Всасывание продуктов гидролиза белков и углеводов: механизмы и регуляция

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование всасывания, т. е. переноса низкомолекулярных веществ, содержащихся в пище или образующихся в результате полостного и мембранного гидролиза пищевых биополимеров, из желудочно-кишечного тракта во внутреннюю среду организма, является одним из актуальных направлений физиологии пищеварения и питания.

Современные представления о функционировании пищеварительного аппарата (в том числе — в отношении всасывания пищевых веществ) сформировались во многом под влиянием открытия A.M. Уголевым в конце 50-х годов мембранного пищеварения. Локализация мембранного гидролиза пищевых веществ и всасывания образующихся продуктов на одной и той же поверхности — апикальной мембране энтероцитов — является одним из факторов, обеспечивающих тесную интеграцию этих процессов и высокую эффективность работы пищеварительно-транспортного конвейера.

В значительном прогрессе, достигнутом в исследовании механизмов всасывания пищевых веществ и его адаптации, важную роль сыграли различные аналитические (редуцированные) модели: от эвертированных препаратов тонкой кишки (обзоры: Уголев, 1972; 1985; Kimmich, 1981; Karasov, Diamond, 1987; Foulkes, 1996; Barthe et al., 1999; Тимофеева и др., 2000; Метельский, 2007) до везикул изолированных мембран щеточной каймы энтероцитов и клонированных мембранных транспортеров (Уголев, 1985; Уголев, Иезуитова, 1991; Hopfer, 1987; Cheeseman, Tsang, 1996; Kushak, Winter, 2005; Drozdowki, Thomson, 2006aWright et al, 2007).

На основе опытов с эвертированными препаратами тонкой кишки была разработана основная модель переноса глюкозы через энтероцит, предполагающая вход глюкозы через апикальную мембрану в клетки с участием натрий-зависимого вторичного активного транспорта и выход глюкозы из них через базолатеральную мембрану с участием облегченной диффузии (Crane et al., 1961), которая в дальнейшем получила развитие в отношении всасывания аминокислот и дипептидов (обзоры: Hopfer, 1987; Тимофеева и др., 2000; Kushak, Winter, 2005). Позднее были получены новые данные в пользу указанной модели благодаря выделению и клонированию апикального натрий-зависимого транспортера глюкозы SGLT1 и базолатерального транспортера облегченной диффузии глюкозы GLUT2 (обзоры: Hopfer, 1986; Тимофеева и др., 2000; Ferraris, 2001; Kushak, Winter, 2005; Wright et al, 2007).

Вместе с тем в последние годы были предприняты попытки ревизии общепринятого представления о вторичном активном транспорте как основном механизме переноса глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов в тонкой кишке млекопитающих. Выдвинуты две новые гипотезы: о преимущественно парацеллюлярном переносе глюкозы на потоке всасывающейся воды (Pappenheimer 1987, 2001) и об облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2, который включается в апикальную мембрану энтероцитов при высоких углеводных нагрузках (Kellett, Helliwell, 2000; Kellett, 2001).

Обе гипотезы основаны главным образом на результатах опытов in vitro или острых опытов in vivo на анестезированных животных. Вместе с тем при использовании разработанной А. М. Уголевым и Б. З. Зариповым (1979) методики хронических опытов было показано, что в отсутствие наркоза и операционной травмы гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке протекают с более высокой скоростью, а степень их сопряжения значительно выше, чем в случае широко применявшихся методов in vivo и in vitro. Существенные различия между острыми и хроническими опытами in vivo обнаружены в отношении реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на некоторые экспериментальные воздействия (введение уабаина и/или удаление ионов натрия) (Уголев и др., 1984; 1986; 1987), а также в отношении проницаемости преэпителиального («неперемешиваемого») слоя тонкой кишки, значительно более высокой в хронических опытах (Груздков, Громова, 1995; Levitt et al., 1996). Все это диктовало необходимость проверки указанных новых гипотез в условиях хронического опыта как наиболее близких к физиологическим.

Остается дискуссионным вопрос о соотношении транспорта продуктов расщепления белков через апикальную мембрану энтероцита в виде аминокислот, образующихся при мембранном гидролизе пептидов, и в виде малых пептидов (дии трипептиды), подвергающихся затем внутриклеточному гидролизу (обзоры: Grimble, Silk, 1989; Уголев и др., 1990; Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 2000; Adibi, 2003; Thwaites, Anderson, 2007). Следует отметить, что кинетические параметры транспорта аминокислот и олигопептидов до настоящего времени практически не исследовались в опытах in vivo в отсутствие наркоза и операционной травмы. Вместе с тем указанные факторы могут существенно изменять относительный вклад «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывание продуктов гидролиза белков.

В последние десятилетия установлены основные факторы, влияющие на протекание гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке (пищевые субстраты, желчь, панкреатический секрет, гормоны), среди которых ведущая роль отводится субстратному регулированию (Karasov, Diamond, 1987; Уголев и др., 1991; Levin, 1994; Ferraris, Diamond, 1997; Ferraris, 2001; Drozdowski, Thomson, 2006bWright et al, 2007). Но до настоящего времени нет ясности в отношении роли желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов (обзоры: Karasov, Diamond, 1983; 1987; Уголев и др., 19 916). В литературе имеются сведения, главным образом, о совместном действии желчи и панкреатического секрета. Представлялось важным выявить влияние каждого из них в отдельности на всасывательную способность тонкой кишки, в частности, в отношении всасывания продуктов гидролиза углеводов.

До сих пор при исследовании субстратной регуляции всасывания нутриентов в тонкой кишке практически не использовалась методика хронических экспериментов. Вместе с тем ее применение для этой цели имеет ряд важных преимуществ перед существующими методами, а именно: 1) проведение многократных опытов на одной и той же группе животных- 2) контроль уровня и специфичности локальной субстратной нагрузки на тонкую кишку и возможность выявления реакции на эту нагрузку со стороны соответствующих мембранных гидролитических и транспортных систем- 3) возможность исследования роли эндогенных (в основном, гормональных) факторов, сопутствующих изменению функционального состояния организма, на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки.

Представлялось целесообразным использовать указанные преимущества хронических опытов для выявления особенностей регуляции всасывания нутриентов в изолированном участке тонкой кишки под влиянием регулярной субстратной нагрузки различной специфичности, а также системных факторов, сопутствующих полному голоданию, белковой депривации и наркозу.

Все вышеизложенное определило постановку цели и задач исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование механизмов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке и его адаптивной регуляции при действии различных люминальных и эндогенных факторов.

Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Выявить относительную роль различных механизмов транспорта (парацеллюлярный перенос, облегченная диффузия с участием ОЬиТ2, вторичный активный транспорт с участием 8СЬТ1) во всасывании глюкозы в тонкой кишке.

2. Разработать математический подход и использовать его для оценки по данным, полученным в хронических опытах, «истинных» (с учетом влияния преэпителиального слоя тонкой кишки) кинетических параметров мембранного гидролиза мальтозы и дипептидов, а также всасывания глюкозы, аминокислот и дипептидов.

3. Определить соотношение «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании дипептидов.

4. Оценить влияние различных по специфичности субстратных нагрузок на структурные и функциональные характеристики тонкой кишки.

5. Оценить роль желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы и крахмала.

6. Изучить влияние наркоза на гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке.

7. Исследовать влияние полного голодания и белковой депривации на гидролитические и транспортные функции тонкой кишки.

НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые показано, что высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке крыс в диапазоне больших концентраций мальтозы имеют место в отсутствие всасывания воды (в случае гипоосмотических инфузатов) и даже на фоне секреции воды (в случае гиперосмотических инфузатов) — эти результаты свидетельствуют о том, что парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.

