Актуальность проблемы. Класс морских звезд (Asteroidea), относящийся к типу иглокожих (Echinodermata), состоит из более чем 1500 видов. Свыше 100 видов морских звезд обитают в Японском, Охотском и Беринговом морях, причем здесь они являются ведущими видами в биоценозах. Многие морские звездыхищники, они наносят существенный вред подводным плантациям моллюсков, а в тропиках и коралловым рифам. Поэтому в некоторых морских районах существует необходимость ограничения численности этих животных и их утилизации.
Морские звезды отличаются от других животных большим разнообразием стероидных соединений. В них присутствуют различные группы этих веществ, но особое внимание привлекают окисленные стероидные соединения, к которым относятся полигидроксистероиды, гликозиды полигидроксистероидов, астеросапонины — стероидные олигогликозиды с пятью — шестью моносахаридными остатками, и другие родственные им вещества.
В основном интерес к окисленным стероидным соединениям морских звезд объясняется их разнообразной физиологической активностью. Экстракты морских звезд и индивидуальные вещества, выделенные из них, проявляют антивирусные, антимикробные, анальгетические, противовоспалительные, гипотензивные и другие биологические свойства. Окисленные стероиды играют определенную экологическую роль, являясь алломонами — веществами, отпугивающими многих морских животных: двустворчатых и брюхоногих моллюсков, морских ежей, лилий, актиний.
Кроме того, эти соединения часто имеют своеобразное химическое строение, значительно отличаясь от стероидных метаболитов наземных растений и животных. Изучением строения и свойств окисленных стероидных соединений морских звезд помимо нашей лаборатории (лаборатория химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН) занимаются научно-исследовательские группы из университетов Неаполя (Италия), Сантьяго де Компостелла (Испания), Фукуоки (Япония) и ряда других стран, а статьи, посвященные этой теме, публикуются в ведущих научных журналах мира.
К началу 80-х гг., когда были начаты наши исследования, из окисленных стероидных соединений морских звезд были известны только высокополярные «классические» астеросапонины, для которых характерно наличие сульфатированного стероидного агликона с Д9(11двойной связью и Зр, 6а-диольной группировкой.
Целью данной работы является изучение структур и биологической роли низкомолекулярных полярных стероидов, в основном, полигидроксистероидов (число гидроксильных групп в них колеблется от четырех до девяти), монозидов и биозидов полигидроксистероидов, дисульфатированных стероидов и близких к ним по полярности сульфатов и монозидов астерогенинов. Знание химического строения этих соединений может использоваться в дальнейшем для изучения строения и зависимости структура — активность для подобных стероидов, прогнозирования возможной физиологической активности новых соединений, выявления полезных свойств этих веществ и формирования предложений по их практическому использованию. Кроме того, результаты такого рода исследований важны для понимания биологических функций окисленных стероидов, а также изучения их экологической роли в морских биоценозах.
Задачами настоящей работы были:
— выделение большой серии новых полярных стероидов из морских звезд, установление их структуры и изучение их свойств, включая биологическую активность;
— изучение зависимости состава окисленных стероидных соединений морских звезд от места их обитания;
— изучение распределения окисленных стероидных соединений, в том числе полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, в различных частях тела морских звезд и сезонных изменений в содержании этих соединений с целью выяснения их биологической роли.
Научная новизна работы. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд было выделено 76 окисленных стероидных соединений. Установлено строение 50 новых соединений и проведена структурная идентификация 26 веществ с известными ранее веществами.
Впервые были выделены гликозиды полигидроксистероидов с (1—>5) и (1—>6) гликозидными связями в углеводных цепях, а также гликозиды, содержащие редкие моносахариды: галактофуранозу, 2,3-ди-О-метилксилопиранозу, 5 «бисульфат З-О-метиларабинофуранозу и 2-О-сульфат арабинофуранозу.
Впервые в окисленных стероидах морских звезд обнаружены необычные фрагменты: 23-кето-24-гидроксихолестановая, 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая и 28,29-дигидрокси-24-пропилхолестановая боковые цепи, а также 24-гликозилированная 24,26-дигидроксихолестановая боковая цепь, сочетающая одновременно структурные признаки гликозидов и свободных полигидроксистероидов.
Найдена новая структурная серия стероидных соединений морских звезд, названных нами алкалоидостероидами. Эти соединения представляют собой ионные гибриды, состоящие из окисленного стероидного аниона и алкалоидного катиона.
Выполнены биологические испытания полигидроксистероидов и родственных гликозидов и показано, что они проявляют гемолитические и цитотоксические свойства. Установлено, что левискулозид L обладает канцерпревентивным действием, а 'астеросапонин' Pj и его десульфатированное производное способны формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Показано, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов могут активировать Р-1,3-D-глюканазу из моллюска Spisula sachalinensis, а некоторые астерогенины — оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска.
