Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека в клетках млекопитающих

Фактор свертывания крови VIII (FVIII) — это неэнзиматический кофактор фактора 1Ха, который при протеолитической активации образует с фактором 1Ха плотный нековалентный комплекс, связывающий и активирующий фактор X. Данный комплекс белков является основным элементом петли положительной обратной связи в каскаде свертывания крови. Дефекты гена FVIII могут приводить к развитию гемофилии, А — X-связанного рецессивного генетического заболевания с частотой встречаемости около 1 случая на 5000 мужчин. Около половины всех случаев гемофилии, А вызваны инверсиями в интроне 22 гена FVIII [1], еще около 5% - инверсиями в интроне 1. По состоянию на июнь 2012 года было описано 1492 различные мутации гена FVIII, проявляющиеся как гемофилия, А [2].

Единственной эффективной терапией гемофилии, А является регулярно проводимая заместительная терапия лекарственными препаратами FVIII. Традиционный источник FVIII — это донорская плазма крови, количество которой ограничено. Кроме того, использование донорской плазмы в качестве сырья для получения терапевтических белков связано с риском передачи пациентам вирусных [3- 4] и прионных [5] инфекций даже после тщательного скрининга единиц заготовленной плазмы и множественных процедур вирус-инактивации. Рекомбинантный фактор VIII человека для терапии гемофилии, А может быть получен при помощи культивируемых клеток млекопитающих, очищен до фармакопейных показателей при помощи аффинной хроматографии и трех-четырех стадий обычной хроматографии и подвергнут вирус-инактивации при помощи обработки детергентом и растворителем, а также нанофильтрации или прогревания. Допущенные к медицинскому применению варианты рекомбинантного FVIII человека были получены при помощи культур клеток яичника китайского хомячка (СНО) или почки новорожденного хомяка (ВНК) и полностью эквивалентны FVIII из донорской плазмы при проведении заместительной терапии.

Основным недостатком существующих методов получения рекомбинантного FVIII человека является крайне низкий уровень экспрессии, вызванный большим размером целевого белка и сложным набором пост-трансляционных модификаций. При удалении домена В, составляющего значительную часть молекулы FVIII, удельная прокоагулянтная активность FVIII и его период полураспада в плазме крови практически не падают [6]. Замена домена В на короткий линкерный пептид, обозначаемый как SQ, приводит к существенному увеличению уровня продукции FVIII в клетках СНО и почти полному протеолитическому процессингу белка-предшественника до зрелой двухцепочечной формы. [7]. Медицинский препарат фактора VIII с делецией домена В (FVIII BDD SQ) был допущен к медицинскому применению под торговым названием «Рефакто" — его показатели эффективности и безопасности были аналогичны таковым для препаратов полноразмерного рекомбинантного FVIII человека [8]. Типичный уровень продуктивности для клеток линии СНО, продуцирующих FVIII BDD SQ составлял 0.5−1 МЕ/мл по данным [7]- в независимо проведенной работе [9] для наилучшего клонального продуцента BDD-FVIII был зафиксирован сходный уровень продуктивности 0.5−2 МЕ/(1 млн клт * д), что соответствует концентрации FVIII около 0,2 мкг/мл и на несколько порядков уступает продуктивности промышленных продуцентов других рекомбинантных факторов свертывания крови (VII, IX).

Получение линий клеток-продуцентов с существенно большим уровнем секреции биологически активного рекомбинантного FVIII человека является актуальной практической задачей, результаты решения которой будут востребованы современной биофармацевтикой и могут быть использованы для получения промышленно пригодных систем экспрессии других фармацевтически значимых белков.

Создание новых генетических конструкций для гетерологичной экспрессии биотехнологически важных белков имеет не только прикладное, но и фундаментальное значение. Современные подходы, связанные с дизайном регуляторных последовательностей гена, кодирующего интересующий белок, позволяют существенно улучшить уровень экспрессии последнего. Оптимизация условий гетерологичной экспрессии и методов очистки целевого белка также может давать свои практические результаты.

В настоящей работе мы сосредоточились на указанных выше направлениях целью получения технологически оправданных количествах фактора VIII для медицинских целей.

Выводы.

1. Создана генетическая конструкция для экспрессии полипептида структурного варианта фактора VIII с делетированным В-доменом, соответствующего разрешенному к применению в клинической практике белку. Установлено, что при использовании стандартного плазмидного вектора на основе промотора цитомегаловируса (CMV) и кДНК дигидрофолатредуктазы могут быть получены линии-продуценты фактора VIII с уровнем секреции 0,5 МЕУмл. Амплификация созданной трансгенной конструкции в геноме клеток CHO-DG44 под действием метотрексата позволяет увеличивать продуктивность в 2,3 раза по целевому белку.

2. Для стабильной экспрессии гетерологичных белков с высоким уровнем на основе нетранслируемых областей гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка и фрагмента конкатемера концевого повтора вируса Эпштейна-Барр создан специализированный вектор pl.I. На модельном белке (eGFP) показано, что конструкции на основе созданного вектора интегрируются в геном клеток CHO-DG44 с высокой эффективностью. Использование данной системы позволяет многократно увеличивать уровень экспрессии целевого гена при амплификации под действием метотрексата и обеспечивает постоянный уровень экспрессии целевого гена в течение длительного времени.