Впервые показано, что флоретин (ингибитор GLUT2), введенный с мукозной стороны кишки, в условиях хронического опыта не только ингибирует всасывание глюкозы (или галактозы), но и способен неспецифически тормозить всасывание глицина. В опытах in vitro обнаружено, что он снижает выход глюкозы из энтероцитов в эвертированных мешках тонкой кишки и ингибирует активность пищеварительных ферментов в гомогенатах слизистой оболочки. Эти результаты позволяют заключить, что используемый рядом зарубежных исследователей подход, предусматривающий применение флоретина с мукозной стороны in vivo, дает завышенную оценку вклада облегченной диффузии и заниженную оценку вклада вторичного активного транспорта с участием транспортера SGLT1 во всасывание глюкозы.

С применением разработанного математического подхода впервые по данным о кинетике гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке в хронических опытах получена оценка проницаемости преэпителиального слоя и, с ее учетом, определены значения «истинных» кинетических констант гидролиза мальтозы и активного транспорта глюкозы. Это позволило впервые установить, что значительно большие скорости всасывания глюкозы в хронических опытах, по сравнению с острыми опытами in vivo, обусловлены не только лучшей проницаемостью преэпителиального барьера тонкой кишки, но и более высоким значением константы максимальной скорости активного транспорта глюкозы.

Впервые с применением разработанного математического подхода определены в условиях хронического опыта значения «истинных» кинетических констант мембранного гидролиза и всасывания дипептидов (глицилглицин и глицил-Ь-лейцин) и составляющих их аминокислот (глицин и лейцин), что позволило количественно оценить относительную роль «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании каждого из этих дипептидов в широком диапазоне их концентраций.

В опытах с перевязкой желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов впервые показано повышение активного транспорта свободной глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов. После перевязки панкреатического протока у кроликов отсутствовали заметные изменения в активном транспорте глюкозы, образующейся при мембранном гидролизе крахмала.

Повышение активного транспорта глюкозы в указанных отделах тонкой кишки обеспечивает сохранение высокой эффективности работы пищеварительно-всасывательного конвейера в отношении углеводных полимеров при снижении темпов полостного пищеварения вследствие недостаточности панкреатических ферментов.

Впервые исследована динамика развития адаптивных изменений гидролиза и всасывания различных субстратов в изолированном участке тонкой кишки крыс в хронических опытах при белковой депривации животных в течение двух недель. Обнаружены разнонаправленные изменения всасывания глюкозы, глицина и глицилглицина на разных сроках безбелкового рациона. Несмотря на то, что в некоторые сроки эти показатели снижаются, их уровень остается довольно высоким, что играет жизненно важную роль при возобновлении кормления.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие современных представлений о механизмах транспорта глюкозы, аминокислот и дипептидов в тонкой кишке млекопитающих в физиологических условиях. Полученные результаты показывают, что парацеллюлярный перенос на потоке воды, рассматривавшийся некоторыми исследователями как основной механизм всасывания глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках, в этих условиях не играет заметной роли. Наши данные свидетельствуют о том, что основным механизмом всасывания глюкозы является ее активный транспорт, опосредованный 8СЬТ1, тогда как роль облегченной диффузии с участием ОЬиТ2 становится существенной лишь при высоких углеводных нагрузках. Согласно результатам нашей работы, относительный вклад «пептидной» и «аминокислотной» составляющих во всасывание дипептидов в физиологических условиях определяется соотношением кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида.

Представленные результаты способствуют более глубокому пониманию путей и механизмов адаптивной регуляции всасывания нутриентов при действии различных люминальных и эндогенных факторов. Раскрыты особенности влияния наркоза и операционной травмы, присущих острым опытам in vivo, на всасывание нутриентов. Показано, что наркоз влияет на проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и на величину максимальной скорости активного транспорта глюкозы. Данные о реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на полное голодание и безбелковое питание предполагают участие эндогенных факторов, сопутствующих этим состояниям, в регуляции процессов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов. Показано сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ в условиях полного голодания или содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе, что, по-видимому, играет важную роль в обеспечении эффективного всасывания эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасывания основных компонентов пищи при возобновлении питания. Проанализированы особенности изменения активного транспорта глюкозы в тонкой кишке после перевязки желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов. Полученные данные позволяют полагать, что повышение активного транспорта глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов направлено на сохранение эффективного всасывания глюкозы, образующейся при гидролизе углеводных полимеров, в условиях снижения темпов полостного пищеварения вследствие исключения желчи и панкреатического секрета.

Результаты экспериментального исследования различных механизмов всасывания глюкозы, а также механизмов гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот, могут иметь значение для совершенствования методов энтерального и парентерального питания, а также для оценки механизмов действия лекарственных веществ олигопептидной природы.

Результаты исследования субстратной регуляции всасывания в изолированном участке тонкой кишки крыс в условиях хронического опыта способствуют пониманию механизмов адаптивных перестроек тонкой кишки после хирургических вмешательств и могут быть полезны при разработке диетического питания в постоперационном периоде.

Данные о реакции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе углеводов различной степени полимерности, на исключение желчи или панкреатического секрета расширяют представления о механизмах адаптивных перестроек тонкой кишки при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической а-амилазы) и могут быть полезны для разработки лечебных диет при указанной патологии.

Исследование изменений функциональных характеристик изолированного участка тонкой кишки в хронических опытах, а также изменений функциональных характеристик препаратов тонкой кишки в опытах in vitro на фоне полного голодания или безбелкового питания, имеет практическое значение для разработки лечебных диет, обеспечивающих оптимальный рефидинг — переход от состояния голодания (лечебного или вынужденного) к нормальному питанию.

Математические подходы, позволяющие оценить проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и, с ее учетом, «истинные» кинетические константы мембранного гидролиза и всасывания субстратов, могут найти применение при анализе результатов перфузионных исследований in vivo на животных и на человеке.

Данные, полученные в работе, могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и биохимии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.

2. Транспорт глюкозы, опосредованный котранспортером натрия и глюкозы 8СЬТ1, является основным механизмом всасывания этого моносахарида в тонкой кишке, тогда как облегченная диффузии с участием ОЬиТ2 играет заметную роль лишь при высоких углеводных нагрузках.

3. Высокие скорости всасывания глюкозы в тонкой кишке в физиологических условиях обеспечиваются главным образом благодаря большой мощности системы вторичного активного транспорта глюкозы и высокой проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки.

4. Сохранение высокой эффективности функционироваания пищеварительно-всасывательного конвейера тонкой кишки в отношении углеводов при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической а-амилазы) обеспечивается за счет повышения способности кишечного эпителия к активному транспорту глюкозы.

5. Сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ (глюкоза, аминокислоты, дипептиды) в условиях полного голодания или безбелкового питания может обеспечиваться действием эндогенных (гормональных) факторов и способствовать эффективному всасыванию этих субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасыванию основных компонентов пищи при возобновлении питания.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА. Материалы работы доложены на II международной конференции «Средства математического моделирования» (Санкт-Петербург, 1999) — 1-У Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999, 2001, 2003, 2005, 2007 гг.) — IV, VI, VIII Международных конгрессах «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2000, 2002, 2004 гг.) — XIX Съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Екатеринбург, 2004) — XXXV Международном конгрессе физиологических наук (San Diego, USA, 2005) — I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005) — Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы пищеварения и питания» (Санкт-Петербург, 2006) — Международном симпозиуме «XXI Meeting European Intestinal Transport Group. March 3−6, 2007. Oberwiesenthal, Germany).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликованы 52 работы, включая 27 статей в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 283 страницах, содержит 35 рисунков и 8 таблиц.

ВЫВОДЫ.

1. Высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке крыс в диапазоне высоких концентраций субстрата (50 — 200 мМ) наблюдаются при секреции воды в кишке в случае гиперосмолярных инфузатов и в отсутствие ее всасывания в случае гипоосмолярных инфузатов, что свидетельствует о незначительной роли парацеллюлярного механизма транспорта глюкозы в тонкой кишке млекопитающих при высоких углеводных нагрузках.

