Исследование биофизических процессов в сенсибилизированной жировой ткани при воздействии лазерного и светодиодного излучения

Настоящая работа относится к фотобиологии животной клетки, она посвящена экспериментальному изучению влияния световых потоков видимого и ближнего ИК диапазонов на клетки сенсибилизированной жировой ткани in vitro и in vivo.

Исследования последних десятилетий позволили по-новому взглянуть на причины и механизмы развития многих заболеваний, прежде всего таких социально значимых, как атеросклероз и ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, сахарный диабет 2-го типа, болезни печени, ортопедических заболеваний, ряд онкологических заболеваний (липома, липосаркома и т. п.). Получены убедительные доказательства взаимосвязи этих заболеваний с избыточным накоплением жира в организме, т. е. с ожирением. В этой связи возрос интерес к изучению функций жировой ткани и их роли в норме и при патологии, а также к разработке способов удаления избыточных отложений [1, 2, 3]. В настоящее время общепризнано, что жировая ткань играет большую роль в метаболической регуляции как энергетического равновесия в организме, так и сосудистого гомеостаза. Однако она не пассивный проводник, служащий для сохранения и расходования энергии, отвечающий за сдвиги в энергетическом балансе. Несмотря на кажущуюся нежелательность жира, жировая ткань выполняет много очень важных физиологических функций [4, 5]. Знание этих функций необходимо не только для понимания патогенеза ожирения и связанных с ним заболеваний, но и для их эффективной профилактики и лечения.

Ожирение, как правило, лечится диетой, физическими упражнениями и уменьшением слоя подкожной жировой клетчатки с помощью пластической хирургии, липосакции, ультразвуковой и лазерной терапии. Благодаря быстрому темпу жизни современного общества, многим трудно поддерживать здоровую диету и регулярно заниматься спортом, чтобы предотвратить ожирение. В связи с этим предпочтение отдается инвазивным процедурам.

Инвазивные процедуры являются объектом риска для пациента из-за инфекций, кровотечения, риска здоровью при анестезии и других послехирургических осложнений. Липосакция подразумевает введение в жировые слои зондов около 5 мм в диаметре через отверстия в коже для удаления жировой ткани. Недостатки липосакции включают создание видимых неоднородностей в виде углублений в зоне введения зонда, чрезмерное кровотечение и неселективное удаления клеток жира и стромы. В результате лазерной липосакции клетки гибнут по пути некроза и на теле могут остаться рубцы или синяки. Явным эффектом лазерного воздействия является нагрев не только жировой ткани, но и её окружения. Важным является вопрос поддержания физиологической температуры во время проведения процедур лазерной липосакции.

В настоящее время ведутся активные поиски новых оптических технологий, позволяющих селективно разрушать жировую ткань. Одним из самых простых способов физического воздействия на жировые клетки, является гипертермия [6, 7, 8, 9, 10, 11]. Известны методы селективного нагрева подкожной жировой ткани оптическим, в том числе лазерным, излучением [10]. В ряде случаев, оптический нагрев активизирует кровообращение и биологические рецепторы, в зону воздействия привлекаются макрофаги, которые утилизируют разрушенные жировые клетки [12, 13, 14]. Создание новых лазерных источников стимулирует интерес к исследованию взаимосвязей между параметрами лазерного излучения и оптическими свойствами жировой ткани.

ИК лазерное излучение обладает селективным тепловым воздействием на жировую ткань, что обусловлено достаточно сильными полосами поглощения липидов на 915, 1210 и 1720 нм. [10, И, 12, 13, 14, 15].

Лазерная липосакция / липопластика или лазерный липолиз является одним из современных способов удаления жировых отложений. Лазерный липолиз, основанный на тепловых процессах (селективный фототермолиз), позволяет локально нагревать и разрушать жировые клетки, оставляя их в сжиженном состоянии, что облегчает их удаление из тела с помощью специальных устройств или за счет естественного метаболизма жиров. Процедура лазерной липосакции проводится с помощью тонкого оптико-волоконного лазерного зонда, который вводится под кожу [12, 13, 14, 15,16,17,18,19,20,21,22]. Головка эюго зонда излучает высоко интенсивное излучение. Под действием этого лазера происходит селективное разрушение жировых клеток.

Гистологический анализ воздействия Nd: YAG лазера (1060 им) и CW диодного лазера (980 нм) на жировой клетки человека показали обратимое повреждение клеток (набухание клеток), а также необратимые повреждения (лизис клеток) [20, 22].

Механизмы, приводящие к лазерному липолизу, зависят от температуры. Во-первых, при низкой энергии лазерного излучения и, следовательно, низкого повышения температуры, наблюдалось только набухание аднпоцитов [20]. При использовании более высокой энергии лазерного излучения, гистологическая оценка, выполненная в работе [17] на образцах ткани, взятых после воздействия, показала разрыв жировых клеток, а также коагуляцию мелких сосудов в жировой ткани. Так как тепло концентрируется внутри адипоцитов, это приводит к разрыву его мембраны. Эффект получается не только тепловой, но и термомеханический.

