Интенсивные исследования в области биологии и генетики патогенных бактерий позволили достигнуть к настоящему времени значительного прогресса в области изучения взаимоотношений внутриклеточных бактериальных паразитов и эукариотических клеток. Был установлен целый ряд механизмов, позволяющих бактериям проникать и успешно размножаться внутри клеток, а также распространяться по тканям и органам млекопитающих, приводя к развитию тяжелых заболеваний. Эффективность функционирования этих механизмов обеспечивается продукцией бактериями факторов патогенности белковой природы, которые прямо взаимодействуют со специфическими рецепторами эукариотических клеток, влияя на сигнальные системы и внутриклеточные процессы (Белый Ю. Ф., 1996; Бондаренко В. М., 1999, 2001; Ермолаева А. и др., 2005), Изучение молекулярных механизмов активности факторов патогенности имеет как фундаментальную, так и практическую значимость, т.к. является основой для разработки новых подходов к созданию вакцинных препаратов и терапии инфекционных заболеваний. Типичным представителем группы факультативных внутриклеточных паразитов и удобной моделью для изучения внутриклеточного паразитизма является грамположительная бактерия Listeria monocytogenes, возбудитель тяжелого заболевания человека и домашних животных — листериоза (Тартаковский И. С, и др., 2002; Vazquez-Boland et al., 2001), Листерии попадают в эпителиальную клетку в результате активной инвазии или захватываются макрофагами, разрушают фагосому и выходят в цитоплазму, где эффективно размножаются. Внутриклеточное перемещение листерии осуществляется благодаря полярной полимеризации эукариотического актина на одном полюсе бактериальной клетки. Листерии обладают значительным набором факторов патогенности, осуществляющих сложные взаимодействия с эукариотическими клетками. Установление структуры и механизмов активности факторов патогенности необходимо для разработки диагностических и терапевтических средств контроля заболевания вызываемого листериями — листериоза. Одним из важнейших факторов патогенности листерии является белок ActA, который, по-видимому, можно отнести к числу бифункциональных факторов патогенности. Установлено, что белок ActA, обладающий функцией полимеризации эукариотического актина, является необходимым и достаточным фактором для осуществления внутриклеточного перемещения бактерии (Cossart, Sansonetti, 2004). Недавние результаты продемонстрировали, что белок ActA так же может быть вовлечен в индукцию «фагоцитоза» при взаимодействии листерии с эпителиальными клетками (Suarez et al., 2001). Однако до настоящего момента молекулярные механизмы, лежащие в основе бифункциональности белка ActA, не установлены. В исследованиях, осуществленных in vitro, белок ActA был обнаружен во фракциях мембрано-связанных и освобождённых белков (Kocks et al., 1992; Ermolaeva et al., 2004). С бактериальной мембраной белок ActA связан через карбоксильный трансмембранный домен, а механизм его освобождения до настоящего времени оставался неизвестным. Показано, что поверхностно-связанный белок ActA необходим для осуществления внутри и межклеточного перемещения возбудителя (Cossart, Bieme, 2001). Роль же освобожденной формы белка ActA в вирулентности листерий до настоящего времени не изучалась. Цель работы: установить механизмы освобождения поверхностного белка ActA и роль его освобожденной формы в процессе проникновения, внутриклеточного размножения и межклеточного перемещения L. monocytogenes в эпителиальных клетках. В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло рещить следующие задачи: — установить механизм перехода белка ActA из мембрано-связанной формы в освобождённую- - получить мутантный штамм L. monocytogenes, продуцирующий только мембрано-связанную форму белка ActA- - изучить влияние мутаций, нарушающих освобождение белка ActA, на основные стадии процесса проникновения, внутриклеточного размножения и межклеточного перемещения L. monocytogenes в эпителиальных клетках- - установить специфичность взаимодействия белка ActA с поверхностными рецепторами эукариотических клеток и роль этого взаимодействия в процессе внутриклеточного проникновения, размножения и межклеточного перемещения L.monocytogenes.Научная новизна и практическая значимость работы: -Впервые установлено, что освобождение белка ActA связано с протеолизом мембранного домена, который происходит между гистидином в положении 582 и треонином в положении 583. -Впервые произведена сайт-специфическая замена гистидина в положении 582 в последовательности ActA на пролин и продемонстрировано, что данная замена нарушает освобождение белка. -Установлено, что процесс протеолитического расщепления трансмембранного домена белка ActA не зависит от рН среды и отличается от протеолиза этого белка, осуществляемого металлопротеазой Мр1. -Впервые показано участие освобожденной формы белка ActA в процессе инвазии листерий в эпителиальные клетки, а также продемонстрировано, что для процесса внутриклеточного перемещения данная форма белка ActA не является необходимой. — Подтверждена гипотеза о белке ActA как бифункциональном факторе патогенности и продемонстрировано, что изменение функции белка может быть следствием изменения его локализации. -Показано, что взаимодействие освобожденной формы белка ActA листерий с поверхностными гепаран-сульфат протеогликанами эукариотических клеток уменьшает уровень инвазии возбудителя. -Установлено, что сигнальные пути, активируемые в результате взаимодействия белка ActA с поверхностными рецепторами эукариотической клетки, являются одной из мишеней активности протеогликан-узнающих белков системы врожденного иммунитета. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях факторов вирулентности L. monocytogenes, при создании новых диагностических и терапевтических препаратов.
Глава 6. ВЫВОДЫ Выводы:
1. Впервые установлены механизмы освобождения поверхностного белка ActA и показана роль освобожденной формы этого белка в инвазии Listeria monocytogenes в эпителиальные клетки.
2. Впервые показано, что освобождение мембрано-связанного белка ActA осуществляется путем протеолиза трансмембранного карбоксильного домена. Протеолиз происходит между аминокислотами гистидин в положении 582 и треонин в положении 583.
3. Установлено, что процесс протеолитического освобождения белка ActA не зависит от рН среды и не связан с активностью металлопротеазы Mpl.
4. В опытах in vitro впервые показано, что освобожденная форма белка ActA необходима для эффективной инвазии L. monocytogenes в эпителиальные клетки, однако не является необходимой для внутриклеточного размножения листерий и непосредственного перемещения из клетки в клетку.
5. Установлено, что освобождённая форма белка ActA взаимодействует с гепарансульфат протеогликанами, находящимися на поверхности эукариотических клеток, и это взаимодействие влияет на процесс активной инвазии листерий в эпителиальные клетки.
6. Впервые показано, что процесс активной инвазии, опосредуемый белком ActA, ингибируется в присутствии эукариотического белка TagL.