2. Флоретин, введенный со стороны слизистой оболочки тонкой кишки в хронических опытах in vivo, тормозит всасывание не только глюкозы и галактозы, но и глицина, а в опытах in vitro не влияет на аккумуляцию глюкозы в ткани эвертированных мешков тонкой кишки, но снижает ее аккумуляцию в серозной жидкости. Подход, предусматривающий применение флоретина с мукозной стороны in vivo, завышает относительную роль ОЬиТ2-зависимого транспорта глюкозы через апикальную мембрану энтероцита. Основным механизмом всасывания глюкозы является ее транспорт, опосредованный SGLT1, тогда как облегченная диффузия с участием GLUT2 имеет существенное значение при высоких углеводных нагрузках.

3. Роль «пептидной» и «аминокислотной» составляющих во всасывании дипептидов определяется соотношением кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида. При относительно низких концентрациях (менее 40 мМ) глицилглицин и глицил-Ь-лейцин всасываются в тонкой кишке преимущественно в нерасщепленном виде. Однако при увеличении концентрации субстрата доля пептидного компонента снижается и может стать сопоставимой с долей всасывания свободных аминокислот, образующихся в результате мембранного гидролиза дипептидов.

4. В условиях хронического опыта (в отсутствие наркоза и операционной травмы) проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки, а также значение максимальной скорости активного транспорта глюкозы, многократно превышают значения этих параметров, определяемые в острых опытах in vivo на анестезированных животных.

5. После исключения из пищеварения желчи у крыс обнаружено расширение в дистальном направлении зоны интенсивного активного транспорта свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы. После исключения из пищеварения панкреатических ферментов у кроликов повышается активный транспорт свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы, в проксимальных отделах тонкой кишки и сохраняется на исходном уровне по всей длине тонкой кишки активный транспорт глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала.

Повышение активного транспорта глюкозы в ответ на исключение желчи или панкреатического секрета, можно рассматривать как компенсаторную реакцию, обеспечивающую сохранение * высокой эффективности функционирования пищеварительно-всасывательного конвейера тонкой кишки в отношении углеводов при недостаточности полостного пищеварения (в частности, недостаточности панкреатической ос-амилазы).

6. Нагрузка изолированной петли тонкой кишки крыс растворами глютаминовой кислоты или глютамина более эффективна, по сравнению с нагрузкой глюкозой, в отношении замедления атрофии ее слизистой оболочки и сохранения на более высоком уровне гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот. Нагрузка раствором глюкозы в большей степени способствует поддержанию способности изолированной петли к всасыванию глюкозы. Эти результаты служат прямым подтверждением концепции локального субстратного регулирования всасывательной способности тонкой кишки.

7. Показано, что после полного голодания животных (3 и 5 дней) или после их содержания на высокоуглеводном безбелковом рационе (7 и 14 дней) на фоне снижения массы слизистой оболочки тонкой кишки крыс, сохраняется или даже повышается способность кишки к всасыванию глюкозы, галактозы и глицина, что способствует эффективному всасыванию эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также основных компонентов пищи при возобновлении питания.

8. На разных сроках содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе происходят разнонаправленные изменения скоростей всасывания глюкозы, глицина и глицилглицина в изолированной петле тонкой кишки в хроническом опыте. Эти данные свидетельствуют о чувствительности процессов всасывания, к действию эндогенных (гормональных) факторов, сопутствующих белковому голоданию.

5.3.5.

Заключение

.

Содержание животных на безбелковом высококалорийном углеводном рационе в ряде отношений отличается от полного голодания. Для белковой депривации характерна меньшая потеря массы тела животных и большая.

Рис. 5.8. Активности ферментов в гомогенатах слизистой оболочки изолированного (А) и функционирующего (Б) участков тонкой кишки крыс, содержавшихся на стандартном рационе (группа 2), или после содержания крыс в течение двух недель на высокоуглеводном безбелковом рационе (группа I).

По вертикали — ферментативные активности (мкмоль/мин на г ткани). Обозначения: 1 — стандартный рацион- 2 — высокоуглеводный безбелковый рацион. * Р<0.05, ** Р<0.01 (по сравнению с таковой у животных, содержавшихся на стандартном рационе). продолжительность их жизни. Так, по данным Moldawer et al. (1981), продолжительность жизни взрослых крыс при высококалорийной углеводной диете с пониженным содержанием белка увеличивалась до 28 суток против 9−10 суток при полном голодании, а масса тела животных в конце экспериментального периода снижалась на 23% против 40%, соответственно.

Этот факт объяснялся экономией эндогенного белка (главным образом, в сердечной и скелетных мышцах), который становится основным источником калорий, азота и незаменимых аминокислот при полном голодании (Moldawer et al., 1981; Goodman et al., 1984). В наших опытах при содержании крыс на высокоуглеводной безбелковой диете снижение массы тела животных также было относительно медленным. Оно составляло 5.5% в интервале 2−5 суток белкового голодания и возрастало до 13.3% на 14-е сутки, что было существенно меньше, чем у животных близкого возраста после полного голодания в течение 3-х и 5-и суток — соответственно около 20 и 27% (раздел 5.3.2). Это обстоятельство, а также более высокая (по сравнению с полным голоданием) продолжительность жизни животных, косвенно указывали на проявление в наших экспериментальных условиях эффекта экономии эндогенного белка организма.

Согласно данным Goodman et al. (1984), изменение массы тонкой кишки при голодании происходит в основном в течение первых 4-х суток и, по-видимому, не зависит от запаса в организме небелковых калорий. Эти данные были получены в опытах на растущих крысах, которые перед голоданием содержались на обычном рационе или на рационе с высоким содержанием жира. Однако данные, полученные нами на взрослых крысах с использованием высокоуглеводной безбелковой диеты (раздел 5.3.3), также согласуются с выводом Goodman et al., поскольку согласно этим данным наблюдалось снижение (на 30%) массы слизистой оболочки тонкой кишки на 7 сутки, но отсутствовали изменения этого показателя через 14 суток.

Интересно, что в настоящем исследовании масса слизистой оболочки изолированного участка кишки в конце периода белковой депривации оставалась на том же уровне, что и у контрольных животных, содержавшихся на стандартном рационе, но масса слизистой оболочки функционирующего (ниже анастомоза) участка кишки заметно снижалась. Близкая закономерность наблюдалась ранее в отношении массы слизистой и высоты ворсинок изолированного участка тонкой кишки при полном голодании (Волошенович и др., 1981). Этот феномен объяснялся существованием некоторого минимального уровня гипоплазии слизистой оболочки тонкой кишки. Вместе с тем показано, что при голодании происходит также снижение скорости синтеза белка в энтероцитах (McNurlan, Garlick, 1981). При условии сохранения или повышения скорости деградации белка это обстоятельство может быть причиной снижения удельной активности некоторых ферментов и мембранных транспортеров тонкой кишки.

Изменение всасывания глюкозы — главного углеводного компонента пищи — при безбелковом высокоуглеводном рационе отличается от изменения всасывания глюкозы при полном голодании. Так, при полном голодании всасывание глюкозы в расчете на единицу длины кцшки значительно снижается уже на вторые и третьи сутки (Волошенович и др., 1981; Karasov, Diamond, 1983), притом, что всасывательная способность энтероцитов может сохраняться (наши данные — раздел 5.3.2- Karasov, Diamond, 1983) или снижаться (Karasov, Diamond, 1983). Напротив, при белковом голодании (включая рационы с низким содержанием белка) на фоне высокоуглеводной диеты всасывание глюкозы в расчете на единицу длины кишки, а также всасывательная способность энтероцитов, сохраняются (Karasov et al., 1987) или возрастают (наши данные — раздел 5.3.3- Karasov, Diamond, 1983). Эти результаты, по-видимому, можно объяснить с позиции субстратного регулирования транспорта глюкозы в тонкой кишке. В настоящей работе в хронических опытах изолированный участок тонкой кишки, хотя и был лишен высокоуглеводной нагрузки, которую получал функционирующий участок, но все же ежедневно в течение 1 часа перфузировался раствором глюкозы с концентрацией 50 мМ (раздел.

