Актуальность проблемы. Взаимодействия низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами лежат в основе самых разнообразных биохимических процессов, играющих фундаментальную роль в передаче генетической информации, биосинтезе белка и ряде других биохимических процессов. Изучение таких реакций современными инструментальными методами во многом предопределило прорыв в нашем понимании фундаментальных закономерностей молекулярной биологии и генетики. Составной частью таких исследований является использование биосенсорных технологий, основанных на изучении аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности преобразователя сигнала с помощью оптических, масс-селективных и электрохимических методов анализа. Несмотря на то, что условия взаимодействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными регуляторами и эффекторами различной природы отличаются от таковых в живой клетке, биосенсоры с ДНК в качестве элемента распознавания дают ценную информацию о специфичности связывания, молекулярных механизмах и биохимических реакциях организма в целом. Исследования в области ДНК-сенсоров активно стимулируются также исследованиями в области ранней диагностики и химиотерапии онкологических заболеваний. Здесь основной задачей является оценка доз противораковых препаратов и их концентраций в биологических жидкостях и лекарственных формах. ДНК-сенсоры активно применяются для скрининга новых потенциальных лекарств противоракового действия и в исследовании их фармакокинетики.
Перспективы биосенсорных технологий в решении фундаментальных и прикладных задач биохимии нуклеиновых кислот, токсикологии и фармакологии не в последнюю роль определяются совершенствованием принципов регистрации аналитического сигнала. В отличие от обнаружения определенных последовательностей олигонуклеотидов в диагностике генетического материала, взаимодействие аффинных реагентов с нуклеиновыми кислотами на поверхности преобразователя сигнала не приводят к существенным изменениям свойств поверхности. Это затрудняет применение масс-селективных детекторов, определяющих изменение массы поверхностного слоя, либо оптических методов, основанных на контроле характеристик самих нуклеиновых кислот. Как и в иммунохимических методах анализа, при разработке ДНК-сенсоров основной упор делают на использовании меток — низкомолекулярных соединений или фрагментов, включаемых в состав биологических мишеней. Изменение их сигнала в результате биохимического распознавания сенсоров позволяет установить присутствие определяемого вещества в растворе и оценить параметры его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В качестве таких меток применяют комплексы переходных металлов, некоторые органические медиаторы электронного переноса (ферроцены, витаминоподобные вещества, замещенные ароматические спирты и амины). Принципиальным недостатком такого подхода является необходимость в предварительном синтезе «меченых» последовательностей олигонуклеотидов или низкомолекулярных компонентов реакции, а также a priori невысокая чувствительность определения, связанная с конкурентным характером реакции.
Поэтому в последнее время большое внимание уделяется применению диффузионно свободных (растворимых) меток, называемых также маркерами. Их внедрение в поверхностный слой биосенсора происходит за счет электростатических взаимодействий либо специфического связывания с ДНК (интеркалирования). Несмотря на то, что использование маркеров усложняет процедуру измерения, достигаемые за счет этого преимущества в чувствительности и селективности определения заставляют совершенствовать структуру и способ измерения маркеров в зависимости от характера их взаимодействия с ДНК.
Применительно к электрохимическим способам регистрации сигнала, характеристики определения маркеров не в последнюю очередь зависят от характера их электрохимических превращений на электроде. Многие соединения, будучи эффективными интеркаляторами, окисляются на электродах с большим перенапряжением, необратимо, иногда с образованием нерастворимых продуктов олигомеризации и/или хемосорбции. Это не только затрудняет регенерацию биосенсора после измерения, но и осложняет интерпретацию сигнала, поскольку параллельно взаимодействию с ДНК происходит изменение условий пассивного диффузионного переноса маркеров к поверхности сенсора.
В этой связи, большой потенциал имеет включение в генерирование сигнала ДНК-сенсора дополнительных стадий каталитического превращения маркера, «отодвигающих» реакцию от поверхности и повышающую эффективность определения концентрации и окислительно-восстановительного статуса как индикатора аффинных взаимодействий с ДНК.
