Особенности кинетики PGH-синтазной реакции

Задания на курсовую работу

Задание 1. На основании экспериментальных данных по опытам 1?6 исследовать зависимость скорости PGH? синтазной реакции от концентрации гемина. Составить схему процесса, используя квазистационарное приближение вывести кинетическое уравнение процесса. Используя методы предстационарной кинетики определить константы скоростей всех стадий процесса. Вычислить константу Михаэлиса и величину предельной скорости реакции.

Задание 2. Дополнить данные о зависимости скорости PGH? синтазной реакции от концентрации гемина данным опытов (1а?6а), в которых в системе присутствует бруфен. Определить тип ингибирования, параметры кинетического уравнения: константу Михаэлиса, константу ингибирования, величину предельной скорости.

Экспериментальные данные:

Задание 1

Кинетика простой ферментативной реакции с одним субстратом рассмотрена в литературе.

Л. Анри (1903г.) первым предположил, что фермент образует промежуточное соединение с субстратом. Л. Михаэлис предложил для количественного описания кинетики ферментативной реакции с одним субстратом механизм, состоящий из двух стадий (первая — обратимая и быстрая, втораянеобратимая и медленная):

(1)

где E — фермент; Sсубстрат (в моем случае гемин); ESпромежуточное соединение (интермедиат); Pпродукт; k1, k-1 — константы скорости прямой и обратной реакций на первой стадии; k2 — константа скорости необратимой медленной стадии.

Уравнение Михаэлиса имеет вид:

. (2)

Величина называется константой Михаэлиса.

Это уравнение можно записать следующим образом:

(3)

где KM и — кинетические параметры уравнения Михаэлиса Ментен. Причем максимальная (предельная) скорость равна:

=k2cEo, (4) Величину называют также числом оборотов фермента, так как она указывает на число молей субстрата, превращенных в продукт одним молем фермента в единицу времени.

Для определения параметров и используют несколько способов линеаризации уравнения Михаэлиса Ментен, которые позволяют выразить экспериментальные данные в удобной для анализа линейной графической форме.

В предстационарный период кинетики, скорость накопления ферментсубстратного комплекса определяется уравнением

(5)

но согласно уравнению материального баланса, уравнение (5) преобразуется к виду

. (6)

Если концентрация фермента много меньше, чем концентрация субстрата, то концентрацию последнего можно считать постоянной. Это позволит проинтегрировать уравнение (6) после разделения переменных и получить следующее выражение

. (7)

Скорость образования продукта выражается уравнением

или с учетом (7):

. (8)

Если проинтегрировать выражение (8), получим зависимость концентрации продукта реакции от времени, то есть уравнение кинетической кривой

.

Очевидно, что при больших значениях времени экспонента стремится к нулю, и концентрация продукта от времени будет меняться линейно. Из последнего уравнения следует, что точка пересечения продолжения прямолинейной зависимости оси времени () определяется выражением:

. (9)

Это время называется характеристическим временем.

С использованием этого понятия запишем выражение (7), причем выражение перед скобкой преобразуем следующим образом:

. (10)

Если время реакции и начальная концентрация субстрата много больше начальной концентрации фермента, т. е. постоянна, то уравнение (10) переходит в уравнение для квазистационарной концентрации фермент-субстратного комплекса, т. е. в уравнение вида:

. (11)

Удобно для дальнейшего анализа произвести следующие действия: умножить обе части (11) на. Тогда получим:

. (12)

Величина в уравнении (12) есть начальная скорость ферментативной реакции в квазистационарном состоянии. Поскольку она постоянна, то интегрирование (12) приводит к (13):

. (13)

Когда реакция выходит на квазистационарный режим, концентрация продукта линейно зависит от времени ().

. (14)

Для нахождения констант скоростей отдельных стадий необходимо провести серию экспериментов, в которых предстационарная кинетика изучается в реакциях с различными начальными концентрациями субстрата.

Чтобы определить константы, построим для каждой зависимости график в координатах Ср от ф. У этой зависимости есть два участка: нелинейный при малом времени и линейный, когда реакция уже вышла на стационарный режим. По этому линейному участку можно определить скорость процесса:

. (15)

По экспериментальным данным построим кинетические кривые и определим по ним начальные скорости реакции в квазистационарном режиме и характеристическое время.

