Влияние газового субстрата на гидрогеназную активность и концентрации цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий

Одним из важнейших направлений биотехнологии является получение целевых продуктов с помощью микроорганизмов. Возрастающие темпы потребления невозобновляемых энергетических ресурсов, накопления неутили-зируемых и трудно утилизируемых продуктов деятельности людей ставят перед учеными задачи разработки экологически приемлемых технологий. Поэтому становится актуальным использование в качестве продуцентов бактерий, энергетическим субстратом которых служит водород. Человечество все чаще обращается к его использованию, поскольку водород является экологически чистым и возобновляемым источником энергии. Расширение масштабов использования энергии водорода ведет к удешевлению этого субстрата, что открывает путь к внедрению технологий на водороде. В связи с этим, весьма привлекательно использование для получения целевых продуктов автотрофных (хемолитотрофных) бактерий, для которых ростовым субстратом служит водород. Конструктивный обмен и фиксация С02 у данных бактерий реализуются в цикле Кальвина. Их энергетическая система состоит из полной цепи переноса электронов и ферментов, окисляющих водород — гидрогеназ.

Перспективными продуцентами целевых продуктов являются хемоли-тотрофные водородокисляющие бактерии Wantersia eutropha (Alcaligenes еи-trophus) Z-1 и Seliberia carboxydohydrogena Z-1062, ввиду их быстрого роста и хорошей приспособляемости к различным условиям культивирования. Представляют интерес исследования возможности использования этими бактериями водорода промышленного происхождения для поточного получения полиоксиалканоатов, аминокислот, липидов, белковых препаратов, ферментов, витаминов и других биологически активных продуктов. Кроме того, ключевые ферменты водородного метаболизма — гидрогеназы, могут использоваться при создании биосенсорных систем для мониторинга содержания водорода и других параметров в среде культивирования.

Эффективность использования энергетического субстрата определяется уровнем сопряжения систем катаболизма и анаболизма и функциональным состоянием энергетической системы бактерий. Для получения высокого выхода целевого продукта с эффективными тратами субстрата при культивировании бактерий необходимо знать, как условия среды влияют на состояние энергетической системы клеток, которая является центральным звеном регуляции метаболизма. Воздействие на этом уровне может положительно влиять на эффективность биотехнологических процессов. Для управления режимом культивирования водородокисляющих бактерий Wantersia eutropha Z-1 и Se-liberia carboxydohydrogena Z-1062 предстояло выяснить, как меняются гидро-геназная активность и концентрации цитохромов в их клетках, а также энергетическая эффективность их роста при изменении параметров газового субстрата.

Цель работы: Целью настоящей работы было изучение влияния условий газового питания на уровень гидрогеназных активностей и концентраций цитохромов в клетках W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 с учетом энергетической эффективности их роста, а также оценка перспектив биотехнологического применения гидрогеназ.

Основные задачи работы:

1. Исследовать влияние концентаций Н2, СО2 и 02 в культуральной среде на уровень активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 и энергетическую эффективность роста культуры.

2. Исследовать взаимосвязь уровня активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках с другими физиолого-биохимическими характеристиками культуры (удельной скоростью роста, эффективностью использования субстратов и конструктивным обменом клеток).

3. Изучить динамику активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов, а также других физиолого-биохимических параметров клеток W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 в зависимости от концентрации моноксида углерода в газовом субстрате.

4. Определить условия культивирования, положительно влияющие на активность гидрогеназ в клетках данных бактерий.

5. Оценить биотехнологический потенциал препаратов гидрогеназ W. еи-tropha для разработки систем детекции водорода и восстановления НАД.