5.3.4). Поэтому можно было ожидать, что реакция в отношении всасывания глюкозы в изолированном участке кишки будет сходной с реакцией интактной тонкой кишки на фоне высокоуглеводной безбелковой диеты (наши данные — раздел 5.3.3). Действительно, в результате белковой депривации в изолированном участке тонкой кишки наблюдались разнонаправленные изменения скорости всасывания глюкозы относительно исходного уровня. Однако к концу экспериментального периода (на тринадцатые сутки) отмечалась тенденция к ее возвращению до исходного уровня. Отсутствие в хронических опытах в конце периода белковой депривации повышенного всасывания глюкозы в тонкой кишке, которое отмечалось нами в опытах in vitro (раздел 5.3.3), по-видимому, связано с более низким уровнем ежедневной глюкозной нагрузки на изолированный участок кишки по сравнению с длительным воздействием на тонкую кишку высокоуглеводной безбелковой диеты при нормальном пищеварении.

По сравнению с всасыванием свободной глюкозы существенно иным оказалось изменение в хронических опытах гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в изолированной кишечной петле. К концу вторых суток безбелковой диеты эти показатели не менялись, а на пятые сутки они значительно снижались и сохранялись на этом уровне до конца экспериментального периода. Факт снижения скорости гидролиза мальтозы в изолированном участке кишки после 5 суток безбелковой диеты согласуется с другими нашими данными, показывающими снижение активности мальтазы в гомогенатах слизистой оболочки из изолированного участка по окончании хронических опытов по белковой депривации. Неожиданным выглядит то обстоятельство, что динамика скорости всасывания образующейся глюкозы в изолированном участке кишки при белковом рационе по своему характеру соответствовала динамике скорости гидролиза мальтозы, а не динамике скорости всасывания свободной глюкозы. На первый взгляд, это не согласуется с представлением о том, что всасывание свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы, обеспечивается общей транспортной системой (Громова, Груздков, 1999). Однако полученные данные находят удовлетворительное объяснение при учете особенностей геометрии кишечной поверхности. В те периоды, когда по каким-либо причинам снижена активность системы транспорта глюкозы в энтероцитах, ее эффективное гидролиз-зависимое всасывание обеспечивается благодаря тому, что глюкоза, образующаяся из мальтозы в апикальной части кишечных ворсинок проникает в более глубокие области межворсинчатого пространства и в значительной степени всасывается в энтероцитах латеральной поверхности ворсинок.

Изменение всасывания аминокислот в тонкой кишке при безбелковых диетах, а также при диетах с низким содержанием белка (3−5%), по своему характеру сходно с таковым при полном голодании (Kansal, Wahie, 1981; Karasov et al., 1987). Так, в большей части работ, охватывающих различные сроки белкового голодания животных, в опытах in vivo и in vitro показано сохранение или повышение всасывания аминокислот (в расчете на единицу длины кишки или на кв. см ее серозной поверхности) по отношению к всасыванию аминокислот у животных с нормальным питанием (Kansal, Wahie, 1981; Karasov et al., 1987). При этом всасывание аминокислот в расчете на г ткани кишки (которое в определенной степени характеризует всасывательную способность энтероцитов) возрастает (Kansal, Wahie, 1981; Karasov et al., 1987). Предполагается, что увеличение всасывательной способности энтероцитов при голодании способствует сохранению на достаточном уровне всасывания аминокислот в тонкой кишке в условиях значительного снижения ее массы. Вместе с тем при высокоуглеводном рационе с низким содержанием белкового компонента (4%) в виде незаменимых аминокислот наблюдалось сохранение этого эффекта только в отношении незаменимых аминокислот при снижении всасывания заменимых аминокислот (Karasov et al., 1987). Вполне вероятно, что длительное белковое голодание (более 14 суток) может приводить к неспецифическому снижению всасывания аминокислот в связи со значительной потерей веса животных и близостью их смерти (Karasov, Diamond, 1987).

Результаты настоящей работы в отношении всасывания глицина, полученные в опытах in vitro и в изолированной кишечной петле в хронических опытах, на фоне полного голодания и белковой депривации умеренной длительности согласуются с отмеченной выше основной закономерностью в отношении всасывания аминокислот при этих условиях. Так, всасывание глицина в эвертированных мешках тонкой кишки взрослых крыс увеличивалось через 3 и 5 суток полного голодания и через 14 суток после безбелкового высокоуглеводного рациона. Кроме того, несмотря на значительную вариабельность скорости всасывания глицина в изолированном участке тонкой кишки при белковой депривации, она не опускалась ниже исходной, а в некоторые периоды времени (на вторые, пятые и тринадцатые сутки) даже заметно превышала ее. В результате, средний уровень, относительно которого происходили изменения всасывания глицина при белковой деприваии был выше, чем при нормальном питании.

Хотя сведения о всасывании дипептидов при безбелковом рационе или при полном голодании немногочисленны, можно заметить сходство в изменении всасывания дипептидов и аминокислот. В частности, в наиболее ранних работах не обнаружено изменений во всасывании метионин-метионина в тонкой кишке крыс на фоне безбелковой диеты в течение 10 и 41 суток, а также глицил-Ь-лейцина в тонкой кишке человека при недостаточности белковых калорий в пище (Matthews, Payne, 1980). В недавней работе с использованием выделенных из тонкой кишки мРНК пептидного транспортера PepTl и самого транспортера PepTl показано повышение их плотности при полном голодании крыс в течение 4 суток, а также при полу голодании (50% пищи от контроля) в течение 10 суток (Ihara et al., 2000а). В отношении мембранных пептидаз отмечено повышение активности аминопептидазы М и дипептидилпептидазы в щеточной кайме крыс при полном голодании в течение пяти суток (Ihara et al., 2000b), но снижение аминопептидазы М и глицил-Ь-лейциндипептидазы при безбелковом высокоуглеводном рационе (Тимофеева и др., 1994).

Полученные нами данные в отношении гидролиза и всасывания глицилглицина в изолированном участке тонкой кишки при белковой депривации (раздел 5.3.4), а также всасывания глицина, образующегося при гидролизе глицилглицина, в эвертированных мешках тонкой кишки при полном голодании в течение 3 и 5 суток (раздел 5.3.2) в основном согласуются с описанными выше закономерностями всасывания дипептидов при аналогичных условиях. Активный транспорт глицина, образующегося при гидролизе глицилглицина, в эвертированных мешках тонкой кишки существенно возрастал через 3 и 5 суток полного голодания (раздел 5.3.2). Кроме того, в хронических опытах гидролиз и всасывание глицилглицина, хотя и испытывали разнонаправленные изменения на вторые и одиннадцатые сутки белкового голодания, на пятые, восьмые и тринадцатые сутки оба показателя возвращались к исходному уровню. Динамика гидролиза и всасывания глицилглицина в некоторых случаях была сходна с таковой для всасывания свободных глюкозы и глицина (в отношении повышения гидролиза и всасывания глицилглицина на вторые сутки и снижения этих показателей на одиннадцатые сутки). В других случаях она напоминала динамику гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы (в отношении снижения гидролиза и всасывания глицилглицина на пятые сутки белковой депривации). Эти данные становятся понятными, если иметь в виду существование двух механизмов всасывания дипептидов в тонкой кишке: в виде аминокислот, образующихся при мембранном гидролизе дипептида, с использованием транспортеров аминокислот и в виде нерасщепленных дипептидов с использованием пептидных транспортеров (Мембранный гидролиз и транспорт., 1986; Адаптационно-компенсаторные процессы., 1991; Тимофеева и др., 2000; Громова, Груздков, 2003). Действительно, если активность мембранной глицилглициндипептидазы, как и мальтазы, снижалась на пятые сутки белковой депривации, то следовало ожидать снижения в данный период также гидролиза и всасывании глицилглицина. В пользу возможного падения активности этой дипептидазы в изолированном участке тонкой кишки при белковой депривации служит уменьшение в наших опытах активности аминопептидазы М в гомогенате слизистой оболочки изолированного участка кишки в результате потребления безбелкового рациона.

