Исследование низкотемпературной динамики белков методом выжигания провалов

Одной из основных задач исследования белка является выявление связи между структурой, энергетическим ландшафтом, динамикой и его биологической функцией".

Г.Фрауенфельдер

В последние десятилетия интерес к биологическим объектам возрос не только в связи с развитием и потребностями медицины и биотехнологии, но и потому, что эти объекты обладают уникальными физическими и химическими свойствами. Физическая структура белков отличается от структуры классических объектов исследования физики конденсированных сред: кристаллов, жидкостей, стекол, и потому представляет специальный интерес для физических исследований.

Белки представляют собой биополимерные цепочки, состоящие из ограниченного набора аминокислот, последовательность которых задает первичную структуру белка. Число аминокислот в белках может насчитывать более сотни, а характерный размер и вес белков может варьировать в широких пределах. Одной из главных особенностей белков является компактная трехмерная структура, приобретаемая в процессе &bdquo-схлопывания" биополимерной цепочки. Расположение атомов в такой структуре характеризуется упорядоченностью, которая может быть классифицирована как вторичная, третичная и четвертичная структура [1]. Одним из наглядных примеров вторичной структуры является спиралевидная форма белковой молекулы. Трехмерная атомная структура многих белков хорошо известна. Однако в масштабе меньше 0.2 А структура белка характеризуется беспорядком [2,3]. Упорядоченная структура белков ответственна за их биологическую функциональность, тем не менее, наличие беспорядка также имеет огромное значение и играет важную роль, к примеру, в процессе сворачивания биополимерной цепочки [4]. Именно такая специфичность: наличие порядка и беспорядка в белках выделяет их как отдельные объекты исследования, свойства которых лежат между кристаллическим и аморфным состоянием.

Изучение структуры биологических кристаллов выявило ряд особенностей, отличающих их от «обычных» кристаллов. Так, среднеквадратичное отклонение от равновесного положения <х2>, усредненное по одному и тому же классу атомов для разных аминокислот, сильно отличается [2,3]. С понижением температуры амплитуда колебаний <х2> уменьшается, однако даже при гелиевых температурах <х2> значительно больше величины, соответствующей квантовомеханическим колебаниям решетки. В пионерских работах по рентгеноструктурному анализу белковых кристаллов было высказано предположение, что при низких температурах среднеквадратичное отклонение <х2> определяется неупорядоченностью, вызванной существованием различных конформационных состояний белка [2,3]. Концепция конформационных состояний в белке также подтвердилась в кинетических исследованиях методом фотолиза [5]. Различные конформационные состояния отличаются друг от друга небольшой реорганизацией структуры белка за счет изменения взаимного расположения атомов. В каждом из таких состояний I белок способен выполнять биологическую функцию, скорость которой может варьировать. Конформационные состояния в белках образуют иерархическую структуру. Состояния, имеющие значительные структурные отличия, относят к уровню низкого (нулевого) порядка. К примеру, в СО — миоглобине такие состояния связаны с положением связи СО по отношению к плоскости гем — группы белка [6]. Число таких конформационных состояний невелико, конформеры разделены высокими энергетическими барьерами. Уровни высокого порядка характеризуются большим набором конформационных состояний, которые разделены более мелкими энергетическими барьерами [7]. На многомерной потенциальной поверхности (энергетический ландшафт) конформационные состояния белка образуют энергетические минимумы. Белок неотделимо связан с окружением, в котором он находится, поэтому энергетический ландшафт зависит не только от положения атомов в самом белке, но в него дает вклад и гидратационный слой, образованный за счет взаимодействия аминокислот белка с молекулами растворителя. Классификация конформационных состояний является важным шагом в понимании структуры энергетического ландшафта белка.

При физиологических температурах переходы между конформационными состояниями необходимы для протекания биологических процессов. По температурной зависимости среднеквадратичного отклонения <х2> можно анализировать конформационные движения в белке на временной шкале эксперимента. Методами мессбауэровской спектроскопии и нейтронного рассеяния был обнаружен динамический переход между гармоническим и л ангармоническим поведением <х > колебаний атомов белка [8,9]. Резкое возрастание <х > в области температуры Т"200 К связано с конформационным движением боковых групп в биополимерной цепочке и подвижностью молекул воды в гидратационном слое белковой молекулы. В исследованиях кинетических процессов в белках спектроскопическими методами при физиологических температурах была обнаружена широкая дисперсия скоростей релаксаций, характерная для стеклообразного состояния [10]. В ходе исследования фотоиндуцированных релаксационных процессов и релаксационных процессов, вызванных воздействием давления, в белках была обнаружена неэкспоненциальная временная зависимость конформационной динамики [11,12]. Детальные исследования релаксационных процессов в белках выявили также влияние свойств растворителя на динамику белка [13,14].