Таблица 1

Рис. 1 — Кинетическая кривая опыта 1, при котором начальная концентрация субстрата была равна 50 мМ

Как описано в литературе, полученная кинетическая кривая имеет два участка: нелинейный и линейный. По линейному участку, используя значения последних пяти столбцов, строится линия тренда.

Уравнение линии тренда имеет вид: y= 66,628x — 47,36. В символах реальных величин с учетом округления это будет соответствовать:

cp = 66,63 ?47,36.

По этому уравнению определяем:

скорость процесса; 2) характеристическое время.

Скорость реакции совпадает с угловым коэффициентом линии тренда, т. е. скорость будет равна w=66,63 мкМ/с.

Используя уравнение тренда, можно определить характеристическое время (время, при котором реакция выходит на стационарный режим):

cp = 66,63 ?47,36 = 0, отсюда = 0,711 с.

Таблица 2

Рис. 2 — Кинетическая кривая опыта 2, при котором начальная концентрация субстрата была равна 55 мМ

Линия тренда: y= 71,942x — 50,107. В символах реальных величин с учетом округления: cp = 71,94 ?50,11.

Скорость равна: w=71,94 мкМ/с.

Характеристическое время: = 0,7 с.

Таблица 3

Рис. 3 — Кинетическая кривая опыта 3;начальная концентрация субстрата 77 мМ

y= 87,7x — 53,06.

cp = 87,7 ?53,06.

w=87,7 мкМ/с.

= 0,6 с.

Таблица 4

Рис. 4 — Кинетическая кривая опыта 4; начальная концентрация субстрата 112 мМ

y=107,1x — 54,34.

cp = 107,1 ?54,34.

w=107,1 мкМ/с.

= 0,51 с.

Таблица 5

Рис. 5 — Кинетическая кривая опыта 5; начальная концентрация субстрата 168 мМ

y=129x — 52,52.

cp = 129 ?52,52.

w=129 мкМ/с.

= 0,41 с.

Таблица 6

Рис. 6 — Кинетическая кривая опыта 6 при начальной концентрации субстрата равной 250 мМ

y=147,4x — 45,5.

cp = 147,4 ?45,5.

w=147,4 мкМ/с.

= 0,31 с.

На основе полученных данных сформируем таблицу зависимости начальной концентрации субстрата и начальной скорости в квазистационарном режиме от характеристического времени:

Таблица 7

В таблице 8 отразим зависимости обратной величины характеристического времени от начальной концентрации субстрата.

Таблица 8

По данным таблицы 8 построим графическую зависимость обратной величины характеристического времени от начальной концентрации субстрата (рис. 7).

Рис. 7 — Зависимость обратной величины характеристического времени от начальной концентрации субстрата После преобразования уравнения (9) к виду:

можно увидеть, что наклон прямой в координатах (рис. 7) будет равен, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, дает сумму .

Используя преимущества предстационарной кинетики, считываем с рис. 7 значения и :

k1==0,0093 *103 с-1 М-1=9,3 с-1 М-1,

=0,946 с-1 М-1

Для нахождения параметров уравнения Михаэлиса-Ментен, раздельного нахождения констант и, wmax, нужно представить данные в двойных обратных координатах (координатах Лайнуивера-Берка). Причем отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен обратной величине максимальной (предельной) скорости. А обратная величина константы Михаэлиса численно равна отрезку, отсекаемому продолжением линии зависимости обратной начальной скорости реакции от обратной начальной концентрации субстрата на оси абсцисс.

Зная начальную концентрацию фермента, можно найти константу скорости, а потом вычислить .

Для этого сформируем таблицу 9, где отразим зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в двойных обратных координатах и изобразим этот график. (рис.8).

Таблица 9

Рис. 8 — Зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в двойных обратных координатах Найдем значение максимальной скорости по рис.8:

0,0049*106 с/М

wmax=204,1?10−6М/с=0,2041· 10−3 М/с.

Найдем значение константы Михаэлиса:

0,01*103М КМ=0,1 М.

Также константу Михаэлиса можно найти по формуле:

КМ = = 0,1 М Значения константы Михаэлиса совпали, следовательно, не было допущено ошибок при построении графика 8.

Найдем k2. По условию СE, 0 = 5.10−4 моль/л,

k2 = = =0,41 1/с ;

k-1 =0,946-k2=0,946−0,41=0,536 1/с.

Запишем уравнение Михаэлиса-Ментен с найденными параметрами:

w0 =.