Заслуживает внимания различная по направленности реакция мембранных ферментов (мальтазы, щелочной фосфатазы и аминопептидазы М) в изолированном и функционирующем участках тонкой кишки на белковое голодание. Следует заметить, что обнаруженное нами снижение активности мальтазы, щелочной фосфатазы и аминопептидазы М в изолированном участке тонкой кишки хорошо согласуется с данными, полученными в отношении интактной тонкой кишки крыс после высокоуглеводного безбелкового рациона в течение 7 и 14 суток (Тимофеева и др., 1994) и, по-видимому, объясняется снижением концентрации этих ферментов в энтероцитах вследствие снижения скоростей ихсинтеза. Отсутствие такого эффекта в отношении функционирующего участка кишки в наших опытах возможно связано с его гиперфункционированием.

Рассматривая наши данные по динамике гидролиза и всасывания нутриентов в изолированном участке тонкой кишки в совокупности, можно заметить довольно неоднозначные изменения всасывания глюкозы и глицина, а также гидролиза и всасывания глицилглицина на разных сроках высокоуглеводного безбелкового рациона. Это обстоятельство дополняет перечень тех факторов, которые могут являться причиной противоречий в результатах разных авторов. Обращает на себя внимание также то, что изменения во всасывании глюкозы и глицина имели место в одни и те же периоды времени. Это позволяет думать, что они обусловлены действием общих эндогенных факторов, в частности тех, которые определяют перестройки функциональных характеристик тонкой кишки при белковой депривации.

Вместе с тем при белковой депривации только на одном сроке (через 5 суток после перевода на безбелковую диету) наблюдалось снижение мембранного гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы. Эти процессы, по-видимому, устойчивы к действию некоторых эндогенных факторов, сопутствующих белковому голоданию.

Важным результатом нашего исследования является выявление того факта, что в конце двухнедельной белковой депривации мембранный гидролиз с участием мальтазы, аминопептидазы М и щелочной фосфатазы, а также гидролиз-зависимое всасывание образующихся продуктов (например, глюкозы, образующейся из мальтозы), были сниженными при том, что всасывание свободных глюкозы, глицина и глицилглицина сохранялось или повышалось.

Сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных нутриентов в условиях полного голодания и белковой депривации, по-видимому, играет важную роль в обеспечении эффективного всасывания эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасывания основных компонентов пищи при возобновлении питания.

Глава 6. Общее заключение.

Эффективная работа пищеварительного аппарата млекопитающих обеспечивается как высокой скоростью протекания процессов пищеварения и всасывания, так и его способностью адаптироваться к изменению количества и качественного состава потребляемой пищи, а также к изменению функционального состояния организма.

В последние десятилетия получен обширный экспериментальный материал в отношении механизмов и регуляции гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке млекопитающих. Однако многие аспекты этой проблемы, касающиеся, в частности, процессов всасывания, до сих пор слабо изучены, а некоторые устоявшиеся представления подвергаются существенному пересмотру.

Проведенная нами работа позволила прояснить ряд спорных вопросов в отношении роли различных механизмов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке и приблизиться к пониманию некоторых недостаточно изученных аспектов адаптации процессов гидролиза и всасывания нутриентов к действию люминальных и эндогенных факторов.

При исследовании многих из указанных вопросов наиболее адекватной и плодотворной оказалась методика перфузии пищевыми субстратами изолированного участка тонкой кишки в условиях хронического опыта (Уголев, Зарипов, 1979; Уголев и др., 1984, 19 866). Она позволяет проводить эксперименты в отсутствие наркоза и операционной травмы, которые существенно ухудшают функциональные г характеристики тонкой кишки. В некоторых случаях особенно важна возможность проведения многократных опытов на одном и том же животном. Кроме того, при использовании методики хронического эксперимента создаются благоприятные условия для изучения как прямого действия субстратных нагрузок, так и опосредованного эндогенными факторами. Для анализа экспериментальных результатов ключевое значение имели также разработанные нами математические подходы, позволившие объективно оценить «истинные» (с учетом влияния преэпителиального слоя) кинетические параметры гидролиза и всасывания нутриентов в тонкой кишке в условиях хронического опыта.

6.1. Механизмы всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке в физиологических условиях.

Парацеллюлярный транспорт глюкозы. Как было отмечено в обзоре литературы (раздел 1.2.4), в конце 80-х годов была выдвинута гипотеза о том, что в физиологических условиях при высоких концентрациях глюкозы ее всасывание происходит главным образом путем парацеллюлярного переноса через плотные межклеточные контакты на потоке всасывающейся воды (Pappenheimer, Reiss, 1987; Pappenheimer, 2001). При этом транспорт, опосредованный SGLT1, играет лишь роль запускающего механизма. Считалось, что этот механизм особенно эффективен в отношении всасывания глюкозы, образующейся при мембранном гидролизе олигосахаридов (Pappenheimer, 1993).

В наших предшествующих исследованиях было показано, что при относительно низких концентрациях глюкозы (< 75 мМ) на долю парацеллюлярного компонента транспорта приходится не более 15% суммарного всасывания глюкозы в тонкой кишке (Громова, Груздков, 1993, 1999; Уголев и др., 1995).

Однако можно было ожидать, что роль парацеллюлярного механизма во всасывании нутриентов, в частности глюкозы, в наибольшей степени будет проявляться в диапазоне высоких и супервысоких концентраций субстрата, когда должно происходить насыщение соответствующих систем его активного транспорта. Для выяснения этого вопроса требовались данные о взаимоотношении скорости всасывания глюкозы и скорости (а также направления) трансэпителиального потока воды при высоких концентрациях углеводов. Такие данные в отношении всасывания глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы, и всасывания воды в тонкой кишке крыс в хронических опытах впервые получены были в настоящей работе.

В наших опытах обнаружено, что в диапазоне больших концентраций мальтозы (50−200 мМ) высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы наблюдаются не только в отсутствие результирующего трансэпителиального потока воды (в случае практически изоосмолярных инфузатов), но даже на фоне секреции воды (в случае гиперосмолярных инфузатов).

Отсутствие результирующего всасывания воды в изолированной петле тонкой кишки при ее перфузии изоосмолярными растворами с высокой концентрацией мальтозы, по-видимому, связано с тем, что всасывание воды, сопряженное с всасыванием образующейся глюкозы, стабилизируется, когда система активного транспорта глюкозы приближается к насыщению. В то же время возрастает поток воды, идущий в противоположном направлении из-за повышения осмолярности в премембранной зоне за счет увеличения концентрации глюкозы, образующейся из мальтозы.

Таким образом, механизм парацеллюлярного переноса на потоке растворителя, будучи малоэффективным в диапазоне низких концентраций глюкозы, практически полностью теряет свою эффективность при ее высоких и супервысоких концентрациях. Эти результаты позволяют завершить дискуссию о преимущественной роли этого механизма во всасывании углеводов и, возможно, других пищевых веществ в тонкой кишке млекопитающих.

Облегченная диффузия глюкозы с участием транспортера.