Понижение температуры приводит к замедлению релаксационных процессов в белках и &bdquo-замораживанию" конформационной динамики. Такое &bdquo-замораживание" релаксационных процессов служит весьма эффективным средством исследования сложных систем, каковыми являются белки, и широко используется в их изучении. Температурная зависимость релаксационных процессов в замороженных белках может быть, аналогично температурах белки также проявляют аномальные свойства, аналогичные свойствам стекол. Например, в кристалле миоглобина была обнаружена линейная зависимость теплоемкости от температуры [15]. В оптических спектрах белков было обнаружено явление спектральной диффузии, которое является также и одним из характерных свойств низкотемпературных примесных стекол.

Спектральная диффузия (СД) — это проявление в оптических спектрах примесей (хромофоров) процессов структурных релаксаций, идущих в стеклообразных матрицах. Эффективные исследования СД, а с нею и низкотемпературных релаксаций в стеклах, полимерах, а также и в биологических объектах, стали возможны в результате появления методов селективной спектроскопии, в первую очередь метода выжигания провалов [16−21]. Метод выжигания провалов в неоднородно уширенных спектрах поглощения хромофоров получил широкое распространение и интенсивно используется, в частности, для изучения явления спектральной диффузии в неупорядоченных и частично упорядоченных примесных молекулярных системах [22,23]. Он весьма эффективен при изучении медленных релаксационных процессов во временной шкале, покрывающей интервал от секунд до нескольких дней или недель.

СД, как и другие аномальные низкотемпературные свойства стекол, весьма успешно описывается моделью двухуровневых систем (ДУС) [24 — 26]. Но это описание, несмотря на его успешность, не является вполне стеклам, описана функцией.

11]. При криогенных удовлетворительным по ряду причин. Во-первых, оно — чисто феноменологическое и ничего не говорит о микроскопической природе ДУС. Во-вторых, оно пригодно только для описания неупорядоченных систем при низких температурах (как правило, ниже 4 К). В этой связи интерес к созданию более общих теорий, описывающих поведение неупорядоченных систем в более широком диапазоне температур и учитывающих их микроскопическую структуру, сохраняется и реализуется время от времени в создании моделей, альтернативных модели ДУС. Одним из факторов, усложняющих создание теоретических моделей аморфных систем, является универсальность поведения стекол при низких температурах. Упрощая, можно сказать, что органические и неорганические стекла и полимеры при совершенно разной химической и даже физической структурах демонстрируют существенно схожие свойства, сильно отличающиеся от свойств кристаллов, как органических, так и неорганических.

В этом отношении белки являются интересным объектом, как бы находящимся между стеклами и кристаллами. С одной стороны, белок имеет хорошо определенную структуру, с другой стороны, в нем проявляются динамические свойства неупорядоченных систем. Наличие порядка в белках делает их отличными от низкотемпературных стекол. I.

Можно ожидать, что исследование низкотемпературных релаксаций в белках, их сравнительный анализ по отношению к стеклам могут помочь понять связь между микроскопической структурой объекта и его низкотемпературными свойствами, как для белков, так и для стекол. Весьма важным свойством белков является также влияние растворителя на их низкотемпературную динамику [27−29]. Исследование этого влияния может помочь в понимании микроскопических механизмов низкотемпературных релаксаций в белках, находящихся во взаимодействии с матрицей. В этой связи была поставлена первая задача диссертации, а именно: исследование влияния матрицы на спектральную диффузию в белках при низких температурах и анализ данных в рамках известных моделей.

