Нитроксильные радикалы (HP) широко применяются во многих областях физико-химических и биологических исследований, в качестве контрастирующих добавок в процессах полимеризации и структурных единиц при конструировании органических ферромагнетиков. HP, будучи парамагнитными соединениями, используются в качестве спиновых зондов и меток для определения параметров микроокружения среды (полярность [1−3], вязкость [4−6], рН [7−9], концентрация кислорода [10−12]) с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). HP позволяют получать уникальную информацию при исследовании структурных характеристик биологических макромолекул и биомембран, в первую очередь на основе метода спиновых зондов [13]. Биомедицинское применение HP включает в себя их использование в качестве контрастирующих соединений в томографии [14−16] и физиологически активных соединений [17, 18].
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что исследование биологических систем с помощью HP проводится уже в течение 50 лет, до сих пор остаётся много нерешённых вопросов, что обусловленно как сложным характером биологических образцов, так и далеко не полным пониманием механизмов реакций HP с различными биологическими молекулами. Наиболее важными являются реакции окисления и восстановления, поскольку они не только отображают важную характеристику среды, так называемый окислительно-восстановительный статус, но и оказывают непосредственное влияние на интенсивность и даже на саму возможность детектирования сигнала ЭПР нитроксильных радикалов. Среди физиологически активных низкомолекулярных восстановителей аскорбиновая кислота (АК) и глутатион (ГЛ, GSH) в первую очередь отвественны за восстановление HP в различных тканях. Механизмы реакций HP с данными соединениями, как оказалось, были изучены недостаточно, несмотря на многочисленные публикации.
Другой важной физиологически активной молекулой, вступающей в многочисленные окислительно-восстановительные реакции в биологических системах, является оксид азота (N0). Специфическая реакция восстановления нитронилнитроксильного радикала (HHP) оксидом азота в иминонитроксильный радикал (ИНР) используется для детектирования N0 в отсутствии других восстановителей. Более того, в биологических средах HHP успешно используются как антагонисты NO несмотря на их быстрое восстановление до гидроксиламинов. Вопрос о механизме такого действия остаётся открытым.
Основными целями работы являлись:
• исследование механизмов реакций восстановления нитроксильных радикалов различных типов биологически важными восстановителями — аскорбиновой кислотой, глутатионом и оксидом азота;
• исследование механизма реакции HHP и N0 в восстановительной среде и разработка нового метода определения оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых HHP и 19 °F ЯМР спектроскопии на основе изученного механизма реакции.
Научная новизна работы. Изучен механизм восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой. Впервые было показано, что этот процесс характеризуется равновесием между нитроксильным радикалом и аскорбиновой кислотой с одной стороны, и гидроксиламином и радикалом аскорбата с другой стороны. Были обнаружены новые реакции, дающие существенный вклад в наблюдаемые кинетические кривые восстановления HP, а именно: окисление гидроксиламина радикалом аскорбата и дегидроаскорбиновой кислотой. Также было показано, что нитроксильные радикалы восстанавливаются продуктами разложения дегидроаскорбиновой кислоты, предположительно 2,3-дикетогулоновой кислотой. Впервые предложена и подтверждена математическим моделированием полная реакционная схема восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой.
Впервые показана роль глутатиона в восстановлении HP аскорбиновой кислотой. Хотя GSH не восстанавливает HP, но оказывает сильное влияние на их восстановление аскорбатом через восстановление продуктов окисления АК (радикал аскорбата и дегидроаскорбиновая кислота) обратно в аскорбиновую кислоту. Впервые измерена константа скорости реакции GSH с радикалом аскорбата (АР).
Проведено сравнительное исследование стабильности нитроксильных радикалов различных типов по отношению к восстановлению аскорбиновой кислотой. Показано, что стабильность HP уменьшается в ряду радикалов: пирролидин > имидазолидин > 3-имидазолина > 2-имидазолин-З-оксида (HHP). Было обнаружено, что замена метальных групп вблизи радикального центра нитроксида на этильные группы ведёт к увеличению стабильности соединений к восстановлению в присутствии как аскорбиновой кислоты, так и крови крыс.
Проведено исследование механизма реакции оксида азота и нитронилнитроксильных радикалов в восстановительной среде. Было показано, что HHP быстро восстанавливаются как в присутствии аскорбиновой кислоты, так и в биологической среде (гомогенат мозжечка крыс). Восстановленные формы (гидроксиламины) фторзамещённых HHP превращаются в соответствующие восстановленные формы (гидроксиламины) ИНР в присутствии оксида азота. Было показано, что гидроксиламины HHP не реагируют с оксидом азота с образованием гидроксиламинов ИНР. Для осуществления такого процесса необходимо реокисление гидроксиламинов HHP обратно в радикал с последующей реакцией между HHP и оксидом азота. Образующийся ИНР, в свою очередь, восстанавливается до соответствующего гидроксиламина. На основе экспериментальных данных впервые была предложена реакционная схема взаимодействия нитронилнитроксильных радикалов и оксида азота в восстановительной среде.
Был предложен новый метод регистрации оксида азота ex vivo основанный на методе 19 °F ЯМР спиновых ловушек с использованием фторзамещённых HHP.
Практическая ценность. В данной работе проведено детальное исследование механизма восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой, показана роль глутатиона в этом процессе. Полученные данные представляют несомненный интерес для исследователей, использующих HP как в качестве спиновых зондов, так и в качестве терапевтических соединений в биологических системах.
Предложен механизм нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота в восстановительных средах. На основе изученного механизма реакции предложен и апробирован метод регистрации оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых нитронилнитроксильных радикалов и спектроскопии 19Р-ЯМР.