Более того, степень набухания и лизис изменялись пропорционально количеству накопленной энергии. Конвекционная липосакция вызывает больше необратимых повреждений, чем лазерный липолиз с использованием света с энергией 1000 Дж [20]. Для лазера с длиной волны 1064 нм и энергией лежащей в диапазоне от 1000 Дж до 12.000 Дж, было отмечено, что чем выше энергия, тем больший объем ткани был подвержен сокращению [16]. Обычно, сокращение объема 5 см³ жира наблюдается при 3000 Дж, 20 см³ при 12.000 Дж. Все эти исследования ясно показывают, что при лазерном липолизе должны учитываться два основных параметра: 1) длина волны, так как взаимодействие лазера с тканью достигается за счет поглощения лазерной энергии светочувствительными хромофорами, создавая достаточное количество тепла в жировой ткани, чтобы вызвать желаемые термические повреждения- 2) используемая энергия, так как существует взаимосвязь доза-реакция [16, 23]. Тепловые эффекты па жировые клетки и внеклеточный матрикс вызывают как обратимые, так и необратимые повреждения клеток. Это делает лазерную липосакцию менее травматичной и с малыми кровопотерями, по сравнению с традиционной липосакцией. Основным результатом лазерного липолиза является некроз адипоциюв. Некроз — процесс необратимый, характеризуется разрывом цитоплазматической и внутри клеточных мембран [24, 25, 26, 27, 28, 29]. Это приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу цитоплазмы в межклеточное пространство. При относительно благоприятном исходе вокруг омертвевших тканей возникает реактивное воспаление, которое отграничивает мертвую ткань. В таких случаях образуется рубец. В отличие от некроза при ano птозе воспаления окружающих тканей не наблюдается. Ano птоз — это форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду [23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец («апоптотические тельца»), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Другой метод оптического разрушения жировых тканей, а именно фотодинамический / тепловой метод (ФД / ТМ), может обеспечить снижение региональных или специфичных скоплений внутрибрюшпой или подкожной жировой ткани наименее инвазивным путем, вызывая апоптоз клеток или контролируемой некроз небольшого количества жировой ткани [36, 37]. В частности, это связано с использованием локализованного оптического (лазерного) излучения соответствующей длины волны и мощности, которые также могут быть объединены в сочетании с окрашиванием локализованных специфических жировых отложений и / или применением линолитических агентов, приводя к неинвазивному и не — или наименее разрушительному уменьшению объема жировой ткани и тем самым к изменению контура / формы скоплений жировой ткани. Фото динамическое действие (ФДД) — это необратимое повреждение светом биологических структур (или функций) в присутствии кислорода, сенсибилизированное введенными в клетки или организмы хромофорами (например, красителями) [38, 39].

Принцип оптического метода разрушения жировой ткани заключается в том, что за счет предварительной обработки биоткани красителем, увеличивается поглощательная способность объекта.

В видимой и ближней ИК областях спектра жировая ткань является слабо поглощающей и поэтому необходима ее окраска для увеличения эффективности взаимодействия со светом. В видимой области основным поглотителем является гемоглобин крови (сильная полоса Соре на 405−430 нм и более слабые, а и (3 -полосы на 540 и 575 нм за счет снабжения кровью каждой жировой клетки через кровеносную капиллярную сеть), кроме того Р — каротин с основной полосой на 465 нм также может давать некоторый вклад в поглощение [40].

Существуют два способа локального увеличения поглощения свега тканью и запуска фототепловых или фотобиохимических реакций. Подбором длины волны излучения использовать поглощение 1) эндогенными (собственными) хромофорами ткани [41] или 2) экзогенными хромофорами — красители или фотосенсибилизаторы. В случае применения экзогенных хромофоров эффективность взаимодействия света с тканью может быть существенно более высокой. Существует много фотосенсибилизаторов (ФС), но предметами данного исследования явились индоцианиновый зеленый (ИЗ) и бриллиантовый зеленый (БЗ). Применение ИЗ обусловлено его сильным поглощением в ближней ИК области спектра, низкой токсичностью и быстрым выводом из организма. При внутривенном введении ИЗ эффективно связывается с альбумином плазмы крови и быстро выводится из плазмы паренхиматозными клетками печени, выделяясь полностью в желчь. При местном введении он связывается с белками в тканях и выводится с трудом [42, 43, 44]. Показано, что сильное поглощение лазерного излучения на длине волны 810 нм окрашенной ИЗ опухолевой ткани индуцирует ее локальный нагрев и последующее разрушение [45, 46, 47, 48, 49, 50], и обусловленное фотодинамичееким действием, оказываемым ИЗ [45−50]. В оптических технологиях гораздо реже используется такой краситель, как БЗ? 51], однако он обладает бактерицидными свойствами, его спектр лежит в видимой области, следовательно, возможно его возбуждение источниками видимого света [51, 52].

Узкие пики поглощения красителей позволяют эффективно использовать их для селективной лазерной деструкции ткани, однако при окраске взаимодействие молекул красителя с органическими молекулами ткани может изменить спектр поглощения красителя [45−47].

Интенсивность и положение пиков поглощения красителей зависят от используемых растворителей [53, 54, 55]. При использовании в качестве растворителя физиологического раствора, краситель имеет тенденцию к образованию больших агрегатов. Это также приводит к сдвигу пика поглощения. Растворы, имеющие сложный состав, например, такие как вода-спиртдлицерин, стабилизируют пики поглощения [54].

Спиртовая составляющая в растворе также удобна, чтобы сделать клеточную мембрану более проницаемой для красителя за счет растворения липидной компоненты биологической мембраны [56, 57, 58]. Следующий шаг взаимодействия красителя с клеткой связан с воздействием излучения ис точника. Биологический ответ сенсибилизированной клетки на воздействие света может привести к большим областям повреждений в клеточной мембране и их последующем преобразовании в фактические поры как выход из клетки для свободных жирных кислот (FFAs), потому что молекулярный размер FFAs не превышает диаметр 1−2 нм [59].

Метод основан на том, что молекулы фотосенсибилизатора прикрепляются к мембране клеток. Облучение светом с определенной длиной волны, соответствующей пику поглощения фото сенсибилизатор а, приводит к образованию атомарного (синглентного) кислорода, который нарушает целостность мембран клеток, приводя к увеличению их пористости. Была показана возможность запуска ano птоза в следствие ФДТ [60, 61]. Клеточный липолиз может наблюдаться как процесс оптического просветления образцов при фотодинамическом воздействии на жировую ткань, основные этапы действия приведены на диаграмме. а §.

§ & 3 I.

•е. t.

1) а о ^ у а.

I. Сенсибилизация красителем жировой ткани (местная обработка или подкожная инъекция раствора) л 0 1 3.

§.

43 Jo.

К st.

О" I о b? о? сл Х.

VO*.

Диаграмма.

II. Облучение источником сенсибилизированную ткань.

III. Поглощение излучения тканыо.

IVa. Фототермическое IV6. Фотохимические действие реакции л /.

