Физико-химические свойства биологически значимых термочувствительных полимеров

Актуальность проблемы.

Термочувствительные полимеры были открыты в начале 60-х годов прошлого века. Их отличает наличие нижней критической температуры растворения (НКТР). Для концентрированных и полуразбавленных растворов полимеров это проявляется в выпадении полимера в осадок при повышении температуры. В разбавленных растворах при повышении температуры наблюдается переход клубок-глобула на уровне отдельных полимерных цепей. В полимерных сетках НКТР проявляется как переход из набухшего в коллапсированное состояние сетки. Наличие НКТР наблюдается для сравнительно небольшого количества известных полимеров и, почти исключительно, в водных растворах.

В 1990;х годах интерес к данному классу полимеров значительно возрос. В основном это было связано с пониманием, что данные полимеры могут служить как модели для известных биофизических систем или как технологическая платформа для биофизических и биомедицинских приложении. Наиболее популярный полимер данного класса — поли-(К-изопропилакриламид) (ПНИПАА). Он обладает температурой перехода около 32 °C, которая близка к физиологической. Кроме того, температура перехода может быть изменена в любых пределах путём сополимеризации мономера изопропилакриламида с другими мономерами. Для сополимеров, включающих в себя мономеры с ионизируемыми группами, температура перехода становится чувствительной к значительно большему количеству внешних стимулов, таких как рН, ионная сила, специфические катионы и анионы. Последующая пришивка к полимеру или гелю ферментов, катализирующих реакции с выделением или поглощением протона, позволяет расширить количество веществ, влияющих на температуру перехода.

Среди многочисленных исследований термочувствительных полимеров как модельных биофизических систем и для биомедицинских приложений в данной работе обсуждаются три основных направления.

Одно из них — исследование перехода клубок-глобула в разбавленных полимерных растворах как модель конформационных переходов в белках. Существует определённая аналогия между переходом клубок-глобула в ПНИПАА и холодовой денатурацией в белках. В обоих случаях при повышении температуры происходит переход молекулы в компактное состояние. Преимущества исследования модельной системы в данном случае заключается в том, что удается исследовать общие закономерности сворачивания клубка в компактную структуру и сравнивать их с теоретическими моделями, которые пока достаточно примитивны для применения к реальным белкам.

Два других направления имеют прикладное биомедицинское значение. Конформационные переходы в термочувствительных полимерах могут быть использованы для контролируемой локальной доставки лекарств, основанной на том, что в полимерных микрочастицах и пленках вблизи температуры перехода диффузия инкорпорированного вещества сильно зависит от параметров среды, например, температуры. Кроме того, термочувствительные полимеры могут использоваться как активные биосовместимые поверхности при изготовлении культуральных сред и при изготовлении различных имплантируемых устройств.

В связи с вышесказанным изучение биологически значимых физико-химических свойств (включая поверхностные) термочувствительных полимеров является важным фундаментальным направлением биофизики.

Цели и задачи работы.

Цель — изучение конформационных переходов в термочувствительных полимерах как модельных системах для фундаментальных исследований в биофизике и для различных биомедицинских приложений. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести исследование конформационных переходов термочувствительных полимеров в растворах и их применимость как моделей конформационных переходов в биополимерах.

2. Исследовать конформационные переходы термочувствительных полимеров, пришитых к поверхности, и обосновать возможность их применения для контролируемой доставки лекарств.

3. Определить поверхностные свойства термочувствительных полимеров, имеющие отношение к их биосовместимости.

Научная новизна.

Впервые прояснены особенности механизма перехода клубок-глобула в разбавленных растворах поли-(К-изопропилакриламида), приводящие к образованию «мезоглобул». Впервые разработан и синтезирован полимер случайно-блочной структуры, который способен переходить из клубка в глобулу без агрегации. Разработан и синтезирован новый класс фото-сшиваемых термочувствительных полимеров, которые могут быть нанесены на поверхность различных имплантируемых устройств и нагружены физиологически активными веществами. Исследована контролируемая доставка лекарств из данных полимеров. Впервые определены поверхностные энергии в серии термочувствительных полимеров разного состава. Впервые объяснены аномалии, возникающие при измерении краевых углов воды на поверхности термочувствительного полимера.

Практическая ценность.