В первой главе работы приведён обзор литературы, в котором рассмотрена реакционная способность нитроксильных радикалов как одноэлектронных окислителей и восстановителей по отношению к некоторым важнейшим биологически активным молекулам. В обзоре приведены примеры использования HP в качестве зондов на окислительно-восстановительный статус среды биологической системы. В последнем параграфе описан метод ЯМР спиновых ловушек, который был с успехом использован для детектирования ненаблюдаемых методом ЭПР диамагнитных продуктов окислительно-восстановительных реакций спиновых аддуктов.
Во второй главе приведены результаты исследования механизма восстановления HP аскорбиновой кислотой. Восстановление HP аскорбиновой кислотой сопровождается образованием гидроксиламина нитроксильного радикала (ГАН). Впервые было обнаружено, что ГАН реокисляется как радикалом аскорбата, так и дегидроаскорбиновой кислотой обратно в HP. Были определены соответствующие константы скоростей. В работе исследована роль глутатиона (важнейший восстановитель в биологических системах) в процессе восстановления HP аскорбиновой кислотой. Было показано, что глутатион сам не восстанавливает HP, но повышает эффективность восстановления HP аскорбиновой кислотой вследствие реакции радикала аскорбата с глутатионом. Интересные данные получены при исследовании сравнительной стабильности HP различных типов к восстановлению аскорбиновой кислотой. Показано, что стабильность радикалов уменьшается в ряду: пирролидин, имидазолидин, имидазолин и 2-имидазол-З-оксид. Изучено влияние введения этильных заместителей (вместо метальных) во второе и пятое положения гетероцикла HP на скорость восстановления аскорбиновой кислотой. Показано, что введение этильных заместителей вблизи радикального центра HP приводит к увеличению стабильности соединений.
В третьей главе приведены результаты исследования реакции нитронилнитроксильных радикалов с оксидом азота. Впервые предложен и экспериментально подтверждён механизм данной реакции в восстановительной среде. Показано, что, несмотря на быстрое восстановление, HHP реагирует с N0 с образованием гидроксиламина иминонитроксильного радикала. Продемонстрировано, что гидроксиламин ИНР образуется вследствие реакции между HHP и N0. При этом радикал HHP получается при реокисления соответствующего гидроксиламина. Применение фторзамещённых HHP позволило регистрировать превращение диамагнитного гидроксиламина HHP в гидроксиламин ИНР методом 19 °F ЯМР. В то же время, образование парамагнитного радикала HHP и его трансформацию под действием оксида азота в ИНР регистрировали методом ЭПР. На основе полученных результатов предложен метод определения количества оксида азота ex vivo с использованием фторзамещённых HHP и 19Р-ЯМР спектроскопии. Метод апробирован на животных на примере нескольких линий крыс, предположительно отличающихся уровнем генерации оксида азота. Наблюдалось хорошее согласие с результатами, полученными по измерению накопления нитритов и нитратов в крови животных.
Список использованных сокращений, реагентов и методик приведён в четвёртой главе данной работы.
Выводы.
1. Показано, что устойчивость нитроксильных радикалов убывает в ряду: пирролидиновые, имидазолидиновые, имидазолиновые и 2-имидазол-З-оксидные.
2. Нитроксильные радикалы с объёмными алифатическими заместителями во втором и в пятом положении пятичленного гетероцикла обладают повышенной стабильностью по сравнению с тетраметильными аналогами в восстановительных средах. Увеличение числа этильных групп около радикального центра нитроксида ведёт к увеличению стабильности нитроксильного радикала в этих условиях.
3. При исследовании механизма восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой показано, что в течении данной реакции происходит реокисление соответствующего гидроксиламина нитроксильного радикала как радикалом аскорбата, так и дегидроаскорбиновой кислотой обратно в нитроксид. Предложен полный механизм реакции. Вычислены константы скоростей всех элементарных стадий реакции восстановления нитроксильных радикалов аскорбиновой кислотой для ряда HP различных типов. Показано, что глутатион не восстанавливает HP, но увеличивает глубину восстановительного процесса в присутствии аскорбиновой кислоты.
4. Показано, что заключение гидрофобных HHP в липидную фазу увеличивает устойчивость HHP к восстановлению и позволяет использовать HHP для регистрации N0 в восстановительных средах методом ЭПР.
5. Показано, что гидроксиламины HHP не реагируют с оксидом азота. Окисление гидроксиламинов HHP в радикал является необходимой стадией для протекания реакции с оксидом азота с образованием ИНР. Предложен механизм реакции ННРс оксидом азота в восстановительной среде.
6. Разработана методика определения оксида азота в биологических средах с использованием фторзамещённых нитронилнитроксильных радикалов и спектроскопии 19Р-ЯМР для исследования роли оксида азота в патологиях крыс гипертензивного происхождения ex vivo.
Благодарности.
Автор чрезвычайно признателен своим научным руководителям — Багрянской Елене Григорьевне и Храмцову Валерию Владимировичу.
Автор благодарен Кирилюку Игорю Анатольевичу, Григорьеву Игорю Анатольевичу, Слепнёвой Ирине Алексеевне, Резникову Владимиру Анатольевичу, Мажукину Дмитрию Геннадьевичу, Колосовой Наталье Гориславовне, Сергеевой Светлане Владимировне, Маркелю Аркадию Львовичу, Шолоховой Лине Фёдоровне, Чаловой Ирине Владимировне, Глазачеву Юрию Ивановичу, Иртеговой Ирине Геннадьевне, знакомым, друзьям и родственникам.
Без помощи всех этих людей автор был бы бессилен что-нибудь сделать.