V. Обратимое и необратимое повреждение клеточной мембраны ¦ ¦ ife ¦ ¦ -, ii.

VI. Порообразование в клеточной мембране У.

VII. Липолиз.

VIII. Апонтоз, некроз W п п 5 rt> ft> о п сг.

Е1 оSсз л т г,.

3 «О О ч4 п>

Г) п сг макрофаги являются показателями воспалительной реакции) Механизм воздействия источника излучения на сенсибилизированную жировую ткань.

Анализ литературы показывает, что действие света на сенсибилизированную ткань, в том числе и жировую, является вполне актуальной задачей как с точки зрения теоретической (фундаментальная «фотобиология животной клетки»), так и прикладной, например, фототерапия. Особый интерес вызывают задачи подбора типа фотосенсибилизатора для различных биотканей, изучение механизмов действия.

Из краткого обзора следует, что изучение воздействия источников оптического излучения на сенсибилизированную жировую ткань является малоизученным и перспективным для приложений направлением в фотомедицине. Существует ряд нерешенных проблем, в том числе малоисследованны спектральные характеристики сенсибилизированной жировой ткани, особенности их изменения в зависимости от параметров излучения [62, 63], несмотря на то, что знание этих данных является принципиально важным для обеспечения хорошо контролируемой послойной лазерной деструкции ткани при лечении ожирения и целлюлита [41, 64, 65, 66]. В литературе отсутствуют рекомендации и критерии для выбора параметров источников излучения и самих источников, способных вызвать щадящую послойную деструкцию сенсибилизированной подкожной жировой клетчатки без её полного разрушения.

Недостаточно внимание исследователей уделено изучению теплового воздействия на сенсибилизированную жировую ткань, а также комбинированному фотодинамическому и тепловому влиянию на сенсибилизированную жировую ткань. В литературе нет данных о влиянии фотодинамического действия (ФДД) на подкожную жировую клетчатку in vivo, не известны пути гибели адпноцитов в данном случае.

Поэтому актуальным является поиск методов минимально пшзазивных процедур, в результате которых клетки гибели по апоптотическому сценарию, без воспалительного ответа. Также, до конца нераскрыты механизмы действия лазерного и светодиодного излучения на сенсибилизированную жировую т кань.

Решение вышеописанных проблем и вопросов является ак1уальным и определило цель настоящей диссертационной работы.

Цель диссертационной работы состояла в экспериментальном исследовании биофизических процессов при воздействии оптического излучения на клетки жировой ткани при ее сенсибилизации красителями.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• исследования спектральных характеристик подкожной жировой клетчатки, красителей различной концентрации и сенсибилизированной этими красителями жировой ткани как до, так и после облучения биообъекта,.

• подбор источника излучения для обеспечения эффективного действия на биоткань в видимой и ИК областях спектра с учетом используемого красителя,.

• исследование воздействия лазерного и светодиодного излучения на сенсибилизированную жировую ткань.

• исследование теплового и комбинированного (фотодинамическое / тепловое) воздействия на жировую ткань,.

• исследование кинетики изменения оптических свойств жировой ткани, сенсибилизированной красителями, in vitro как результат фотодинамического действия, а также определение биофизических механизмов взаимодействия химических агентов со структурными компонентами жировой ткани,.

• исследование механизмов, приводящих к липолизу адппоцитов, с помощью цифровой микроскопии и оптической когерентной томографии, на основе анализа изображений сенсибилизированной и облученной светом жировой ткани.

• анализ патоморфологических изменений в подкожной жировой клетчатке при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo.

Научная новизна работы:

• исследована кинетика изменения оптических свойств сенсибилизированной красителями жировой ткани in vitro как результат фотодинамического/фотохимического действия. Впервые экспериментально продемонстрирован эффект оптического иммерсионного просветления сенсибилизированной жировой ткани в результате фотодипамического воздействия.

• впервые на основе анализа изображений жировой ткани, сенсибилизированной красителями, при фотодинамическом воздействии in vitro выдвинута гипотеза о механизме, вызывающем липолиз адипоцитов. На основе оптической цифровой микроскопии впервые зарегистрированы небольшие образования (структуры) в проекции мембраны жировой клетки, наличие которых при фотодинамическом действии на ткань статистически достоверно связаны с ее просветлением.

• впервые показано увеличение эффективности процесса просветления сенсибилизированной жировой ткани после облучения при нагреве в пределах от 40 до 50 °C температур.

• впервые сделан анализ патоморфологических изменений подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo.

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения п списка литературы.

5.5.2 Выводы.

Наблюдаемые изменения эффективного показателя преломления можно интерпретировать как уменьшение относительного показателя преломления рассеивателей, которые указывают на иммерсионное оптическое просветление. Эти данные подтверждают гипотезу, что фотодинамическая терапия вызывает липолиз жировых клеток в течение некоторого периода времени после воздействия и в случае использования в качестве фотосенсибилизатора — индоцианинового зеленого, а в качестве источника излучения — ИК лазера.

6 Гистологический анализ подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo.

6,1 Введение.

Существует большое количество методов для удаления нежелательных жировых отложений. Лазерная липосакция является новой разработанной технологией для удаления жировых отложений [17, 18]. Применение этого метода приводит к некрозу адипоцитов, которые разрушаются, но не удаляются при липосакции [18].

Лазерный липосакция была описана в 1994 г. [19]. Эта инвазивная технология, однако, менее травматична по сравнению с традиционной липосакцией [21]. Гистологический анализ воздействия 1064 HM-Nd:YAG лазера и CW 980 нм-диодного лазера на подкожную жировую клетчатку человека показал как обратимые, так и необратимые клеточные повреждения [20, 22].

В исследованиях [22] использовался импульсный NdiYAG-лазер с длиной волны 1064 нм. Он генерирует очень короткие импульсы и характеризуется исключительно высокой пиковой мощностью (до 1000 Вт). Лазерная энергия подавалась в подкожную жировую клетчатку с помощью 300-микронного оптического волокна, проходящего через микроканюлю из нержавеющей стали диаметром 1 мм. Параметры излучения для всех пациентов были одинаковыми: длительность импульса 150 мкс, частота повторения 40 Гц и энергия 150 мДж (при мощности 6 Вт). Дистальный участок оптического волокна выступал из дистального конца канюли на 2 мм. Для визуализации в траекторию луча вводили гелий-неоновый источник. Благодаря пилотному красному лучу можно было получить точное представление о том, где работает лазер. Для введения канюли было достаточно разреза длиной 1 мм.