В этой связи, целью данной работы явилась разработка нового ДНК-сенсора, включающего для усиления сигнала маркеров (производных фенотиазина) индикаторный фермент (пероксидаза), обеспечивающий каталитическую регенерацию активной формы маркера в электродной реакции.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
— определить условия взаимодействия фенотиазиновых маркеров (метиленового синего и метиленового зеленого) с компонентами биочувствительного слоя (ДНК и пероксидаза), необходимые для регенерации активной формы индикатора и регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК на поверхности сенсора;
— найти рабочие условия иммобилизации пероксидазы и нативной ДНК в поверхностном слое, обеспечивающие воспроизводимый сигнал ДНК-пероксидазного сенсора и высокую чувствительность определения низкомолекулярных соединений — участников аффинных взаимодействий;
— изучить механизм взаимодействия фенотиазиновых маркеров, лекарственных препаратов, загрязняющих веществ с ДНК и установить механизм влияния природы маркеров, определяемых соединений и условий измерения на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора, его аналитические и операционные характеристикиразработать высокочувствительные методы определения указанных соединений и предложить способы контроля селективности отклика биосенсора путем варьирования природы медиатора и условий измерения сигнала.
Научная новизна работы заключаются в том, что: предложен и реализован на примере определения различных низкомолекулярных соединений биологического значения новый способ регистрации аффинных взаимодействий с участием ДНК, основанный на вовлечении электрохимически активного маркерапроизводного фенотиазйна — в сопряженную реакцию ферментативного окисления с электрохимической регенерацией активной формы маркераобосновано использование в составе ДНК-пероксидазных сенсоров для регистрации аффинных взаимодействий двух маркеров — метиленового синего и метиленового зеленого, обеспечивающих дифференциацию сигнала в зависимости от природы определяемого соединенияустановлен механизм генерирования сигнала ДНК-пероксидазного сенсора для соединений, различным образом реагирующих с ДНК, и предложены способы направленного изменения чувствительности сигнала ДНК-пероксидазного в отношении определяемых соединений — сульфаниламидов, антрациклинов, загрязняющих веществпоказана возможность использования ДНК-пероксидазного сенсора для регистрации повреждающего действия на ДНК радикалов гидроксида и защитного действия антиок-сидантов.
Практическая значимость работы состоит в том, что: предложены простые и удобные в использовании способы модификации стеклоуглерод-ных электродов нативной и денатурированной ДНК и пероксидазой, обеспечивающие возможность каталитической регенерации маркера в сопряженной электрохимической и биохимической реакции;
— разработаны методики определения сульфаниламидных препаратов, рубомицина, док-сорубицина, промазина, цефтазидима в нанои микромолярном диапазоне их концентраций;
— предложены подходы к оценке генотоксических свойств загрязнителей окружающей среды по их влиянию на сигнал ДНК-пероксидазного сенсора.
На защиту выносятся:
— результаты изучения электрохимического поведения фенотиазиновых маркеров на стек-лоуглеродном электроде, модифицированном ДНК, пероксидазой и их смесью и вывод о механизме взаимодействия маркеров с компонентами биочувствительного слоя и его влиянии на сигнал биосенсора;
— новый способ регистрации аффинных взаимодействий низкомолекулярных соединений с нативной ДНК по току восстановления маркеров — метиленового синего и метиленово-го зеленого — в присутствии определяемых соединений, отражающему скорость каталитической регенерации маркера в каталитическом цикле;
— результаты изучения влияния лекарственных соединений на сигнал ДНК-перокидазного сенсора и вывод о влиянии механизма их взаимодействия с ДНК на характеристики их определения в зависимости от природы маркера и условий измерения сигнала;
— оценка влияния ДНК-повреждающих факторов (на примере гидроксильных радикалов) и загрязняющих веществ на поведение ДНК-пероксидазного сенсора и вывод о возможности его использования для предварительного скрининга уровня загрязнения окружающей среды.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме по биокатализу «Biocatalysis-2002. Fundamentals and Applications» (Москва,
2002), 12 Международной конференции по аналитической химии EURO ANALYSIS 12
Дортмунд, Германия, 2002), 17 Международном симпозиуме по биоэлектрохимии (Флоренция, Италия, 2003), Международном симпозиуме по ДНК-сенсорам «New trends in nucleic acid based biosensors» (Флоренция, Италия, 2003),. VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, 2004), II Всероссийском симпозиуме «Тест-методы анализа» (Саратов, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика-2005» (Екатеринбург, 2005), Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа КАС-2004 (Рим, Италия, 2004), Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России-2004» (Москва), III научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ. «Материалы и технологии XXI века», Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2003).