В результате выполнения работы было получены данные, характеризующие динамику активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 в зависимости от условий культивирования. Установлено, что наибольшие активности гидрогеназ достигаются при лимитировании роста бактерий по энергетическому субстратунаименьшие — при ингибировании кислородом. Максимальные концентрации цитохромов характерны для клеток, выращенных при лимитировании роста по Ог, а наименьшие — при ингибировании 02. Показано, что повышение гидрогеназной активности и концентраций цитохромов при лимитировании роста по Н2 не сопровождается снижением эффективности использования энергии водорода. Установлена специфическая СО-устойчивость W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062- под воздействием токсиканта в клетках возрастает гидрогеназная активность и концентрации цитохромов, а также укрепляется мембранный аппарат. Эти изменения сопровождаются снижением эффективности использования энергии водорода при сохранении белковой направленности конструктивного обмена.

Установлены параметры процесса культивирования, позволяющие получать партии биомассы W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 с высокой гидрогеназной активностью (до 11 и 5 U / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ W. eutropha Z-1 и 2 U / мг белка для гидроге-назы S. carboxydohydrogena Z-1062). Определены условия, при которых в присутствии СО возможен устойчивый и продуктивный рост этих бактерийрезультатами обоснована возможность их выращивания на водородсодержащих субстратах, получаемых конверсией природного газа или переработкой углей. Показана пригодность аналитической системы, содержащей НАД±зависимую гидрогеназу W. eutropha Z-1, редуктазу и люциферазу, для детекции водорода (с точностью до 0,1 нмоль в пробе).

Положения, выносимые на защиту:

1. Реакция W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 на изменение условий газового питания включает изменения их гидрогеназной активности и концентраций цитохромов, сопровождающиеся изменением энергетической эффективности роста.

2. W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрациях до 20% без изменения биохимической направленности синтеза за счет адаптивных изменений: повышения синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиления мембранного аппарата. При этом удельные траты энергетического субстрата возрастают (предельное увеличение — в 1,4−1,9 раза при 20% СО).

3. Препараты НАД^-зависимой гидрогеназы и биомасса клеток W. eutropha Z-1 перспективны для создания систем регистрации водорода и восстановления НАД*.

ВЫВОДЫ.

1. Исследована динамика активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 и энергетической эффективности роста культур в зависимости от условий культивирования. Установлено, что изменения активности гидрогеназ и концентраций цитохромов не связаны напрямую с энергетической эффективностью роста. Максимальные значения активностей гидрогеназ зарегистрированы при лимитировании роста бактерий по водороду, а наименьшие — при ингибировании роста кислородом. Наибольшие концентрации цитохромов в клетках наблюдались при лимитировании роста по кислороду, а наименьшиепри ингибировании роста кислородом.

2. Выявлено, что изменения концентраций компонентов газового субстрата (Н2+СО2+О2), вызывающие изменения гидрогеназных активностей и концентраций цитохромов в клетках бактерий, не изменяют белковую направленность биохимического синтеза. Исключение составляет лимитирование роста W. eutropha Z-1 кислородом, приводящее к накоплению резервного соединения поли-р-гидроксимасляной кислоты.

3. Установлено, что W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрации до 20% в результате повышения удельных трат энергетического субстрата (в 1,4−1,9 раза при 20% СО), обеспечивающих адаптивные изменения: повышение синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиление мембранного аппарата. При этом белковая направленность синтеза не меняется.

4. Разработаны режимы культивирования, позволяющие в авто-трофных и гетеротрофных условиях получать биомассу, высокоактивную по гидрогеназам (до 11 и 5 U / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ W. eutropha Z-1 и 2 U/мг белка для гидрогеназы S. carboxydohydrogena Z-1062).

5. С использованием НА Д±зави си мой гидрогеназы W. eutropha Z-1 сконструирована аналитическая полиферментная система, позволяющая регистрировать Н2, с высокой чувствительностью (до 0,1 нмоль в пробе) в диапазоне рН 8−9.

6. Отработаны условия иммобилизации клеток W. eutropha Z-1 в альгинатный гель, с получением препаратов, сохраняющих более 50% исходной гидрогеназной активности в течение двух недель. Использование данных препаратов для регенерации НАДН обеспечивает более 98% конверсии НАД1″ в час.