Фотомеханический и термальный эффекты играют важную роль в лизисе клеток. Мембрана адипоцита разрушается при быстрой абсорбции и нагреве клетки. Лазерная обработка имела разную продолжительность, а общая поданная энергия (накопленная энергия) зависела от размера обрабатываемого участка плотности ткани. Продукты распада клеток удаляли с помощью канюли-аспиратора диаметром 2,5 мм, к которой прикладывали отрицательное давление от 350 до 450 мм рт. ст.

В работе [22] обсуждаются физические принципы воздействия лазерного излучения на адипоцит и окружающие ткани, анестезия, методика применения лазера, конкретные случаи, преимущества, ограничения, новые показания, недостатки, осложнения и отдаленные результаты. Кроме того, путем гистологического исследования продемонстрированы принципы действия лазерного липолиза — фототермический и фотомеханический эффекты, оказываемые на жир и соседние ткани. Обработку жировой ткани (а также потовых желез и дермы) проводили контактным способом с помощью оптического волокна, проходящего через канюлю диаметром 1 мм. Попадая в предварительно инфильтрированную жировую ткань, световая энергия, вырабатываемая лазером, абсорбируется и превращается в тепло. Содержимое адипоцита расширяется, и его мембрана разрушается [17]. Вследствие быстрой абсорбции и нагрева клетки в лизисе может играть роль и фотоакустический эффект.

Липолиз можно определить как частичное или полное разрушение жировых клеток с высвобождением их содержания в межклеточное пространство [170, 176]. Смерть клетки может происходить под действием различных физических, химических и биологических факторов. В зависимости от индуктора, происходит клеточный ano птоз или некроз. Эти две формы клеточной гибели различаются по биохимическим и морфологическим признакам [184].

Другой оптический метод разрушения жировой ткани, а именно, фотодинамический / тепловой метод, может обеспечить минимально инвазивное удаление на клеточном уровне региональных и местных специфических скоплений абдоминальной или подкожной жировой ткани, вызывая апоптоз клеток и контролируемый некроз небольших количеств жировой ткани [23, 36, 37,.

184, 185, 186, 187, 188]. В частности, эффект неинвазивного и безили минимально-разрушающего объема жировой ткани связан с действием направленного оптического (лазерного) излучения соответствующей длины волны и мощности совместно с локальным селективным окрашиванием жировой ткани и/или обработкой липолитическим агентом и таким образом изменяет контур/форму местной конкретной жировой ткани.

Целью данной работы явилось гистологическое исследование подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo. В ходе исследования необходимо найти оптимальные дозы воздействия и технологию окраски, чтобы обеспечить контролируемый липолиз жировых клеток с минимальным влиянием на организм.

6.2 Материалы и методы.

Группу 2-летних крыс-самцов из 30 особей содержали 14 суток, кроме стандартного рациона получали 5 г сахара, 5 г сухого молока, 5 г подсолнечного масла и 5 г яичного порошка с тем, чтобы вызвать алиментарное ожирение. Ожирение для крыс-самцов считается при весе >400 г. На 15 сутки крыс декапитировали. Группу разбивали на 3 подгруппы по 10 особей. На каждой особи в области ребер удалялся волосяной покров, и делалась разметка (рисунок 6.1). Зона 1 была контрольная и данная область не подвергалась никакому воздействию (ни окраска, ни облучение). В зону 2 делалась инъекция красителя. Первой подгруппе подкожно вводился краситель бриллиантовый зеленый, растворенный в физиологическом растворе (концентрация 1мг/мл) (раствор 1). Второй подгруппе — индоцианиновый зеленый, растворенный в физиологическом растворе (концентрация 1мг/мл) (раствор 2). Третьей подгруппе индоцианиновый зеленый, растворенный в специальной смеси, состоящей из 25% спирта, 25% глицерина и 50% дистиллированной воды (раствор 3). Зона 3 подвергалась воздействию облучения источника. Для первой подгруппы использовалась диодная лампа с длиной волны 625 нм. Длительность облучения.

10 мин. Для второй и третей подгрупп диодный лазер LS-2-N-808 -10 000 с длиной волны 808 нм. Плотность энергии варьировалась в пределах 480−1440 Дж/см2. Длительность облучения 0.5−8 мин. В зону 4 сначала делалась инъекция красителя, а затем (через 10−15 мин) производилось облучения источником. Крысы всё время воздействия находились под действием местного наркоза (золетил). Через 1 час после воздействия крыс декапитировали. Кусочки кожи и подкожной жировой клетчатки фиксировали в 10% растворе формалина. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. С помощью этих препаратов определяли изменения, происходящие в подкожной жировой клетчатке после фотодинамического воздействия.

Рисунок 6.1 — Экспериментальное животное с нанесенными зонами воздействия.

В последующем был произведен патоморфологический анализ срезов. Статистический анализ данных был выполнен с использованием пакета «Statistics 6.0», в частности, Q критерий Кохрана, являющийся непараметрическим критерием, применяемым для сравнения двух связанных выборок, где переменная может иметь только два возможных значения (закодированные как 0 и 1). Этот критерий позволяет достаточно быстро определить какое из к воздействий эффективнее [148].

6.3 Результаты и обсуждение.

6.3.1 Выбор параметров лазерного излучения.

На начальном этапе, искали дозу излучения, которая привела бы к минимальным повреждениям в тканях.

В результате было обнаружено, что при режимах работы лазера следующих: 24 Вт/см и 8 мин и больше — в препаратах определяется участок выраженной деструкции неправильной формы, в котором границы между клетками эпидермиса и жировой ткани стерты, ядра клеток фрагментированы. Отмечается слущивание рогового слоя. В дерме видны выраженные признаки деструкции соединительной ткани: гомогенизация и набухание волокон, разрушение ядер клеток. При режимах 24 Вт/см2 и 1.2 мин и менее признаки повреждения кожи и жировой ткани выражены гораздо в меньшей степени. Основные изменения локализуются в дерме и представлены набуханием волокон соединительной ткани и их бесструктурностъю. Наименьшие изменения наблюдаются при минимальном воздействии (16 Вт/см, 0.5 мин) на образцы.