Задание 2. Выполнение расчетов по ингибированию ферментативной реакции

По данным опытов 1а-6а построим кинетические кривые и определим скорость PGH? синтазной реакции в присутствии ингибитора. Ингибитором является бруфен с концентрацией 40 мкМ.

Таблица 10

Рис. 9 — Кинетическая кривая опыта 1а Уравнение линии тренда имеет вид: y=30,8x — 21,96. В символах реальных величин с учетом округления это будет соответствовать:

cp = 30,8 ?21,96.

Скорость реакции совпадает с угловым коэффициентом линии тренда, т. е. скорость будет равна w=30,8 мкМ/с.

Таблица 11

Рис. 10 — Кинетическая кривая опыта 2а Уравнение линии тренда имеет вид: y=34x — 23,68.

cp = 34 ?23,68.

Скорость будет равна w=34 мкМ/с.

Таблица 12

Рис. 11 — Кинетическая кривая опыта 3а

y=40x — 24,5

cp =40 ?24,5

w = 40 мкМ/с.

Таблица 13

Рис. 12 — Кинетическая кривая опыта 4а

y=49,7x — 25,36

cp =49,7 ?25,36.

w = 49,7 мкМ/с.

Таблица 14

Рис. 13 — Кинетическая кривая опыта 5а

y=60,2x — 24,68

cp =60,2 ?24,68.

w = 60,2 мкМ/с.

Таблица 15

Рис. 14 — Кинетическая кривая опыта 6а

y=68,5x — 21,2

cp =68,5 ?21,2.

w = 68,5 мкМ/с.

Оформим зависимость начальных скоростей реакции от начальных концентраций субстрата при наличии ингибитора в таблицу 16:

синтазный реакция гемин ингибитор Таблица 16

Изобразим график зависимости начальных скоростей реакции от начальных концентраций субстрата при наличии (опыты 1а?6а) и отсутствии (опыты 1?6) ингибитора. Для этого воспользуемся данными таблиц 7 и 16.

Рис 15 — Зависимость начальных скоростей реакции от начальных концентраций субстрата при наличии (1) и отсутствии ингибитора (2)

Проанализировав график можно сделать вывод о том, что ингибитор заметно снижает скорость реакции.

Переведем экспериментальные данные о начальных скоростях реакции и начальных концентрациях субстрата при наличии ингибитора в обратные величины, занесем их в таблицу 17 и построим график в данных координатах (рис. 16).

Таблица 17

Рис. 16 — Зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в двойных обратных координатах при наличии ингибитора (1) и его отсутствии (2)

Обработка данных в двойных обратных координатах:

— реакция без ингибирования;

— реакция с ингибированием.

По полученному расположению прямых на рис. 16 можно сделать вывод о том, что данное ингибирование относится к неконкурентному. Неконкурентный ингибитор не мешает связыванию субстрата с ферментом. Он способен присоединяться как к свободному ферменту, так и к фермент-субстратному комплексу с одинаковой эффективностью.

Исходя из источника, схема неконкурентного ингибирования:

(16)

? (17)

ES + I? ESI (18)

Причем:, K'=.

Если оба комплекса неактивны, т. е. не дают продукта, а константы их диссоциации равны между собой: K1=K', то это равносильно дополнительному условию: ингибитор не мешает взаимодействию субстрата с ферментом, но уменьшает скорость реакции из-за неактивности образующихся комплексов на поверхности фермента.

Выражение для начальной скорости реакции представимо в виде:

wo, I = (19), где

wmax, эф =. (20)

Рис. 17 — Зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата в двойных обратных координатах при наличии ингибитора (2) и его отсутствии (1)

Из выражения (19) видно, что при таком типе ингибирования изменяется предельная скорость процесса, а константа Михаэлиса остается постоянной. Из последнего соотношения можно получить выражение для константы ингибирования:

(21)

которое показывает, что константу ингибирования легко вычислить при известной начальной концентрации ингибитора, измеряя скорости реакции в отсутствие и в присутствии ингибитора.

По условию задания cI, o = 40мкМ.

Считываем данные с графика 16 и находим:

0, 0049 * 106; wmax = 204, 1 * 10−6.

0,0103 * 106; wmax, эф. = 97, 09 * 10−6.

Константа Михаэлиса остается постоянной и равной: КМ = 0,1 М.

Для расчета константы ингибирования известны все данные, и она равна:

= = 0,363 * 10−4

Уравнение Михаэлиса-Ментен для ферментативной реакции, осложненной конкурентным ингибированием:

wo, I = = .