine by monoamine oxidase and a semicarbazide-sensitive amine oxidase of rat heart.-J.Pharm.Pharmacol., 1983, v.35,p.416−420.
  39. Bhansali E.G., Hayes B.E., Clarice D.E. Benzylamine oxidase in rabbit lung.-Fed.Proc., 1982, v.41,N4,p.1056.
  40. С.Г., Налбандян P.M. Растворимые металлопротеины мозга. У. Медьсодержащие белки из белого вещества головного мозга. Нейрохимия, 1983, т.2, В 4, с.389−397.
  41. Carper W.R., Stoddard B.'D., Martin D.F. Pig liver monoamine oxidase I. Isolation and characterization.-Biochim.Biophys.Acta, 1974, v. 334,113, p. 287−296.
  42. Salach J.I. Monoamine oxidase from beef liver mitochondria: simplified isolation procedure, properties and determination of the cysteinyl flavin content.-Arch.Biochem.Biophys., 1979, v#192, N1, p.128−137.
  43. Hirsh J.G. Spermine oxidase: an amine oxidase with specificity for spermine and spermidine.-J.Exp.Med., 1953, v.97,N2,p.345−355″
  44. Buffoni F., Banchelli G., Ignesti G., Pirisino R., Raimondi L. The presence of an inhibitor of benzylamine oxidase in human blood plasma.-Biochem.J., 1983, v.211,N3,p.767−769.
  45. Becker R.E. Endogeneous inhibitor of MAO present in human cerebrospinal fluid.-Science, 1983, v.221,N4609,p.476−477″
  46. Murphy D.L., Weiss R. Reduced monoamine oxidase activity inblood platelets from bipolar depressed patients.-Amer.J.Psych., 1972, v.128,Nl, p.35- 133
  47. H61tta E., Pulkkinen P., Efving K., J? nne J. Oxidation of polyami-nes by diamine oxidase from human seminal plasma.-Biochem.J., 1975, v.145,N2,p.373−378.
  48. Siegel R.C., Page R.C., Martin G.R. The relative activity of connective tissue lysyl oxidase and plasma amine oxidase on collagen and elastin substrates.-Biochim.Biophys.Acta, 1970, v.222,N2, p.552−555.
  49. Rucker R.B., 0'Dell B.L. Connective tissue amine oxidase.I.Purification of bovine aorta amine oxidase and its comparison with plasma amine oxidase.-Biochim.Biopnys.Acta, 1971, v.235,Ш, p.32−43.
  50. Harris E.D., Blout J.E., Leach R.M. Localization of lysyl oxidase in hen oviduct.-Science, 1980, v.208,p.55−56.
  51. Harris E.D., Gonnerman W.A., Savage J. E^O'Dell B.L. Connective tissue amine oxidase.II.Purification and partial characterization of lysyl oxidase from chick aorta.-Biochim.Biophys.Acta, 1974, v.341,N2,p.332−344.
  52. Kagan H.M., Hewitt N.A., Salcedo L.L., Franzblau C. Catalytic activity of aortic lysyl oxidase in an insoluble enzyme-substrate complex.-Biochim.Biophys.Acta, 1974, v.365,N1,p. 223−234.
  53. Siegel R.C., Fu J.C.C. Collagen cross-linking.Purification and substrate specificity of lysyl oxidaseJ.Biol.Chem., 1976, v.251, N18, p.5779−5785.
  54. Harris E.D., 0'Dell B.L. Copper and amine oxidases in connective tissue metabolism.-Adv.Exp.Biol.Med., 1974, v.48,p.267−284.- 135 109.0*Dell В.L.Roles of iron and copper in connective tissue biosynthesis.- Phil.Trans.R.Soc.bond., 1981, B, 294, p.91−104.
  55. Benditt E.P. The origin of atherosclerosis.-Sci.Amer., 1977, v. 236, p.74−84.
  56. Benditt E.P., Govm A.M. Atheroma: the artery wall and the environment. -Int.Rev.Exp.Pathol., 1980, v.21,p.55−118.
  57. Dobbing J., Hawkins R.A. The blood-brain barrier.-The Lancet, 1981, v. II, N8246, p.584.
  58. Mans A.M., Biebnyck J.P., Shelly K., Hawkins R.A. Regional blood-brain barrier permeability to amino acids after portacaval anastomosis.-J.Neurochem., 1982, v.38,N3,p.705−717.