Аналогично проведены оптимальный режим работы диодной лампыдлительность облучения 10 мин.

6.3.2 Гистологический анализ контрольных образцов.

Образцы состояли из срезов кожи с подкожной жировой клетчаткой. В контрольных образцах (зона 1) изменений в эпидермисе и дерме (рисунок 6.2), и подкожной жировой ткани (рисунок 6.3) не наблюдалось. Эпидермис тонкий, клетки не имеют дистрофических изменений. Дерма представлена коллагеновыми волокнами, распределенными по различным направлениям и расположенными близко друг к другу. Контуры жировых клеток четкие. Мышечные волокна с хорошо выраженной поперечной исчерченностью. Придатки кожи не изменены.

6.3.3 Гистологический анализ образцов после инъекции красителя.

Первой подгруппе животных были сделаны подкожные инъекции БЗ в физиологическом растворе (раствор 1), второй подгруппе — ИЗ в физиологическом растворе (раствор 2), а третьей — в специальной спиртовой смеси (раствор 3). В образцах, соответствующих зоне 2, т. е. подкожной инъекции раствора 2 ИЗ, существенных изменений в эпидермисе и дерме не наблюдалось (рисунок 6.4аб). В дерме присутствуют очаги разволокнения коллагеновых волокон. Вероятно, это связано с механическим воздействием осмоса воды через мембрану клетки. В большинстве случаев жировая клетчатка не изменена. Жировые клетки имеют вид оптически пустых вакуолей с тонкой оболочкой и только в одном случае — цитоплазматическая мембрана утолщена и имеет двухконтурный вид (рисунок 6.5, рисунок 6.6а). На отдельных участках мембраны разрушены. Для животных второй подгруппы характерен нормальный эпидермис. В отличие от третьей группы животных, в образцах которых заметно уменьшение толщины эпидермиса и коллаген-эластинового матрикса под действием раствора 3, содержащего спирт (рисунок 6.66). Инъекция раствора 3 ИЗ приводит к разбуханию адипоцитов, а в некоторых случаях — к их некрозу (рисунок 6.66). В дерме имеется отек, сопоставимый по выраженности с предыдущей группой. В образцах присутствуют очаги некроза. В одном случае среди некротизированных жировых клеток обнаруживаются клеточные инфильтраты из лейкоцитов, плазматических клеток, эозинофилов, макрофагов (рисунок б. бв) [189, 190]. Большинство клеток локализуется вокруг полнокровных сосудов. В месте введения раствора красителя отслеживается разволокнение коллагеновых волокон в дерме и образование оптических пустот (рисунок 6.7).

5ЖЭ- ^^аашжшх мегь ш^.

• * • г дерм" V* Ж.

О.ЧШ'^МН ЖП|>0|ШЯ а" '1'""' *• ч I.

V®* 1.

Рисунок 6.2 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи с подкожной жировой клетчаткой и мышечным слоем не подверженная никакому воздействию. Контрольный образец. Объектив 4*.

Г’г.

Рисунок 6.3 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки не подверженная никакому воздействию.

Контрольный образец. Объектив 40х .

ШШ. зк, X.% ««гчК ?т ¦

Рисунок 6.4 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи (эпидермис и дерма) при подкожном введения раствора 2 ИЗ (0.5 мг/мл в физиологическом растворе): (а) объектив 10х и объектив 4х (б).

Рисунок 6.5 — Гистология (окраска Ц, гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки при подкожном введении раствора 1 БЗ (10~4 мг/мл).

Рисунок 6.6 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки при подкожном введении раствора ИЗ (0.5 мг/мл): (а) — раствор 2 (ИЗ в физиологическом растворе) — (б) и (в) — раствор 3 (спирт: глицерин: вода= 0.25: 0.25: 0.5). На (в) выделены области некроза (прямоугольник) с клеточной инфильтрацией лейкоцитов, плазматических клеток, эозинофилов, макрофагов. Объектив 40х.

Описанная морфология изменения жировых клеток связана с подкожным введением спиртоглицериновой смеси. Это подтверждает гипотезу о том, что спирт вызывает обратимые/необратимые повреждения в мембране клеток с образованием пор [56, 57, 58].

Рисунок 6.7 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи при подкожном введении раствора 3 ИЗ (ИЗ 0.5 мг/млспирт: глицерин: вода = 0.25: 0.25: 0.5). Объектив 40х.

6.3.4 Гистологический анализ образцов после облучения источником.

В образцах зоны 3, после облучения диодным лазером (плотность энергии, 960 Дж/см2 и времени облучения 1 мин) или диодной лампой (плотность энергии,.

720 Дж/см и время облучения 15 мин), наблюдались незначительный отек и изменение эпидермиса, в виде деструкции клеток — акантоз (рисунок 6.8). Эпидермис сохранен. В дерме отек не выражен. Коллагеновые волокна располагаются компактно и несколько утолщены. Жировые клетки увеличены в размерах, имеют более вытянутую форму, чем в контроле. Клеточный матрикс четко и интенсивно окрашен гематоксилином (рисунок 6.9). По сравнению с контрольным образцом (см. рисунок 6.96) изменения в жировой ткани значительные. В связи с трансмембранным клеточным липолизом жировые клетки изменены в размерах. Присутствие макрофагов свидетельствует о воспалительном процессе (рисунок 6.9а) [189, 190].

Рисунок 6.8 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи с признаками деструкции эпидермиса и образованием клеточных инфильтратов после лазерного облучения. Диодный лазер, 808 нмплотность энергии, 960 Дж/см2. Длительность облучения, 1 мин. а) Объектив 4х, б) Объектив 40х.