Изучено распределение полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в различных частях тела морской звезды. Показано, что свободные стерины и астеросапонины присутствуют во всех изученных тканях животных, а полигидроксистероиды и гликозиды полигидроксистероидов — только в органах пищеварения — желудке и пилорических выростах. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морской звезде. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, и их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. Исходя из этого, а также на основании сходства их химического строения и свойств с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека сделано предположение, что одной из биологических функций полигидроксистероидных соединений является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам у более высокоразвитых животных.
Изучены сезонные изменения в составе суммарной фракции полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах, принадлежащих к одной популяции. Показано, что в течение года состав этих веществ является довольно постоянным, несмотря на незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одного и того же вида морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений у них различен и зависит от места сбора животных.
Публикация результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в научных журналах: Химия природных соединенийБиоорганическая химияИзвестия Академии наук, серия химическаяTetrahedron LettersJournal of Natural Products (Lloydia) — Comparative Biochemistry and Physiology, В. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в материалах отечественных и международных конференций и симпозиумов. По теме диссертации опубликованы 53 работы, в том числе 33 научных статьи.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного строению, биогенезу, биологическим свойствам и функциям стероидных соединений морских звезд, Обсуждения результатов, где приведены и обсуждены полученные результаты, и Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал,.
5. ВЫВОДЫ.
1. Разработаны способы выделения суммарных фракций и индивидуальных окисленных стероидных соединений из спиртовых экстрактов морских звезд. Они включают применение гидрофобной, гельпроникающей и адсорбционной колоночной хроматографии с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией на прямой и обращенной фазах.
2. Из спиртовых экстрактов 14 видов морских звезд выделено 76 полярных стероидных соединений. Проведена структурная идентификация 26 соединений с известными веществами и установлено химическое строение 50 новых соединений, из них 11 полигидроксистероидов, 26 гликозидов полигидроксистероидов, 10 сульфатов и монозидов астерогенинов и 3 стероидных дисульфата.
3. Из морских звезд выделены представители новой группы стероидных солей, состоящих из стероидного аниона и алкалоидного катиона, названные нами алкалоидостероидами. Их строение было установлено.
4. Найдены и структурно изучены редкие в морских звездах стероидные гликозиды с (1—>5) и (1—>6) гликозидными связями между моносахаридными остатками. Впервые выделены гликозиды с остатками редких моносахаридов: галактофуранозы, 2,3-ди-(9-метилксилопиранозы, 5−0-сульфат 3−0-метиларабинофуранозы и 2−0-сульфат арабинофуранозы, а также с 24−0-гликозилированной 24,26-дигидрокси боковой цепью.
5. Впервые в полярных стероидах обнаружены такие структурные фрагменты как 23-кето-24-гидроксихолестановая, 28,29-дигидрокси-24-пропилхолестановая и 29-сульфат 28,29-дигидрокси-24-этилхолестановая боковые цепи.
6. Показано, что, гемолитическая и — цитотоксическая активности полигидроксистероидов и родственных веществ зависят от химической структуры, рН, температуры и ионной силы среды. Для 'астеросапонина* Р| обнаружен кардитонический эффект, характерный для сердечных растительных гликозидов. Получены данные о его способности формировать ионные каналы в модельных липидных мембранах. Установлено, что некоторые гликозиды полигидроксистероидов способны активировать р-1,3-/)-глюканазу из моллюска Spisula sachalinensis, а некоторые астерогенины оказывать стимулирующий эффект на сердце этого же моллюска. У левискулозида G обнаружена способность тормозить канцерогенез, вызванный действием опухолевых промоторов.
7. Показано, что свободные стерины и астеросапонины присутствуют во всех изученных частях тела морских звезд, в отличие от полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов, найденных только в органах пищеварения — желудке и пилорических выростах.
8. Изучены сезонные изменения содержания полигидроксистероидов и гликозидов полигидроксистероидов в морских звездах. Установлено, что эти соединения присутствуют в органах пищеварения животных постоянно на протяжении всего года, а их максимальная концентрация совпадает с периодами активного питания зимой, во время посленерестовой перестройки, и летом, в период интенсивного гаметогенеза перед нерестом. Исходя из полученных данных, а также на основании сходства химического строения и свойств полигидроксилированных стероидных соединений с желчными спиртами и кислотами рыб, амфибий, высших животных и человека высказано предположение, что одной из основных биологических функций этих веществ является их участие в переваривании пищи подобно желчным спиртам и кислотам у позвоночных.
9. Показано, что в течение года состав низкомолекулярных полярных стероидов в морских звездах из одной и той же популяции остается довольно постоянным, хотя наблюдаются незначительные сезонные колебания в относительном содержании соединений. При сравнении разных популяций одних и тех же видов морских звезд установлено, что состав окисленных стероидных соединений может изменяться, и зависит от места их обитания. т я t ш.