GLUT2. Как было упомянуто выше (раздел 1.2.5), в начале текущего десятилетия группа английских физиологов обнаружила, что транспортер глюкозы GLUT2, обеспечивающий выход глюкозы из энтероцитов через базолатеральную мембрану (Cheeseman, Harley, 1991; Cheeseman, 1992), при высокой концентрации глюкозы на всасывательной поверхности тонкой кишки способен быстро и в значительном количестве встраиваться в их апикальную мембрану энтероцитов и, наряду с транспортером SGLT1, участвовать в переносе глюкозы через эту мембрану. Предполагается, что в этих условиях, на фоне насыщения транспортера SGLT1, облегченная диффузия, опосредованная GLUT2, становится доминирующим механизмом транспорта глюкозы через апикальную мембрану энтероцита (Kellett, 2001; Kellett, Brot-Laroche, 2005).

Поскольку экспериментальную основу гипотезы составляли данные, полученные в острых опытах in vivo, то есть в условиях, далеких от физиологических вследствие влияния наркоза и операционной травмы на функциональные характеристики тонкой кишки, казалось целесообразным проанализировать эту гипотезу в условиях хронического эксперимента на неанестезированных животных.

Результаты, полученные нами в хронических опытах, в ряде аспектов хорошо согласуются с данными других исследователей, полученными на анестезированных животных (Kellett, 2001; Au et al., 2003; Shepherd et al., 2004). В частности, мы обнаружили торможение флоретином (ингибитор GLUT2) всасывания глюкозы и галактозы в изолированной петле тонкой кишки крыс. Кроме того, данные, полученные в совместной работе с Я. Ю. Комиссарчиком и сотрудниками (Институт цитологии РАН) с применением иммуноцитохимического анализа, свидетельствовали о наличии меток к транспортеру GLUT2 и протеинкиназе С в области микроворсинок (в случае электронной микроскопии) и об увеличении плотности метки к GLUT2 в апикальной части кишечных клеток (в случае конфокальной микроскопии) после нагрузки изолированного участка тонкой кишки раствором глюкозы (75 мМ).

Вместе с тем мы получили также данные, которые плохо согласуются с упомянутой гипотезой. Так, мы не наблюдали ингибирования всасывания галактозы (50 мМ) в изолированной петле тонкой кишки в присутствии в инфузате 2-дезокси-0-глюкозы (50 мМ) — специфического субстрата для GLUT2. Кроме того, вопреки нашим ожиданиям, всасывание 2-дезокси-Т)-глюкозы (5 мМ) лишь незначительно возрастало после нагрузки изолированной кишечной петли в течение 40 мин раствором глюкозы (75 мМ).

Наличие этих противоречий позволяло предположить, что торможение флоретином всасывания глюкозы in vivo может быть обусловлено, по крайней мере частично, тем, что этот ингибитор способен / проникать в межклеточное пространство и препятствовать выходу глюкозы из энтероцитов через базолатеральную мембрану, что, в конечном счете, тоже должно приводить к снижению всасывания глюкозы в изолированной кишечной петле.

Для проверки этого предположения в опытах in vitro мы исследовали влияние флоретина и флоридзина, примененных с мукозной стороны, на транспорт глюкозы в эвертированных мешках тонкой кишки крыс. Оказалось, что в этих условиях флоретин, в отличие от флоридзина, действительно может тормозить выход глюкозы из энтероцитов. Кроме того, обнаружено, что флоретин способен неспецифически снижать всасывание глицина в изолированной петле в хронических опытах и активность ряда пищеварительных ферментов в гомогенатах слизистой оболочки тонкой кишки.

Таким образом, в целом результаты наших исследований подтверждают факт участия транспортера GLUT2 в переносе глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов in vivo при повышенных углеводных нагрузках. В то же время они свидетельствуют о том, что используемый рядом исследователей подход, основанный на ингибировании флоретином всасывания глюкозы в тонкой кишке in vivo, скорее всего дает завышенную оценку вклада облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2 (и, соответственно, заниженную оценку вклада активного транспорта с участием SGLT1) в общее всасывание глюкозы. Поэтому представление о преобладающей роли облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2 во всасывании глюкозы в тонкой кишке (Kellett, 2001; Kellett, Brot-Laroche, 2005), согласно нашим данным, далеко не бесспорно.

Пептидный транспорт. До начала нашей работы оставался дискуссионным и вопрос об относительной роли двух механизмов всасывания малых пептидов (трии дипептиды) в тонкой кишке млекопитающих: 1) в виде аминокислот, образующихся при мембранном гидролизе пептидов, с участием аминокислотных транспортеров- 2) в интактном (нерасщепленном) виде с участием пептидных транспортеров (обзоры: Adibi, 1975, 1997, 2003; Matthews, Payne, 1980; Matthews, 1987; Grimble, Silk, 1989; Тимофеева и др., 2000; Shimakura et al., 2006; Sala-Rabanal et al., 2006; Thwaites, Anderson, 2007b). Поскольку малые пептиды в значительном количестве образуются в полости желудочно-кишечного тракта в процессе полостного и мембранного гидролиза белков, выяснение этого вопроса важно для понимания механизмов их ассимиляции в организме млекопитающих. Доминировала точка зрения о всасывании малых пептидов преимущественно в интактном виде с участием пептидного транспортера.

Однако существовавшие до сих пор оценки в отношении роли пептидной составляющей базировались в основном на данных острых опытов in vivo. В связи с этим представлялось целесообразным провести соответствующие исследования в условиях хронического опыта. Кроме того, мы разработали и применили математические подходы, позволившие получить оценку «истинных» кинетических констант всасывания аминокислот и гидролиза и всасывания дипептидов, в том числе для пептидной составляющей. В итоге был проанализирован вклад пептидной составляющей во всасывание дипептидов в широком диапазоне концентраций субстратов.

К сожалению, оказалось весьма затруднительно сопоставлять определенные нами значения «истинных» Kt для всасывания свободных аминокислот или дипептидов в интактном виде с данными других авторов, полученными в опытах in vivo (Matthews et al., 1968; обзор: Matthews, Payne, 1980), поскольку в них определялись «кажущиеся» значения константы Михаэлиса (Kt*), которые, как правило, существенно больше «истинных». Вместе с тем наши данные достаточно близки к некоторым данным, полученным в опытах in vitro, в которых погрешность, обусловленная влиянием преэпителиального слоя, значительно меньше (Matthews, Payne, 1980). Для глицилсаркозина после коррекции «кажущейся» Kt (7.6 мМ) значение «истинной» Kt составило 6 мМ. Рассчитанные в наших опытах значения Kt для мембранного транспорта глицилглицина и глицил-Ь-лейцина (соответственно 4.4 и 4.8 мМ) хорошо согласуются с этим значением.

Согласно нашим расчетам, доля «пептидного» компонента в суммарном всасывании глицилглицина оказалась относительно постоянной (77.0 — 80.0%) во всем диапазоне исходных концентраций этого дипептида (2.5 — 40 мМ). При этом около 70% дипептида расщеплялось внутриклеточно, а 30% - в результате мембранного гидролиза. Однако в случае глицил-Ь-лейцина при увеличении исходной концентрации дипептида с 5 до 40 мМ доля «пептидного» компонента в результирующем всасывании глицина снижалась с 89.4 до 83.7%, а лейцина — с 86.0 до 71.2%. При этом доля внутриклеточного гидролиза глицил-Ь-лейцина снижалась с 83.1 до 62.9%. Соответственно, до 37.1% возрастала доля мембранного гидролиза этого дипептида. Зависимость доли «пептидного» компонента от концентрации субстрата в случае глицил-Ь-лейцина вероятно обусловлена довольно высоким значением Кт для мембранного гидролиза этого дипептида (37.3 мМ) по сравнению со значением Kt его мембранного транспорта в интактном виде (4.8 мМ).

