Оценка бектерицидной активности биологических жидкостей в норме и при патологии с помощью лазерной проточной цитометрии

Оценка иммунного статуса человека — одна из главнейших задач клинической иммунологии, которая заключается в определении состояния гуморальных и клеточных звеньев иммунитета, а так же местного иммунитета. Поэтому для получения наиболее полной картины о патологическом процессе, о динамике его течения необходимо разрабатывать и внедрять в клиническую лабораторную практику новые простые в исполнении методы исследования, а так же усовершенствовать уже имеющиеся.

Бактерицидные свойства крови и других биологических жидкостей организма играют важную роль в защите организма от инфекции. Бактерицидные свойства сыворотки крови обусловлены как иммунными так и не иммунными механизмами. К первым относится бактериолитический эффект антител и комплемента, ко вторым — различные бактерицидные белки и антибактериальные пептиды [Caccavo D., et al., 2002, Ginsburg I. 2002; Li Y. M., et al., 1998]. Способность организма убивать микробы является важным параметром в оценке иммунного статуса человека в норме и при патологии. Ослабление бактерицидности сыворотки способствует повышению чувствительности к инфекциям [Jankowski S., 1995].

Ротовая полость является входными воротами инфекции. Слизистая оболочка ротовой полости является важным барьером на пути проникновения микробов. Слюна играет важную роль в обеспечении гомеостаза ротовой полости. Слюна содержит большое число протеинов (лизоцим, лактоферрин, лактопероксидаза, иммуноглобулины, муцины, агглютинины и др.) и пептидов (гистатины, дефензины, кателицидины), обладающих антимикробными свойствами. По данным Andoh A., Fujiyama Y. и сотр. в слюне содержатся и активные компоненты системы комплемента, которые так лее могут участвовать в местных иммунных и воспалительных ответах в ротовой полости [Andoh А., Fujiyama Y., et al., 1997].

Использование проточной лазерной цитометрии на сегодняшний день является идеальным методическим подходом для оценки бактерицидных свойствбиологических жидкостей. По сравнению с другими методами (бактериологическим, спектрофотометрическим, радиобиологическим), позволяющими оценить этот показатель, цитометрия имеет существенные преимущества: высокая скорость и точность измерения, объективность, простота постановки реакции и быстрое получение результата.

Цель работыЦелью работы явилось оценить бактерицидную активность биологических жидкостей in vitro с помощью цитометрического метода в норме и при различных патологиях.

Задачи исследования:1. Разработать цитофлюориметрический метод определения бактерицидной активности биологических жидкостей.

2. Исследовать бактерицидную активность сыворотки периферической крови и слюны здоровых доноров in vitro для определения интервалов нормальных значений показателей.

3. Оценить влияние времени инкубации на бактерицидную активность биологических жидкостей in vitro.

4. Оценить вклад комплемента в бактерицидность биологических жидкостей in vitro.

5. Исследовать бактерицидную активность сыворотки крови у больных с нарушениями в иммунной системе и бактерицидную активность слюны у больных с воспалительными заболеваниями ротовой полости.

Научная новизнаВпервые предложена и внедрена в клиническую практику модифицированная цитометрическая методика для оценки киллинга St. aureus Cowan I биологическими жидкостями человека с использованием двойной метки ФИТЦ±ПИ+.

С помощью предложенного нового метода исследована бактерицидная активность сыворотки крови и слюны в норме и при патологиях, а так же количественно оценен вклад системы комплемента и антител в процесс бактериолиза, индуцированного биологическими жидкостями.

Продемонстрировано, что при нарушениях в гуморальном звене (при агаммаглобулинемии, при дефиците компонентов системы комплемента, при множественной миеломе) происходит уменьшение бактерицидности. Кроме того, показано, что уменьшение бактерицидности сыворотки крови зависит от иммунохимического варианта множественной миеломы.

Впервые показано, что у детей с ХГБ и у пациентов с ХРФ в стадии обострения бактерицидная активность сыворотки крови увеличена. Увеличение бактерицидности у детей с ХГБ, возможно, связано с увеличением в сыворотке крови адефензинов.

Впервые использован цитометрический подход для оценки местного иммунитета при воспалительных заболеваниях ротовой полости. Было показано, что бактерицидная активность слюны увеличивается у больных с хроническим афтозным стоматитом и уменьшается при прогрессировании заболевания (при появлении эрозий и язв), а так же, на примере больных с красным плоским лишаем, отмечено, что бактерицидность слюны зависит от формы заболевания.

Практическая значимость работыРазработанный метод оценки бактерицидного действия биологических жидкостей подтвержден другими методами исследований. Тесты просты в исполнении, поэтому их можно использовать для поточных исследований в лаборатории клинической иммунологии. Набраны нормативные показатели бактерицидности биологических жидкостей (сыворотки крови и слюны).

На примере различных патологий показана возможность исследования бактерицидности биологических жидкостей с помощью проточной цитофлюориметрии. Цитометрический метод оценки бактерицидностибиологических жидкостей является перспективным в комплексе методов оценки иммунной системы человека.

Определение бактерицидной активности биологических жидкостей может быть полезным для диагностики состояния иммунной защиты организма, а так же при мониторинге за течением инфекционных и воспалительных заболеваний, для оценки эффективности проводимой терапии. А так же возможно использование этого метода для отбора высоко эффективных сывороток и плазм на станциях переливания крови.

выводы.

1. Предложен новый метод для оценки бактерицидности биологических жидкостей с помощью проточной лазерной цитометрии, заключающийся в двойном окрашивании флюорохромами бактерий, удобный для поточных исследований в практике лабораторий клинической иммунологии. Результаты цитометрического метода высоко коррелировали с результатами бактериологического метода (г = 0,84, при р< 0,05) и фотометрического метода (г = 0,92, при р< 0,05).

2. При исследовании группы здоровых доноров определены нормативные значения показателя бактерицидности сыворотки крови и слюны 20,98±6,2% и 23,8±9,0%, соответственно.

3. Имеются отличия в бактерицидном действии сыворотки крови и слюны: в первом случае максимальный эффект достигается через 3 часа, во второмчерез 24 часа.

4. Бактерицидная активность сыворотки крови складывается из эффекта термолабильных (44%) и из термостабильных (56%) компонентов, а бактерицидность слюны определяется только термостабильными компонентами.

5. У больных с агаммаглобулинемией, с дефектом системы комплемента и с и 1§-М — вариантами множественной миеломы наблюдается снижение бактерицидной активности сыворотки крови, тогда как, у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом и хронической гранулематозной болезнью — существенное повышение.

6. У больных хроническим афтозным стоматитом наблюдается увеличение бактерицидной активности слюны, у пациентов с эрозиями слизистой рта и с красным плоским лишаем — снижение.

7. Оценка бактерицидных свойств крови доноров может использоваться на станциях переливания крови для отбора сывороток, обладающих максимальными протективными свойствами.