Технология биологически активных добавок к пище на основе ферментативного гидролиза гонад гидробионтов

Актуальность работы. В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные являются перспективными лекарственными средствами и биологически активными пищевыми добавками (БАД). Для получения препаратов ДНК используют различные сырьевые источники: бактериальные клетки, эритроциты цыплят, тимус телят, селезенка и печень мышей и крыс, молоки сельди, карпа, осетровых и других видов рыб (Пашук и др., 1995). Препараты ДНК из молок лососевых и осетровых обладают наиболее эффективным фармакологическим действием (Патент РФ № 915 446- Каплина, 2000).

Анализируя известные литературные данные, можно сделать заключение о том, что область применения ДНК зависит от ее молекулярной массы. Например, ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой применяется в кардиологии при лечении ишемической болезни сердца (Патент РФ № 95 103 961), в онкологии при профилактике и лечении рака (А.С. 1 804 852 SU), для профилактики инфекционных заболеваний (Патент РФ № 2 063 228). Олигонуклеотиды, нуклеозиды и производные тимидина могут использоваться при лечении ВИЧ-инфекции (Хаитов, Игнатьева, 1992).

Основным источником получения БАД на основе ДНК являются молоки лососевых и осетровых. Известно несколько способов получения ДНК, которые основаны на солевой экстракции молок и последующем спиртовом осаждении. Однако ДНК, получаемая таким способом и используемая в качестве БАД, характеризуется высокой молекулярной массой и слабой растворимостью в воде, что ограничивает сферу ее применения.

Актуальность проблемы, поставленной в данной работе, определяется необходимостью создания биодоступных препаратов ДНК из распространенных видов сырья. Использование для этой цели ферментативного гидролиза позволит регулировать не только физико-химические свойства (растворимость и вязкость, молекулярный состав) (Mahmoud, 1994), но и, возможно, биологическую активность получаемых БАД.

При ферментативном воздействии на ткань гонад гидробионтов важны определение активности и специфичности ферментов, участвующих в гидролизе нуклеопротеидов (экзогенных, входящих в состав комплексных ферментных препаратов, и эндогенных, содержащихся в молоках).

Известно, что в панкреатической ткани большинства видов животных, в том числе ракообразных, имеется широкий набор ДНКаз (Вакорина и др., 1997). Наиболее полно изученным и широко используемым ферментом этой группы является ДНКаза I (КФ 3.1.4.5), выделенная из панкреаса быка. Основной ее функцией является деградация ДНК. Имеется ряд работ по исследованию ДНКаз, выделенных из гепатопанкреаса краба (Вакорина и др., 1997; Мензорова и др., 1993; Мензорова и др., 1994), криля (Chou and Liao, 1990). ДНКазы панкреатических органов рыб являются мало изученными (Rasskazov et al., 1975).

В гонадах гидробионтов обнаружен ряд гидролитических ферментов, выполняющих различные функции клеточного метаболизма. Например, из молок чавычи (Yamomoto, 1971), скумбрии (Cordonnier and Bernardi, 1968), кеты, минтая (Галкин и др., 1991) выделены кислые ДНКазы, различающиеся между собой по свойствам. Спермии морского ежа S. Intermedius содержат три разные ДНКазы: кислую и две щелочные металлозависимые (Сибирцев и др., 2001). Как полагают многие исследователи, роль этих ферментовучастие в апоптозе — программируемой клеточной гибели. Однако сведений о протеолитических ферментах, а также ДНКазах особенно щелочных, содержащихся в гонадах рыб, моллюсков, иглокожих в литературе недостаточно для выявления механизма их действия и роли в процессах деградации ДНК.

Сравнительное изучение ферментов эндогенного и экзогенного происхождения необходимо для обоснования технологии получения препаратов ДНК из данного вида сырья, определения взаимосвязи между свойствами ферментов, составом нуклеиновых кислот и биологической активностью получаемых препаратов.

Цель исследований заключалась в разработке технологии БАД из гонад гидробионтов на основе воздействия ферментов эндогенного и экзогенного происхождения, а также в исследовании состава, свойств и биологической активности полученных БАД.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

— провести скрининг объектов по содержанию ДНК, активности эндогенных протеаз и нуклеаз в гонадах гидробионтов;

— осуществить подбор рациональных параметров ферментативного гидролиза нуклеопротеидов гонад рыб и беспозвоночных;

— исследовать состав и физико-химические свойства препаратов, полученных в результате ферментативного гидролиза из гонад различных видов гидробионтов;

— разработать способ получения БАД из гонад гидробионтов;

— разработать НД на БАД из гонад гидробионтов;

— провести оценку безопасности, исследовать биологическую активность, провести клинические испытания полученных препаратов.

Научная новизна: Разработана и научно обоснована технология получения БАД из гонад гидробионтов.

Впервые проведено сравнительное исследование протеои нуклеолитических ферментов в мужских гонадах 13 видов гидробионтов.

Проведены сравнительные кинетические исследования микробиальных, а также содержащихся в панкреатической ткани рыб, крабов ДНКаз.