Основные результаты изложены в 3 статьях и 7 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 44 рисунка и 14 таблиц. Состоит из введения, 5 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 178 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение ферментов для усиления сигнала биохимического распознавания связано, в первую очередь, с высокой эффективностью каталитического превращения низкомолекулярных субстратов. Это позволяет повысить чувствительность определения и за счет специфичности ферментативного процесса обеспечить селективность измеряемого сигнала, в том числе, в матрицах сложного состава (почвенные экстракты, биологические жидкости). Данный прием находит активное применение в традиционных областях иммунохимического анализа, где фермент включают в качестве метки в один из иммунореагентов, а образующийся комплекс выделяют на твердом субстрате (ELISA). Предлагаемые в данной работе подходы к определению биоаффинных взаимодействий с участием ДНК отличаются от методов иммуноферментного анализа, прежде всего, тем, что фермент и элемент биораспознавания (ДНК) не связаны между собой, а находятся в составе одного биочувствительного слоя на поверхности сенсора. Регистрируемый сигнал определяется конкурентным взаимодействием низкомолекулярного маркера, способного удерживаться в составе комплекса с ДНК и параллельно участвовать в пероксидазной реакции восстановления гидроксида водорода в качестве медиатора переноса электрона. Высокая подвижность субстратного цикла с участием MC и МЗ приводят к тому, что даже слабые взаимодействия с участием ДНК и конкурирующих лекарственных препаратов и загрязняющих веществ приводят к изменениям сигнала биосенсора. Реализация представленного механизма формирования сигнала требует выполнения следующих условий:
— состав поверхностного слоя должен обеспечивать доступность потенциальных центров связывания ДНК и пероксидазы для взаимодействия с субстратом;
— относительная прочность связывания маркеров и обратимость их взаимодействия с ДНК должна обеспечивать необходимый перенос MC и МЗ к активным центрам пероксидазы;
— электрохимические превращения маркеров на поверхности электрода — преобразователя сигнала — должны быть обратимы для обеспечения замкнутого цикла превращения маркеров непосредственно в биочувствительном слое.
Достижение указанных условий было обеспечено путем подбора состава компонентов биочувствительного слоя и рабочий условий измерения сигнала. Селективность регистрации различных определяемых веществ, как и для других биоаффинных методов, определяется аффинностью соответствующих взаимодействий. С определенными оговорками, на нее можно повлиять путем подбора продолжительности инкубирования, концентрация маркера и его природы. Так, совместное рассмотрение сигналов МС и МЗ позволяет установить специфичность связывания определяемых веществ с ДНК на фоне присутствия других субстратов пероксидазы, находящися в объекте контроля.
Самостоятельное значение имеет область применения ДНК-пероксидазных сенсоров, связанная с групповой оценкой состава по показателям качества — например, по антиоксидантной активности или повреждающему действию на ДНК. Такие биосенсоры могут найти применение в биомедицинской практике при оценке эффективности лекарственной терапии и выборе индивидуальных доз лекарственных препаратов, а также в контроле уровня загрязнения и потенциальной опасности суммы загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду.