  59. Lewinsohn R. Amine oxidase in human blood vessels and nonvascular smooth muscles.-J.Pharm.Pharmacol., 1981, v33,N8,p.569−575*
  60. Hayes B.E., 0strow P.Т., Clarke D.E. Benzylamine oxidase in normal and atherosclerotic human aortae.-Exp.Mol.Pathol., 1983, v. 38, N3,p.243−254.
  61. Brendell K., Meezan E., Carlson E.C. Isolated brain microvessels: — 136 a purified, metabоlieally active preparation from bovine cerebral cortex.-Science, 1974, v.185,N4155,p.953−955*
  62. Jarrott B., Hjelle J.T., Spector S. Assosiation of histamine with cerebral microvessels in regions of bovine brain.-Brain Res., 1979, v.168,Hi, p.323−330.
  63. Tabor C.W., Tabor H., Rosenthal S.Ivl. Purification of amine oxidase from beef plasma.-J.Biol.Chem., 1954, v.208,N1,p.645−660.
  64. Nishikimi M#, Rao N., Yagi K. The occurence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine inethasulfate and molecular oxyde.-Biochem.Biophys.Res.Commun., 1972, v.46,N2,p.849−854.
  65. Lowry 0., Rosebrough N., J? arr A., Randall R. Protein measurment with the Folin phenol reagent.-J.Biol.Chem., 1951, v.193,N1,p. 265−275"125"Piske C.H., Subbarow J. The colorimetric determination of phosphorus.-J.Biol.Chem., 1925, v. 66, N2,p.375″
  66. Levine C., Chargaff E. Procedures for the microestimation of nitrogenous phosphatide constitutients.-J.Biol.Chem., 1951, v. 192, N2,p.465−479″
  67. M. Техника липидологии. M. Мир, 1975, — с. 81.
  68. Zacharius R., Zell Т. Glycoprotein staining following electrophoresis on acrylamiae gels.-Anal.Biochem., 1969, v.30,N1,p.148−152.
  69. Sedlak J., Lindsay II. Estimation of total, protein-bound and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent.-Anal.Biocnem., 1968, v.25,N1,p.192−205.
  70. Matsuba Y., Takahashi Y. Spectrophotometry determination of copper with N, N, N^N-tetraethylthiuram disulfide and application of this method for studies on subcellular distribution of copper in rat brain.-Anal.Biochem., 1970, v.36,N1,p.182−192.
  71. Cameron B.F. Determination of iron in heme compounds.II.Hemo- 137 globin and myoglobin.-Anal.Biochem., 1965, N2,p.164−169.
  72. Davis B. Disc electrophoresis.II.Method and application to human serum proteins.-Ann.N.Y.Acaa.Sci., 1964, v.121,p.404−427.
  73. Weber K., 0sborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. -J.Biol.Chem., 1969, v.244,N16,p.4460−4412.
  74. Yamada H., Kumagai H., Kawasaki H., Marsui H., Ogata K. Crystallization and properties of diamine oxidase from pig kidney.-Biochem.Biophys.Re s.Commun., 19 67, v.29,N5,p.723−729.- 138
  75. Losty Т.S., О'Dell B.L. Evidence for lysyl oxidase substrate specificity.-Fed. Pro с «Fed.Am.Soc.Exp.Biol., 1980, v.39,N5,P» 974−978.
  76. М.Г., Налбандян P.M. Оптические, магнитные свойстваазурина из PseaoWn^ й^.гБиохимия, 1977, т.42, J 2, с.223−229.
  77. Kamin К. Flavins and flavoproteins. Univ.Park.Press, Baltimore, 1970,-560p.
  78. Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М., Наука, 1981, — 168 с.
  79. Friedman J., Cerutti P. The induction of ornitine decarboxylase by piaorbol 12-myristate-13-acetate or by serum in inhibited by antioxidants.-Carcinogenesis, 1983, v.4,Hll, p.1425−1428.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?