Рисунок 6.9 — а) Гистология (о кр ас ка гемато кс илин-эоз ином) подкожной жировой клетчатки после лазерного облучения. Диодный лазер, 808 нмплотность энергии, 960 Дж/см2. Длительность облучения, 1 мин. Объектив 40х. б) Гистология (окраска гемато кс илин-эоз ино м) подкожно й жировой клетчатки не подверженная никакому воздействию. Контрольный образец. Объектив 40*.

Рисунок 6.11 — Гистология (окраска гематоксилинРисунок эозином) кожи при подкожном введении раствора ИЗ (0.5 мг/мл): а) — раствор 2 (ИЗ 0.5 мг/мл в.

6.12.

Гистология (окраска гематоксилин-эозином) кожи при подкожном физиологическом растворе) и б) — раствор 3 (ИЗ 0.5 введении раствора 3 ИЗ мг/млспирт: глицерин: вода = 0.25: 0.25: 0.5) и последующем лазерном облучении (плотность.

ИЗ 0.5 мг/млспирт: глицерин: вода = 0.25:

0.25: 0.5) и энергии, 960 Дж/см2, время облучения 1 мин), последующем лазерном.

Объектив 4х. облучении (плотность энергии, 960 Дж/см, время облучения 1 мин). Объектив 40х.

I ' л ¿-'/" ««аир®

Г Ч Щ.

• Л 1 м чр'^Ч «11 «• шмкЯ *.

Рисунок 6.13 — Гистология (окраска Рисунок 6.14 — Гистология (окраска гематоксилин-эозином) подкожной гематоксилин-эозином) подкожной жировой клетчатки при подкожном жировой клетчатки при подкожном введении раствора 3 ИЗ (ИЗ 0.5 мг/млвведении раствора БЗ (10″ 4 мг/мл в спирт: глицерин: вода = 0.25: 0.25: 0.5) физиологическом растворе) и и последующем лазерном облучении последующем облучении диодной плотность энергии, 960 Дж/см2, время лампой. Диодная лампа, 625 нмоблучения 1 мин). Объектив 40х плотность энергии, 720 Дж/см .

Длительность облучения, 15 мин.

Объектив 40х.

В образцах, соответствующих зоне 4, при введении подкожно спиртового раствора индоцианинового зеленого и последующем облучении диодным лазером (плотность энергии 960 Дж/см и длительность облучения 1 мин) наблюдались изменения в подкожной жировой клетчатке. Зарегистрирован некроз в эпидермисе и подлежащей дермы, а также образование сосочковых выростов в эпидермисе, которые затем слущиваются (рисунок 6.116 и рисунок 6.12). Эти процессы подобны работе [191]. При больших значениях плотности энергии с одного импульса в коже возникал абляционный кратерпри меньших значениях с одного импульса происходило выдавливание веществапри самых малых значениях происходило интенсивное высушивание, и формировался прогиб поверхности. Некроз распространяется до дермы (рисунок 6.96) и жировой ткани (рисунок 6.13).

Благодаря сенсибилизации ИЗ жировых клеток происходило селективное поглощение лазерного излучения, вызывающего фотодинамические изменения, приводящие к гибели клеток. Эти экспериментальные данные также подтверждают предложенную гипотезу.

В этом исследовании не разделяли фотодинамические и фототермические реакции, потому что целью было поиск биологических эффектов, таких как повреждение клетки с последующим липолизом и некрозом. На основе предыдущих in vitro исследований [111], где тонкие срезы жировой ткани, сенсибилизированные водно-спиртовым раствором ИЗ (1 мг/мл) облучались в течение 1 мин лазером с длиной волны 808 нм и плотность энергии 960 Дж/см2 при постоянной температуре (термостат, Т = 40°С), и где происходил липолиз клеток в течение 50 минут, развивающийся после лазерного облучения можно выдвинуть гипотезу, что у фото динамического действия также может иметь место в повреждении клетки в наших исследованиях in vivo. Эти эксперименты нелегко сравнивать, однако, необходимо обосновать намного более высокую плотность энергии в экспериментах in vivo по сравнению с in vitro, на поверхности кожи на конце оптоволокна излучателя и в глубине ткани плотность энергии намного меньше, а также температура тела животных 35 °C. Эти две причины позволяют рассматривать и in vitro и in vivo эксперименты в одинаковом диапазоне параметров, которые делают возможным фотодинамическую реакцию на фоне возможно более сильной фототермической реакции. Очевидно, некоторая синергетика этих двух реакций также возможна как на уровне основных фотофизических/фотохимических процессов, так же как и на уровне биологического ответа. Поскольку все ключевые процессы, такие как краситель и обеспеченность кислородом, увеличение проницаемости клеточной мембраны, являются зависимыми от температуры, и повреждение клетки в результате фотодинамического действия, может помочь для повреждения вызванного нагревом и наоборот.

Заключение

.

На основе анализа измеренных спектров поглощения можно утверждать о сдвиге положения максимумов полосы поглощения фотосенсибилизаторов в жировой ткани по сравнению с их спектрами в растворах. Сдвиг обусловлен взаимодействием молекул ИЗ и БЗ с коллагеном и другими белковыми молекулами, входящими в основном в состав межклеточного матрикса (септа, диаметр волокон порядка 50−200 нм). Анализируя спектры красителей в растворах и в тканях, важно отметить также изменение формы спектров. Интенсивность пика, соответствующего вкладу молекул-мономеров, существенно снижается и становится сравнимой с интенсивностью пика от вклада молекул-димеров. На основе полученных спектров были рассчитаны концентрации красителей в ткани.

Для эффективного возбуждения используемых в работе молекул красителей были подобраны выпускаемые промышленностью и применяемые для медицинских целей источники излучения со спектрами излучения, максимально возможно соответствующими спектрам поглощения, используемых красителей. Например, широкополосные линии испускания диодной лампы (442 и 597 нм) достаточно хорошо соответствуют также широким полосам поглощения бриллиантового зеленого (440 и 650 нм). Максимум испускания диодного лазера (808 нм) попадает в полосу поглощения молекул индоцианинового зеленого, находящихся в связанном состоянии с белками в биоткани (805−810 нм).

