Генетическая трансформация половых клеток животных

Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген. В этом случае животное будет химерным (т. е. клетки разных тканей будут иметь разный генотип).

Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток или зиготы, которые передадут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки разных животных, в том числе млекопитающих и мух.

Существует две основные схемы создания трансгенных животных: микроинъекция чужеродной ДНК и введение генетической конструкции в эмбриональные стволовые клетки.

Микроинъекция чужеродной ДНК. Первая попытка была сделана американским ученым Дж. Гордоном в 1980 г. Методом микроинъекции он ввел в оплодотворенную яйцеклетку мыши рекомбинантную плазмиду pBR322, которая содержала ген тимидинкиназы вируса герпеса и фрагмент генома вируса SV40, вызывающего опухолевую трансформацию. В дальнейшем в геном мыши и других животных удалось ввести гены интерферонов, гормона роста человека и ряд других.

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши (рис. 4.13). Чаще выбирают мужской пронуклеус. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной (суррогатной) матери или дают ей возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Для отбора трансгенных особей (несущих введенный ген) проводят молекулярно-генетический анализ родившегося потомства. Скрещивая трансгенных животных, можно получить чистые (гомозиготные) трансгенные линии.

Недостатком технологии создания трансгенных животных путем микроинъекции генетических конструкций в пронуклеус яйцеклетки является ее трудоемкость и малоэффективность: полного развития достигает менее 1−5% зигот.

Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение. Таким образом были введены гены интерферона и инсулина человека, ген р-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей.

Рис. 4.13. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций (по Б. Глику и Дж. Пастернаку, 2002). Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъекцируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в суррогатную мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей трансгенных линий.

Введение

генетической конструкции в эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Впервые культивируемые линии ЭСК из бластоцист мыши (рис. 4.14) были получены Эвансом, Кауфманом и Мартином в 1981 г. Позже аналогичные линии были получены из бластоцист других млекопитающих: золотистый хомячок (1988); свинья, овца (1990); корова, норка (1992); кролик (1993); крыса (1994); обезьяна (1995) и даже человек (1994).

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обычно получают из бластоцист. Когда число клеток (бластомер) эмбриона не превышает восьми, они являются недифференцированными, плюрипотентными (тотипотентными), т. е. способны дифференцироваться в любые типы клеток, включая клетки зародышевой линии, и каждая из них может дать начало новому организму. Эти клетки можно культивировать in vitro и после введения в них необходимого трансгена ввести в другой эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать в матку суррогатной матери, производящей потомство. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных животных.

В отличие от предыдущего, этот метод позволяет проанализировать встраивание трансгена в геном клетки на стадии бластоцисты и проверить его экспрессию, что дает возможность выбрать линию ЭСК с наилучшими свойствами. Часть этих клеток можно заморозить в жидком азоте и хранить многие годы для последующего создания трансгенных животных.

Такой путь получения трансгенных животных выгоден еще и тем, что используются не зиготы, а бластоцисты. Их легко получить нехирургическим путем из половых путей самок крупных видов млекопитающих и трансплантировать суррогатным матерям для рождения трансгенных животных — основателей трансгенных линий.

Создание трансгенных животных — очень сложный и трудоемкий процесс. По статистике одно трансгенное животное удается получить на 40 инъецированных зигот мыши, на 100 зигот овцы или козы, на 1500 зигот коровы. К тому же это и неоднозначный процесс. Так как интеграция.

Рис. 4.14. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (по Б. Глику и Дж. Пастернаку, 2002). ЭСК получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, культивируют и идентифицируют трансформированные клетки методом позитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансформированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку суррогатных матерей. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей чужеродных генов носит случайный характер, могут быть повреждены соседние гены реципиента. Из трансгенных животных не более 50% экспрессируют трансгенный белок, не у всех животных чужой ген попадает в половые клетки, т. е. способен передаваться потомству.