Таким образом, результаты хронических экспериментов показали, что в условиях, близких к физиологическим, при относительно невысоких концентрациях субстратов (менее 40 мМ) пептидный компонент преобладает во всасывании исследованных дипептидов в тонкой кишке, что согласуется с данными, полученными ранее в условиях анестезии (обзор: Matthews, Payne, 1980). Вместе с тем роль «пептидного» компонента зависит от величины и соотношения кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида в интактном виде. В диапазоне высоких концентраций субстрата «пептидный» транспорт может достигать насыщения и его доля существенно снижаться, становясь сопоставимой с всасыванием свободных аминокислот, образующихся в результате мембранного гидролиза дипептидов.

6.2. Участие люмииальных факторов в регуляции гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке.

Субстратное регулирование всасывания нутриентов в изолированном участке тонкой кишки в хронических опытах. Как неоднократно отмечалось выше, прямое субстратное регулирование играет существенную роль в адаптивных перестройках систем, осуществляющих мембранный гидролиз и всасывание пищевых веществ в тонкой кишке. Однако, концепция субстратного регулирования базируется в основном на экспериментах, в которых об изменении концентрации субстратов можно судить весьма приблизительно. Методика хронических экспериментов обеспечивает возможность контроля концентрации субстрата в изолированной участке кишки.

В настоящей работе сопоставлялось влияние на функциональные характеристики изолированного участка тонкой кишки двух субстратных нагрузок (почти ежедневно в течение 1 ч): 1) раствором глюкозы, как в оригинальной методике, и 2) раствором глютаминовой кислоты или глютамина. Выбор в качестве регулярной субстратной нагрузки глютамина был обусловлен тем, что его присутствие в смесях для энтерального и парентерального питания положительно влияет на структурные и функциональные показатели слизистой оболочки тонкой кишки (Grimble, Silk, 1989; Salloum et al., 1991; Inoue et al., 1993; Rhoads et al., 1997; Souba, 1997; Reeds et al., 2000; Coeffier et al., 2003; Jiang et al., 2006). Ожидалось, что применение в качестве регулярной субстратной нагрузки для изолированного участка кишки глютаминовой кислоты, как первоисточника глютамина, тоже окажется более эффективным в отношении замедления его атрофии по сравнению с нагрузкой глюкозой.

Полученные нами данные показали, что ежедневная энтеральная нагрузка изолированной петли глютаминовой кислотой или глютамином, по сравнению с нагрузкой глюкозой, в большей степени способствует поддержанию в нем массы слизистой. Кроме того, в случае нагрузки глютаминовой кислотой по сравнению с нагрузкой глюкозой, наблюдались существенно большие скорости всасывания глицина, глицилглицина и глутаминовой кислоты в изолированной кишечной петле на фоне незначительного снижения всасывания глюкозы. Причем изменения во всасывании глицилглицина, глицина и глютаминовой кислоты происходили как за счет изменения массы слизистой в расчете на см2 площади всасывательной поверхности, так и за счет изменения способности энтероцитов к активному транспорту.

В наших опытах было обнаружено также неспецифическое действие нагрузки глютамином на активности ряда пищеварительных ферментов и концентрацию белка в изолированном участке кишки. После его нагрузки глютамином (по сравнению с нагрузкой глюкозой) отмечались снижение в этом участке кишки активности щелочной фосфатазы, аминопептидазы М и мальтазы, а также концентрации белка.

В целом, полученные в хронических опытах данные свидетельствуют об изменении транспортных характеристик изолированного участка тонкой кишки в соответствии с локальной субстратной нагрузкой и служат прямым доказательством концепции субстратного регулирования.

Участие желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания продуктов гидролиза углеводов в тонкой кишке.

Экспериментальные факты свидетельствуют об участии пищеварительных секретов в изменении гидролитических и транспортных активностей энтероцитов, а также численности клеточной популяции (Уголев, 1972, 1978; Karasov, Diamond, 1983, 1987; Адаптационно-компенсаторные процессы., 1991). Однако эти факты довольно противоречивы: Кроме того, ранее исследовалось, как правило, одновременное действие желчи и панкреатического секрета. В настоящей работе предпринята попытка выяснить, каким образом каждый из этих факторов влияет на всасывание углеводов в тонкой кишке. С этой целью изучался активный транспорт свободной глюкозы и глюкозы, входящей в состав углеводов различной степени полимерности (крахмал, мальтоза) в препаратах тонкой кишки in vitro через 7 и 14 дней после перевязки общего желчного протока у крыс или панкреатического протока у кроликов.

Полученные результаты показали, что при исключении желчи у крыс происходит расширение зоны интенсивного активного транспорта глюкозы в тонкой кишке в дистальном направлении, а при исключении панкреатической секреции у кроликов — повышение активного транспорта глюкозы в передних отделах тонкой кишки, где он обычно невелик. Обращало на себя внимание также то, что активный транспорт глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы, в этих отделах кишечника тоже возрастал, хотя и в меньшей степени, чем активный транспорт свободной глюкозы. Более того, после выключения панкреатической секреции у кроликов отмечалось сохранение на прежнем уровне (как в контроле, у интактных животных) активного транспорта глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала. Важно отметить, что эти закономерности, по крайней мере на первом сроке (через 7 дней), проявлялись при отсутствии повышения активности собственно кишечных мембранных ферментов: мальтазы и у-амилазы.

После исключения желчи и, в особенности, панкреатического секрета (панкреатических ферментов) в результате снижения а-амилазной активности следует ожидать снижения темпов полостного и мембранного пищеварения сложных углеводов, что влечет за собой снижение локальных концентраций продуктов полостного и мембранного гидролиза в тонкой кишке, в том числе концентрации глюкозы. Поэтому увеличение активного транспорта глюкозы в резервной зоне у крыс после выключения секреции желчи и в передних отделах тонкой кишки у кроликов после выключения панкреатической секреции, по-видимому, следует рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на поддержание на достаточно высоком уровне активного транспорта этого важного в энергетическом отношении моносахарида при его низких концентрациях в тонкой кишке.

6.3. Участие эндогенных факторов в регуляции гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке.

Действие наркоза на гидролиз и всасывание нутриентов.

Проведенное исследование позволило существенным образом продвинуться в понимании путей и механизмов действия таких факторов как наркоз и операционная травма (сопутствующих острым опытам т vivo) на интенсивность протекания гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке. Выяснение этого вопроса тесно связано с решением другой важной проблемы, касающейся выявления факторов, участвующих в быстрой регуляции гидролиза и всасывания пищевых веществ в тонкой кишке и определяющих их высокую эффективность при физиологических условиях.

Проведенный нами анализ действия наркоза базировался на результатах двух циклов экспериментов. В первом цикле опытов мы сопоставили «истинные» (с учетом влияния проницаемости преэпителиального слоя) кинетические параметры гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, определенные нами в тонкой кишке крыс в хронических опытах, с данными других авторов, полученными в острых опытах in vivo. При оценке «истинных» кинетических констант применялся разработанный нами математический подход, благодаря которому по результатам одной или двух (в случае глюкозы) серий хронических опытов удалось получить объективную количественную оценку как диффузионной проницаемости преэпителиального слоя, так и значений кинетических констант гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы.

По порядку величины определенные нами значения эффективной толщины неперемешиваемого водного слоя (около 40 мкм) оказались близкими результатам, полученным нами с помощью несколько иного подхода в предшествующих исследованиях (около 40 мкм) (Груздков, Громова, 1995; Громова, Груздков, 1999), а также значениям, определенным другими авторами в опытах на неанестезированных животных (около 40 мкм) (Strocchi, Levitt, 1991) или в исследованиях на людях (10 — 35 мкм) (Levitt et al., 1992; Pappenheimer, 2001). Однако эти значения были существенно ниже величин, определенных в острых опытах in vivo (Winne, 1973, Thomson, Dietschy, 1980; Westegaard et al., 1986). Эти данные свидетельствуют о том, что более высокие скорости гидролиза и всасывания нутриентов в тонкой кишке в хронических опытах по сравнению с острыми опытами in vivo могут быть обусловлены значительно лучшей проницаемостью преэпителиального слоя тонкой кишки вследствие отсутствия наркоза и операционной травмы (Груздков, Громова, 1995; Levitt et al., 1996).