Экспериментально обнаружено повышение оптического пропускания сенсибилизированной водно-спиртовым раствором бриллиантового зеленого при концентрации 6 мг/мл жировой ткани человека после ее облучения на длинах волн 442 и 597 нм с общей плотностью мощности излучения не превышающей 75 мВт/см. Расчет временного и пространственного изменения оптического пропускания жировой ткани на основе статистической обработки цифровых изображений, полученных в проходящем свете, позволяет количественно оценить степень и кинетику процессов в жировой ткани в ответ на фотодинамическое действие. Анализ кинетики оптического пропускания сенсибилизированной жировой ткани после ее облучения позволил предложить метод «мягкой» редукции объема ткани путем липолиза жировых клеток без их существенной деструкции.

Вблизи поверхности мембран клеток жировой ткани впервые экспериментально зарегистрированы небольшие образования (структуры), размерами от 2 до 8 мкм, которые характеризуются изменяющимся во времени оптическим пропусканием и трактуются как капельки внутриклеточной жидкости, секретируемой через образованные поры в мембране.

На основе цифровой микроскопии экспериментально показано, что характер изменения оптических характеристик селективно облученной жировой ткани различен для различных сенсибилизаторов. Показано, что выравнивание пропускания по площади биообъекта имело место как в случае сенсибилизатора БЗ, так и ИЗ, однако, просветление жировой ткани наступало лишь для БЗ. Показано, что отличие оптического отклика на фотодействие на сенсибилизированную жировую ткань обусловлено спектрами поглощения света красителями и спектральным составом источников облучения ткани.

Показано увеличение эффективности процесса просветления жировой ткани, вызванного фотодинамическим эффектом, при нагреве ткани до температур 40−50 °С.

Впервые сделан анализ патоморфологических изменений подкожной жировой клетчатки при фотодинамическом воздействии на кожу крыс in vivo. Было показано, что выбором красителя (концентрации, способа введения в ткань) и параметров светового облучения (длина волны, плотность энергии) можно обеспечить контролируемую редукцию жировой ткани вплоть до ее полной деструкции. Например, при подкожном введении водно-спиртовых растворов бриллиантового зеленого и индоцианинового зеленого и чрезкожном облучении.

— у излучением диодной лампы (625 нм, плотность энергии 720 Дж/см) и диодного лазера (808 нм, плотность энергии 960 Дж/см) соответствующих областей на теле экспериментальных животных в коже, жировой и мышечной ткани животных развивались выраженные изменения, в том числе в подкожной жировой клетчатке наблюдалась распространенная деструкция.

По результатам работы опубликованы статьи в реферируемых изданиях и журналах:

1. Янина И. Ю., Симоненко Г. В., Кочубей В. И., Тучин В. В. Спектры поглощения жировой ткани человека при ее сенсибилизации красителями // Оптика и спектроскопия. — 2010. — Т. 109, № 2. — С. 1303−1311.

2. Tuchin V.V., Altshuler G.B., Yanina I.Yu., Kochubey V.I., Simonenko G.V. Fat tissue staining and photodynamic/photothermal effects // Proc. SPIE. Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics VII, San Francisco, California, USA. — 2010. — V.7563. — P. 75630V1−7.

3. Doubrovsky V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Inhomogeneity of photo-induced fat cell lip о lysis // Proc. SPIE. — 2011. — V. 7999. — P. 7999−21.

4. Дубровский В. А., Дворкин Б. А., Янина И. Ю., Тучин В. В. Фотовоздействие на клетки жировой ткани человека in vitro II Цитология. —2011. — Т.53, № 5. — С. 423−432.

5. Yanina I.Y., Orlova T.G., Tuchin V.V., Altshuler G.B. The morphology of apoptosis and necrosis of fat cells after photodynamic treatment at a constant temperature in vitro II Proc. SPIE Mechanisms for Low-Light Therapy VI, edited by Michael R. Hamblin, Ronald W. Waynant, Juanita Anders. — 2011. — V.7887. — P. 78870X-1−7.

6. Yanina I.Yu., Bochko V.A., Alander J.T., and Tuchin V.V. Optical image analysis of fat cells for indocyanine green mediated near-infrared laser treatment // Laser Phys Lett. —2011. —V.8, No.9. —P. 684−690.

7. Yanina I.Yu., Tuchin V.V., Suleymanova L.V., Bycharskaya A.B., Maslyakova G.N. Fat tissue histological study at NIR laser treatment of the human skin in vitro II Proc. SPIE. — 2011 — Vol.8092. — P. 809 215−1-8.

8. Дубровский B.A., Янина И. Ю., Тучин B.B. Кинетика оптических свойств жировой ткани in vitro как результат фотодинамического действия // Биофизика — 2012. — Т.57,№ 1.—С. 115−119.

9. Yanina I.Yu., Tuchin V.V., Navolokin N. A., Matveeva O.V., Bucharskaya A.B., Maslyakova G.N., Altshuler G.B. Fat tissue histological study at ICGmediated photothermal/photodynamic treatment of the skin in vivo II JBO — 2012. — V.17, No.5.—P. 58 002−1-9.

10. Yanina I.Yu., Kochubey V.l., Tuchin V.V., Portnov S.A., Svenskaya Yu.I., Gorin D.A., Ponomareva E.G., Nikitina V.E. Effect of bacterial lectin on acceleration of fat cell lipolysis at in vitro diode laser treatment using encapsulated ICG // Proc. SPIE. — 2012. — V. 8337. — P. 83370F-1−7.

11. Yanina I.Yu., Navolokin N.A., Nikitina V.V., Bucharskaya A.B., Maslyakova G.N., and Tuchin V.V. Studies of lipid peroxidation of rat blood after in vivo photodynamic treatment // Proc. SPIE. —2012. — V. 8337. — P. 83370G-1−7.

12. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Temporal change of adipose tissue refractive index at photodynamic treatment: in vitro study using OCT // Proc. SPIE. — 2012. — Vol. 8222. — P. 82221G- 1−6.

13. Doubrovsky V.A., Yanina I.Yu., Tuchin V.V. Porosity of photo-induced fat cell lipolysis // Proc. SPIE. — 2012. — Vol. 8427. — P. 842 748−1-9.