Результаты работы могут применяться для разработки новых биомедицинских устройств на основе термочувствительных полимеров. В частности, полимеры, исследованные в настоящей работе, находят применение в разработке субстратов для безферментативного снятия тканевых культур с поверхности. Исследованные свойства этих полимеров могут быть использованы для оптимизации этих субстратов. Фотосшиваемые полимеры могут применяться для доставки лекарственных средств с поверхности имплантируемых биомедицинских устройств. Способность полимеров, исследованных в данной работе, испытывать переход клубок глобула без агрегации может применяться для экспериментальной проверки теорий сворачивания белков.

Апробация.

По теме диссертации опубликовано 11 статей в рецензируемых журналах.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Обзор литературы разбит на три части. В первой части обсуждается важность переходов клубок-глобула в синтетических полимерах как упрощённых моделей сворачивания белков. Во второй части кратко рассмотрены проблемы применения термочувствительных полимеров для контролированной доставки лекарств. Более подробно рассмотрена проблема доставки лекарств с поверхностей, модифицированных термочувствительными полимерами. Также обсуждается литература, посвящённая фазовым переходам в тонких плёнках термочувствительных полимеров. Третья часть посвящена обзору работ, в которых определялись поверхностные свойства термочувствительных полимеров.

1.1. Конформационные переходы в термочувствительных полимерах, как упрощённая модель сворачивания белков.

Глубокая связь между конформационными переходами в синтетических полимерах и биополимерах впервые была отмечена в теоретических работах. Птицин и Лифшиц впервые отметили, что проблема перехода клубок-глобула в макромолекулах может быть информативной моделью для понимания переходов в белках (Ptitsyn et al. 1968, Лифшиц 1968, Lifshitz et al. 1978). Птицын и сотрудники разработали обобщённый подход к теории переходов клубок-глобула типа Флори (Flory, 1953). В их работах было показано, что переход клубок-глобула в гомополимерах может быть как первого, так и второго рода. Этот вывод подвергался критике в литературе (Nishio et al. 1979), поскольку исходная теория Флори предполагает переход только первого рода для гомополимеров. Лифшиц также показал, что переход клубок-глобула может быть первого рода. При этом он использовал теорию самосогласованного поля для расчета плотности внутри глобулы. Развивая идеи Лифшица, Гросберг и Кузнецов показали, что порядок перехода зависит от параметра жёсткости полимерной цепи (Grosberg & Kuznetsov 1992а, Grosberg & Kuznetsov 1992b). Для жёстких цепей переход клубок-глобула является переходом первого рода.

Для гетерополимеров теории типа Флори показывают переход первого рода, за счет того, что мономеры разной природы могут перераспределяться внутри глобулы (Dill & Stigter, 1995, Ganazzoli 1998, Ganazzoli 2000). Надо заметить, что в настоящее время теоретическое рассмотрение перехода клубок-глобула для гетерополимеров в основном ограничено полимерами с двумя типами мономеров. Современное состояние теории пока не позволяет рассматривать переходы в полимерах с 20 различными типами мономеров, что позволило бы сравнить переход клубок-глобула со сворачиванием белков. Необходимы упрощенные экспериментальные модели, которые позволили бы провести сравнения теории с экспериментом (Chan&Dill 1993).

Популярность использования ПНИПАА для изучения конформационных переходов полимеров объясняется тем, что ПНИПАА близок по химической природе к полипептидам (Graziano 2000). ПНИПАА является изомером полилейцина. ПНИПАА имеет амфифильную природу и переход клубок-глобула происходит в водных растворах. Кубота и др. исследовали размер молекулы ПНИПАА как функцию температуры методами динамического и статического рассеяния света (Kubota et al. 1990). В работе использовались фракционированные образцы полимера. В частности, использовался полимер с молекулярной массой 25*10б при концентрации 10 цг/мл. В этой работе удалось достичь сокращения радиуса инерции клубка до 50%, до того как агрегация становилась заметной. При измерении гидродинамического радиуса была получена гораздо меньшая степень сокращения клубка до начала агрегации. Авторы так лее измеряли размер глобул в области, которую они назвали метастабильной. В этой работе была так же определена температура, при которой отталкивание между мономерами сменяется притяжением (0-температура), составляющая 30.59°С для ПНИПАА.

By и сотрудники описали «кинетически стабильное» глобулярное состояние ПНИПАА (Wu & Zhou 1995). Молекулярная масса полимера в этой работе была 10*106 с концентрацией 5 jir/мл. Позже та же группа заявила, что при дальнейшем уменьшении концентрации было получено термодинамически стабильное глобулярное состояние. По поведению отношения Rh/Rg в этих работах было сделано заключение, что переход клубок-глобула происходит через состояние «расплавленной» глобулы.