3. При трансфекции клеток линии CHO-DG44 генетической конструкцией состоящей из вектора pl. I и кДНК фактораVIII с делетированным В-доменом при одностадийной селекции получены клональные линии-продуценты фактора VIII с продуктивностью 5−10МЕ/мл, что не уступает известным мировым аналогам. После многостадийной амплификации трансгенной конструкции под действием метотрексата получена стабильная клональная линия-продуцент делеционного варианта фактора VIII11А4Н, секретирующая фактор VIII в концентрации 39 МЕ/мл, что существенно превосходит известные показатели для промышленных продуцентов данного белка. Таким образом, установлено, что увеличение уровня мРНК фактора VIII является достаточным для многократного повышения уровня его секреции трансфицированными клетками СНО.

4. Разработаны подходы к очистке и характеризации рекомбинантного фактора VIII человека. Методом скрининга библиотек химических соединений in silico отобраны кандидатные молекулы, потенциально пригодные для аффинной очистки фактора VIII. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела, позволяющие проводить аффинную очистку активного фактора VIII. Разработана пятистадийная схема очистки фактора VIII, секретируемого линией 1А4Н. Получаемый этим методом гомогенный препарат обладает удельной активностью 11тыс. МЕ/мг, что соответствует данным для известных лекарственных препаратов на основе рекомбинантного фактора VIII.

Заключение

.

В настоящей работе рассмотрены способы получения высокопродуктивной линии-продуцента фактора свертывания крови VIII с делецией области В-домена и описаны возможные варианты лигандов для проведения аффинной очистки фактора VIII.

При генерации линий-продуцентов фактора VIII с помощью общепринятых плазмидных векторов с промотором цитомегаловируса нами было установлено, что уровень секреции полноразмерного фактора VIII в безбелковую культуральную среду значительно ниже, чем уровень секреции В-домен делетированного варианта. При амплификации трансгена в геноме клеток-продуцентов под действием метотрексата уровень секреции функционально активного делеционного варианта фактора VIII был доведен до 0,5 МЕ/мл, при этом было обнаружено, что общая эффективность процесса амплификации для генетической конструкции с областью ОРС фактора VIII невысока, несмотря на использование бицистронной матрицы, кодирующей целевой белок и селекционный маркер. Продуктивность полученной системы экспрессии соответствовала имеющимся литературным данным, полученным ранее для векторов, кодирующих раздельные мРНК фактора VIII и селекционного маркера. Было предположено, что относительно низкий уровень экспрессии гена фактора VIII в клетках СНО может быть существенно увеличен при переносе открытой рамки считывания фактора VIII в специально сконструированный плазмидный вектор, включающий протяженные регуляторные области гена домашнего хозяйства китайского хомячка, фрагмент концевого повтора вируса, увеличивающий частоту интеграции кассеты в геном и как можно более короткий участок ДНК, необходимый для наработки плазмиды в бактериях. Согласно литературным данным, высокий и постоянный уровень экспрессии целевых генов наблюдался при переносе их ОРС в контекст гена фактора элонгации трансляции 1 альфа (EEF1A1), однако векторы на основе данного гена были практически непригодны для амплификации трансгена в геноме продуцентов и обладали довольно низкой частотой интеграции в геном.

Нами были последовательно решены вспомогательные задачи по получению «нетранскрибируемого» плазмидного вектора минимального размера и молекулярному клонированию протяженных фрагментов гена EEF1A1. При помощи полученных фрагментов был сконструирован плазмидный вектор pl. l для трансфекции клеток млекопитающих. На примере ОРС модельного флуоресцентного белка eGFP, клонированной в вектор pl. l, были найдены условия проведения трансфекций клеток линии СНО и амплификации трансгена в геноме продуцентов, позволяющие за короткое время создавать продуктивные и стабильные линии-продуценты.

Генетическая конструкция pl. l-F8BDD, кодирующая делеционный вариант фактора VIII, была трансфицирована в клетки СНО по разработанной методике, что позволило получить олигоклональные линии-продуценты фактора VIII с продуктивностью 5−10МЕ/мл при помощи одной-двух стадий селекции и амплификации. Обнаруженный уровень продуктивности не уступал мировым результатам, достигнутым для клональных линий-продуцентов, полученных многостадийным отбором. При дальнейшей амплификации трансгена возрастающими концентрациями метотрексата и последующей генерации клональных линий были получены линии с продуктивностью до 39 МЕ/мл и проведен их молекулярный анализ, продемонстрировавший высокую копийность трансгена и высокий уровень мРНК целевого гена при отсутствии значимого числа аберрантных копий целевого гена. Таким образом, повышение уровня мРНК FVIII в клетках-продуцентах является достаточным условием для многократного увеличения уровня секреции функционально активного фактора VIII в безбелковую культуральную среду, позволяющего вести его экономически обоснованный промышленный выпуск.

Поскольку медицинское применение препаратов фактора VIII предполагает его полную очистку от белков продуцента, нами была исследована возможность обнаружения низкомолекулярных лигандов, специфически связывающих FVIII, методами скрининга библиотек химических соединений in silico, а также получена панель моноклональных антител, узнающих эпитопы в составе тяжелой цепи FVIII и пригодных для адсорбции FVIII из культуральной среды и практически полной десорбции функционально активного FVIII.

Созданный в ходе настоящей работы плазмидный вектор pl. l и исследованные методы его применения могут быть использованы для получения высокопродуктивных клеточных линий, секретирующих фармацевтически значимые белки.