14. Yanina I.Yu., Trunina N.A., Tuchin V.V. Optical coherence tomography of adipose tissue at photo dynamic/photo thermal treatment in vitro // Journal of Innovative Optical Health Sciences on Advances. — 2013. — V. 6, No.2. — P. 1 350 010−1-7.

15. Yanina I.Yu., Doubrovsky V.A., Tuchin V.V. Control of optical transmittance of fat tissue slices at NIR photodynamic action mediated by indocyanine green // Proc. SPIE. — 2013. — V. 8699. — P. 86990C-1−7.

16. Янина И. Ю., Дубровский В. А., Тучин B.B. Оптическая регистрация пор в мембране жировой клетки / И. Ю. Янина, В. А. Дубровский, В. В. Тучин // Оптика и спектроскопия — 2013. — Т. 115, № 2. — С. 62−67.

17. Ганилова Ю. А., Долмашкин A.A., Дубровский В. А., Янина И. Ю., Тучин В. В. Оптическая цифровая микроскопия для цитои гематологических исследований in vitro II Оптика и спектроскопия. — 2013 — Т. 115, № 2. — С. 6874.

Статьи в материалах международных и российских конференциях:

1. Genina E.A., Zubkova E.A., Korobko A.A., Yanina I.Yu., Bashkatov A.N., Kamenskikh T.G., Galanzha V.A., Tuchin V.V. Diffusion of Cortexin and Retinalamin in eye sclera // Saratov Fall Meeting 2006: Optical Technologies in Biophysics and Medicine VIII, edited by Valeiy V. Tuchin, Proc. SPIE. — 2007. — Vol. 6535. — P. 65351Y- 1−6.

2. Tuchin V.V., Yanina I.Yu., Simonenko G.V. Destructive fat tissue engineering using photodynamic and selective photothermal effects // Proc SPIE. — 2009. — V.7179. — P.71790C.1−11.

3. Янина И. Ю., Симоненко Г. В., Тучин B.B. Физические способы воздействия на жировую ткань // Проблемы оптической физики, Материалы 11-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. —2008. — С. 64−76.

4. Тучин В. В., Дубровский В. А., Янина И. Ю. Статистическая обработка цифровых фотографий как метод анализа фотодинамической деструкции жировой ткани in vitro II Проблемы оптической физики, Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2009. — С. 40−45.

5. Бочко В. А., Аландер Я. Т., Тучин В. В., Янина И. Ю. Медицинская визуализация и терапия с использованием индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, Материалы 12-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов.

2009. — С. 56−63.

6. Yanina I.Yu., Bochko V.A., Simonenico G.V., Valisuo P.O., Alander J.T., and Tuchin V.V. Photo analysis methods for fat cell destructive engineering // Proc. SPIE.

2010. — Vol. 7547. — P. 754 708−1-8.

7. Дубровский B.A., Янина И. Ю., Тучин B.B. Регистрация неравномерности фотоиндуцированного липолиза жировых клеток методом цифровой микрофотографии действия // Проблемы оптической физики, Материалы 13-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. —2011. — С. 96−105.

8. Янина И. Ю., Симоненко Г. В., Тучин В. В., Медведев Б. А. Лабораторная работа «Фотодинамическая терапия жировой ткани» // Проблемы оптической физики, Материалы 13-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2011. — С. 122−130.

9. Козина A.M., Янина И. Ю., Свенская Ю. И., Генина Э. А., Портнов С. А., Башкатов А. Н., Тучин В. В. Фотодинамический липолиз с использованием индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, Материалы 13-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2011. — С. 113−118.

10. Ганилова Ю. А., Дубровский В. А., Янина И. Ю., Тучин В. В. Особенности методики оптической цифровой микроскопии для биомедицинских исследований in vitro // Проблемы оптической физики, Материалы 14-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, Изд.-во «Новый ветер», Саратов. — 2012. — С. 30−38.

11. Янина И. Ю. Фотодинамическое локальное разрушение жировой ткани in vitro II Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием. Молодежь и наука, итоги и перспективы YSRP'08. — 2009. — С. 7.

12. Янина И. Ю. Выявление фотодинамической деструкции жировой ткани с помощью непараметрических статистических критериев // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием. Молодежь и наука, итоги и перспективы YSRP'09. —2010. — С. 59.

13. Янина И. Ю. Статистическая обработка цифровых фотографий как метод анализа фотодинамической деструкции жировой ткани in vitro II Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые — здравоохранению региона» МУ-ЗР'09. —2010. — С. 238−239.

14. Янина И. Ю. Изменение оптических свойств жировой ткани в результате фотодинамического действия in vitro II Материалы 71 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые — здравоохранению региона» МУ-ЗР' 10. — 2011.

С. 265−266.

15. Козина A.M., Янина И. Ю. Фотодинамический липолиз с использованием индоцианина зеленого // Материалы 71 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые — здравоохранению региона» МУ-ЗР' 10. — 2011. — С. 259.

16. Янина И. Ю., Ганилова Ю. А. Опыт цитологических исследований на основе оптической цифровой микрофотографии // Материалы 72 научно-практической конференции студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые — здравоохранению региона» МУ-ЗР' 11. — 2012.

С. 268.

17. Янина И. Ю., Гордеев A.B., Дахчуков Ш. Р. Исследование фотохимического образования пор в мембране жировой клетки на основе цифровой микроскопии // Материалы 73-й студенческой научно-практической конференции в рамках первой Всероссийской недели науки с международным участием, посвященной дню российской науки «Молодые ученые — здравоохранению», Издательство Саратовского медицинского университета. —2012. —С. 192.

18. Янина И. Ю., Симоненко Г. В., Тучин В. В. Инженерия жировой ткани при фотодинамической и фототермической деструкции in vitro / И. Ю. Янина, Г. В. Симоненко, В. В. Тучин // 111 Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика — 2010» 21−25 июня 2010. Сборник материалов. Москва, Секция Оптико-информационные технологии и биомедицинская фотоника. Устные доклады. — 2010. —Т.З. —С. 35−37.