Большое значение имеет тот факт, что в случае активного транспорта глюкозы величина константы Михаэлиса (Kt) в хронических опытах (около 3.2 мМ), укладывается в диапазон значений, рассчитанных другими авторами по данным острых опытов in vivo с учетом влияния преэпителиального слоя (0.8 — 5.0 мМ) (Westergaard et al, 1986; Pappenheimer, 2001), тогда как значение максимальной скорости активного транспорта глюкозы, Jmax, в хронических опытах (0.73 мкмоль • мин" 1 • см" 1) примерно в 3 раза выше, чем в острых опытах in vivo, согласно сводке в.

• 12 обзоре (Pappenheimer, 1990): 7.3±0.4 мкмоль • час" • см", что в пересчете составляет примерно 0.24 мкмоль • мин'1 • см" 1. • ,.

Эти данные позволяют сделать вывод о том, что наркоз и операционная травма, присущие острым опытам in vivo, приводят не только к снижению проницаемости преэпителиального слоя и соответствующему снижению гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, но и оказывают прямое ингибирующее влияние на мощность системы активного транспорта глюкозы.

В следующем цикле хронических опытов при исследовании изменения всасывания глюкозы в тонкой кишке крыс в условиях наркоза (нембутал или пропофол) при более высокой исходной концентрации субстрата (75 мМ) были получены прямые доказательства в пользу этого вывода. В случае использования низкой исходной концентрации глюкозы (25 мМ), то есть в таком диапазоне, когда скорость ее всасывания примерно пропорциональна проницаемости преэпителиального слоя, наркоз меньше влиял на скорость всасывания глюкозы.

Важным итогом этого цикла работ явились данные о том, что наркоз незначительно влияет на мембранный гидролиз мальтозы, но существенно снижает всасывание многих активно транспортируемых пищевых веществ (глюкоза, глицин, глицилглицин), использующих специфические системы транспорта через апикальную мембрану энтероцитов. Эти данные позволили сделать вывод о том, что действие наркоза на мембранный гидролиз мальтозы, по-видимому, главным образом опосредуется его влиянием на проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки. В то же время действие наркоза на активный транспорт моносахаридов, аминокислот и дипептидов, по-видимому, неспецифично. Возможно, оно связано с влиянием наркоза на уровень энергетического обмена в кишечных клетках, который на его фоне снижается. Поскольку, по данным литературы, при наркозе происходит изменение общего кровотока в тонкой кишке, а также его перераспределение между слизистой оболочкой, подслизистой основой и мышечным слоем (Gumbleton et al., 1990; Colombato et al., 1991; Uhing, Kimura, 1995a), можно предположить, что эти изменения приводят к ухудшению обеспечения энтероцитов кислородом, необходимым для осуществления эффективного активного транспорта пищевых веществ. Нельзя исключить и другое объяснение, выдвинутое на основании теоретического анализа взаимосвязи между всасыванием глюкозы и кровотоком в капиллярах (Pappenheimer, Michael, 2003). Согласно результатам этого анализа, при наркозе ухудшается кровоток в капиллярах кишечных ворсинок и возрастает концентрация глюкозы в межклеточном пространстве, что затрудняет ее транспорт из энтероцитов через базолатеральную мембрану и, как следствие, снижает ее результирующий трансэпителиальный перенос.

Таким образом, полученные нами результаты в совокупности с данными литературы позволяет думать, что одним из важных факторов, обеспечивающих высокие скорости всасывания нутриентов в тонкой кишке в хронических опытах (то есть в отсутствие наркоза и операционной травмы), является, по-видимому, эффективное кровоснабжение слизистой оболочки тонкой кишки.

Влияние голодания на всасывание пищевых веществ в тонкой кишке. Изучение этой проблемы имеет большой теоретический интерес в связи с тем, что реакции систем всасывания на голодание отражают одновременное действие двух факторов: изменения со стороны люминальных субстратов и изменения со стороны системных (эндогенных) факторов, сопутствующих голоданию.

В последние десятилетия адаптация всасывания пищевых веществ к голоданию исследовалась довольно интенсивно, однако сведения, имеющиеся в литературе, весьма противоречивы. Возможно, это связано с тем, что в работах разных авторов использовались различные экспериментальные подходы, способы расчета и сроки голодания, а также животные разных возрастных групп и разные виды голодания (полное, частичное или преимущественно белковое) (обзор: Karasov, Diamond, 1983).

В настоящей работе сопоставлялись результаты, полученные при исследовании влияния голодания и безбелкового высокоуглеводного рациона на всасывание различных субстратов в препаратах тонкой кишки крыс в опытах in vitro, а также в хронических опытах in vivo, что позволило внести определенный вклад в решение этой проблемы.

При исследовании в опытах in vitro активного транспорта глюкозы или галактозы (использующей общую с глюкозой систему активного транспорта через апикальную мембрану энтероцитов) в тонкой кишке крыс отмечено повышение активного транспорта глюкозы (в расчете на длину препарата кишки) при белковом голодании (содержании животных в течение 7 и 14 суток на высокоуглеводном безбелковом рационе) и отсутствие изменений в активном транспорте галактозы при полном голодании в течение 3 и 5 сутокЭти данные позволили заключить, что в случае безбелкового высокоуглеводного рациона активный транспорт глюкозы регулируется в соответствии с уровнем углеводной нагрузки. Однако даже в отсутствие люминальной нагрузки (при полном голодании) активный транспорт глюкозы в энтероцитах сохраняется на довольно высоком уровне, что, по-видимому, обусловлено существованием эндогенного контроля. Вместе с тем в этих экспериментах было обнаружено, что активность транспортных систем энтероцитов в отношении аминокислот и дипептидов возрастает при обоих видах голодания. Это связано, вероятно, с тем, что в отсутствие экзогенного белка указанные субстраты, продолжающие поступать в полость тонкой кишки в составе пищеварительных соков и десквамируемого эпителия, более эффективно используются для питания организма.

Результаты, полученные нами при исследовании всасывания ряда пищевых субстратов в хронических опытах на крысах, содержавшихся на безбелковом высокоуглеводном рационе, в ряде случаев хорошо согласуются с данными, полученными нами в опытах in vitro. В частности, в конце 2-х недельного содержания крыс на безбелковом высокоуглеводном рационе мы наблюдали увеличение всасывания глицина и отсутствие существенных изменений во всасывании свободной глюкозы, что соответствует данным, полученным нами на аналогичном сроке при анализе активного транспорта указанных веществ в опытах in vitro.

Вместе с тем исследование временной динамики гидролиза и всасывания различных нутриентов показало сложную картину развития адаптационного процесса в отношении таких активно транспортируемых субстратов как глюкоза, глицин, глицилглицин. Оказалось, что всасывание каждого из них изменяется разнонаправлено на разных сроках голодания. Интересно, что гидролиз мальтозы и всасывание образующейся глюкозы изменялись только на пятые сутки белкового голодания. Эти результаты свидетельствуют об участии эндогенных факторов, сопутствующих голоданию, в регуляции процессов всасывания в данных условиях и относительной устойчивости к некоторым из этих факторов процессов мембранного гидролиза. Отсутствие сходных изменений во всасывании свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы, по-видимому, связано с тем, что при всасывании «мальтозной» глюкозы лимитирующим звеном является мембранный гидролиз дисахарида.

Сложная зависимость всасывания глюкозы, глицина, гидролиза и всасывания глицилглицина в хронических опытах от сроков содержания животных на безбелковом высокоуглеводном рационе позволяет объяснить некоторые противоречия, существующие между результатами разных авторов.