Можно заключить, что экспериментальное наблюдение перехода клубок-глобула в одиночной полимерной цепи является чрезвычайно трудной задачей. Причина этих трудностей была рассмотрена теоретически путём сопоставления области перехода одиночной цепи с фазовой диаграммой растворов полимеров в области низких концентраций. При этом учитывалась кинетика столкновения полимерных цепей.

По-видимому, единственным примером системы, в которой был получен переход клубок-глобула в одиночной цепи без агрегации, является переход клубок-глобула ПНИПАА в присутствии додецилсульфата натрия (Meewes at al 1991,. Binkert at al. 1991). Додецилсульфат натрия стабилизирует глобулярное состояние полимера, по-видимому, за счёт электростатического отталкивания. Для полимера с молекулярным весом 7*106 при переходе клубок-глобула гидродинамический радиус падает со 101 до 20 нм. Стабилизация глобулы детергентом была использована для прояснения термодинамики перехода клубок-глобула (Tiktopulo at al. 1994, Tiktopulo at al. 1995). Путем сравнения энтальпии полученной из калориметрических измерений с энтальпией Вант Гоффа было показано, что переход клубокглобула является переходом первого рода для доменов внутри цепи. Размер домена составляет около ста мономеров.

В последнее время появились работы, в которых экспериментально исследовалась кинетика перехода клубок-глобула в гомополимерах (Ye et al. 2007). Было показано, что ПНИПАА является удобным объектом для исследований кинетики переходов синтетических полимеров, поскольку доступны методы позволяющие увеличить температуру на несколько градусов в течение нескольких микросекунд. Это открывает возможности исследования зависимости кинетики перехода клубок-глобула от ряда переменных таких, как молекулярная масса и структура полимера. Такие исследования могут дать более глубокое понимание начальных стадий сворачивания белков. Можно заключить, что термочувствительные полимеры являются важными модельными объектами для исследований конформационных переходов в биополимерах.

Выводы.

1. Изучены особенности перехода клубок-глобула термочувствительного гомополимера поли-(Ы-изопропилакриЛамида), имеющего значение для моделирования переходов клубок-глобула в биологических макромолекулах. При переходе клубок-глобула несколько полимерных цепей могут агрегировать и коллапсировать совместно с образованием «мезоглобул», размер которых может быть много меньше размера исходного клубка, но больше размера индивидуальной коллапсированной молекулы полимера.

2. Было показано, что переход клубок-глобула может происходить без агрегации, если полимер имеет блочную структуру. Для этого был разработан случайно-блочный термочувствительный сополимер поли-(Ъ1-изопропилакриламид-со-акриламидоундекановая кислота) с включением блоков амфифильного мономера в полимерную цепь. В нем переход из состояния клубка в состояние глобулы происходит в отдельной молекуле, поэтому такой сополимер является более реалистичным объектом для моделирования переходов клубок-глобула в биополимерах.

3. Было показано, что конформационные переходы в термочувствительных полимерах могут быть основой для контролируемой локальной доставки лекарств. Для этой цели был разработан термочувствительный фото-сшиваемый полимер поли-(ТЧ-изопропилакриламид-со->Т-трет-бутилакриламид-со-акриламидобензофенон), который может применяться в качестве покрытия на различных имплантируемых биомедицинских устройствах. Было установлено, что коэффициент диффузии колхицина в плёнке полимера изменяется на два порядка величины в районе перехода, что позволяет управлять выходом лекарств внешними стимулами.

4. Определены поверхностные энергии в серии термочувствительных сополимеров N-изопропилакриламида и N-mpem-бутилакриламида, применяемых для контролируемой доставки лекарств и в качестве субстратов для роста клеточных культур. Поверхностная энергия уменьшалась с 38.8 до 31.0 мДж/м с увеличением содержания более гидрофобного мономера. Термочувствительные полимеры этой серии являются довольно неполярными, тем не менее, они способны поддерживать рост клеточных культур.

5. Предложен механизм возникновения аномального режима «прилипания-соскальзывания» при измерениях краевого угла воды на поверхности термочувствительных полимеров. Появление такого режима связано с наличием гребня на поверхности полимеров по линии раздела трех фаз. Гребень возникает в результате повышения пластичности полимера связаного с проникновением воды в полимерную плёнку. Предложен методический подход для получения краевых углов воды на поверхности биоматериалов в условиях появления аномального режима.