В настоящее время существует несколько альтернативных моделей СД. Их экспериментально проверяемые предсказания во многом совпадают, что затрудняет сравнение этих моделей. Одним из экспериментально проверяемых предсказаний является «форма диффузионного ядра», которая отличается в разных моделях. Исследование формы спектральных провалов может дать важную информацию как о механизмах взаимодействия хромофора с белком и растворителем, так и помочь в выборе адекватной модели. В этой связи была поставлена вторая задача диссертационной работы — исследование формы провала, уширенного за счет спектральной диффузии.

Очень важную информацию о структуре и конформационных превращениях в белке можно получить из исследований его энергетического ландшафта. Низкотемпературные данные, дающие наиболее важную информацию об этой структуре вблизи энергетического минимума, весьма скудны на сегодняшний день. Третьей' задачей диссертации было: исследование с помощью спектральной диффузии, индуцированной термическими циклами, энергетического ландшафта некоторых белков.

Исследование низкотемпературных флуктуационных и релаксационных процессов в белках позволяет глубже понять низкотемпературную динамику в биологических объектах и ее связь с энергетическим ландшафтом. Выбранное направление исследований определяет актуальность диссертационной работы.

Научная новизна работы.

1. Установлено, что спектральная диффузия в твердых белковых растворах в значительной степени определяется релаксационными процессами в стеклообразной матрице. Обнаружена связь между температурой стеклования растворителя и пространственной структурой белка с одной стороны и характеристиками СД с другой стороны.

2. Обнаружена и интерпретирована корреляция между величиной неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора в белке и скоростью диффузионного уширения провала. Предложена модель неоднородного уширения в оптических спектрах хромофора, отражающая структурное состояние белка.

3. В исследуемых белках экспериментально обнаружены специфические энергетические барьеры, предположительно связанные с участием водородных связей в движении аминокислот между конформационными состояниями.

4. Обнаружены изменения формы спектрального провала в ходе тепловых циклов. В качестве возможной причины наблюдаемого I эффекта предложена гипотеза, связывающая эти изменения с дисперсией скорости спектральной диффузии в образце.

Практическая значимость.

• Обнаруженное влияние релаксационных процессов в стеклообразной матрице на спектральную диффузию в твердых белковых растворах существенно меняет представление о низкотемпературной динамике в белках.

• Установленная корреляция между спектральной диффузией и структурным состоянием белка дает важную информацию для построения более совершенной теории релаксационных процессов в белках и других неупорядоченных и частично упорядоченных системах.

• Характеристики обнаруженных в исследованных белках специфических энергетических барьеров являются исключительно важным источником информации при анализе структуры этих белков и конформационных движений в них.

Структура и краткое содержание работы.

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка рисунков, таблиц, литературы и раздела благодарностей.

Заключение

.

Проведены исследования низкотемпературной динамики в белках Н2 — Сс и гп-Сс при гелиевых температурах. Основные результаты могут быть сформулированы следующим образом:

1. Обнаружена корреляция между шириной оптических спектров и степенью структурного беспорядка в глобулярных белках. Предложена простая модель, объясняющая связь неоднородного уширения ДУнеодн. со структурным беспорядком в белках.

2. Обнаружено влияние низкотемпературной динамики растворителя на СД в &bdquo-замороженных" белковых растворах. Установлено, что значительный вклад в СД в денатурированном белке вносит низкотемпературная динамика стеклующейся матрицы.

3. Обнаружена нелогарифмическая зависимость СД в глобулярных белках в функциональном состоянии. Возникновение степенной зависимости СД рассмотрено в рамках двух моделей: модели диффузионного движения и модели ДУС. В рамках диффузионной модели степенная зависимость СД связана с диффузионным характером низкотемпературных релаксаций в белке. В рамках модели ДУС степенная зависимость является следствием релаксаций ДУС с нестандартной функцией распределения по параметру туннелирования.

4. В исследуемых белках обнаружены характерные низкоэнергетические барьеры, разделяющие конформационные состояния белка. Данные состояния, возможно, связаны с движениями аминокислот белка, в которых участвуют водородные связи.

5. Обнаружено изменение формы провала в ходе термических циклов. Наблюдаемые изменения, предположительно, связаны с дисперсией диффузионных ширин линий хромофоров.

6. В белках наблюдаются сложные фотореакции. Обнаружены низкоэнергетические фотопродукты, предположительно связанные с туннелированием центральных атомов сквозь плоскость гем-группы белка. Обнаружен кинетический эффект старения, возможно, связанный с релаксационными процессами в белке.