Исследован состав нуклеиновых компонентов препаратов из гонад гидробионтов, полученных разными способами: ферментативным («Нуклеатин» и низкомолекулярная ДНК) и методом спиртового осаждения нуклеопротеидный комплекс).

Показано, что эндогенные ферменты являются инициаторами ферментативной деструкции нуклеиновых кислот, влияющими на конечный состав препаратов. Установлено, что при отсутствии или следовой активности ферментов эндогенного происхождения степень гидролиза нуклеопротеидов с участием экзогенных ферментов низка.

Практическая значимость. Разработан эффективный способ получения БАД, в основу которого положен ферментативный гидролиз гонад гидробионтов и фракционирование олигонуклеотидов с помощью ультрафильтрации.

Способ получения ферментативного гидролизата из молок рыб защищен патентом № 2 171 066 от 22.03.2000: «Продукт, обогащенный аминокислотами и способ его получения».

По результатам экспертной оценки и санитарно-химических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Нуклеатин» соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078−01, МУК 2.3.2. 21−98 и зарегистрирован как БАД (Per. удостоверение № 77.99.02.928.Б.258.08.03).

Разработана и утверждена нормативная документация на БАД «Нуклеатин» ТУ № 9283−026−38 155−02, ТИ№ 36−215−02.

Выпущена опытно-промышленная партия «Нуклеатина».

Проведены медико-биологические испытания «Нуклеатина» и показано, что он может быть использован в качестве БАД в кардиологии, офтальмологии, при лечении острых вирусных заболеваний, а также в качестве радиопротекторного средства.

Апробация работы: основные положения были представлены и доложены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999) — Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000) — межрегиональной научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика. Проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000) — Международной научно-практической конференции «Прибрежное рыболовство — XXI век» (г. Южно-Сахалинск, 2001) — Всероссийской конференции молодых ученых «Рыбохозяйственная наука на пути в XXI век» (Владивосток, 2001) — Международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, Голицино, 2002), Всероссийской конференции молодых ученых (Мурманск, 2002).

Положения, выносимые на защиту: сравнительная характеристика субстратной специфичности ферментов панкреатических органов лососевых рыб, млекопитающих, беспозвоночных, а также микроорганизмоввлияние эндогенных ферментов (протеаз и нуклеаз) гонад гидробионтов, являющихся инициаторами гидролиза нуклеопротеидов, на молекулярный состав олигонуклеотидовспособ получения олигонуклеотидов из гонад гидробионтов включающий ферментативный гидролиз и разделение компонентов по молекулярным массамсостав препаратов, получаемых методом ферментативного гидролиза из гонад гидробионтов, характеристика биологической активности.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 100 источников (в том числе 41 зарубежный). Работа изложена на 160 страницах, содержит 11 таблиц, 15 рисунков и 8 приложений.

Выводы.

1. Разработана технология получения БАД из гонад гидробионтов на основе ферментативного гидролиза белков и нуклеиновых кислот.

2. При сравнительном исследовании состава ферментов эндогенного происхождения в гонадах 13 видов гидробионтов обнаружено: преобладание кислых ДНКаз в большинстве объектов (кроме лемонемы), следовая активность щелочных Са, Mg-зависимых ДНКаз у минтая, гребешка, осьминога и отсутствие протеолитической активности в гонадах гребешка, акулы-катрана и осьминога.

3. На основании исследования кинетических параметров ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот установлена целесообразность применения ферментных препаратов, выделенных из панкреатических органов рыб и крабов, как наиболее эффективных и специфичных для получения растворимых олигонуклеотидов.

4. Показано влияние активности протеаз и ДНКаз эндогенного происхождения гонад гидробионтов на состав олигонуклеотидов при получении БАД.

В составе ферментных гидролизатов, полученных из гонад с высокой активностью протеаз и ДНКаз, обнаружены и олигонуклеотиды, и низкомолекулярные нуклеиновые кислоты, в гидролизатах, полученных из гонад с низкой активностью ферментов и/или ее отсутствием, преобладают высокомолекулярные нуклеиновые компоненты.

5. Предложена модель механизма влияния эндогенных ферментов на процесс деструкции ДНК из гонад гидробионтов, которая основана на активации эндогенных ДНКаз протеазами, существенно увеличивающий доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов, используемых в технологическом процессе.

6. Показано, что БАДы из гонад гидробионтов обладают широким спектром биологической активности, выражающейся в стимуляции синтетических процессов на примере метаболизма одноклеточных тест-объектов Т. pyriformis и высших животных, а также в антиоксидантном и радиопротекторном действии.

7. Утверждена нормативно-техническая документация на БАД «Нуклеатин», выпущена опытно-промышленная партия.

Заключение

.

Полученные результаты позволили разработать новые БАД, содержащие водорастворимую форму ДНК, набор свободных аминокислот, в том числе незаменимых, и пептидов и обладающие широким спектром лечебно-профилактических и общеукрепляющих для организма человека свойств. В работе был использован метод ферментативного гидролиза гонад гидробионтов и осуществлен поиск его оптимальных параметров. Проведено сравнение как протеолитических, так и нуклеазных активностей эндогенных и экзогенных ферментов.

С целью выяснения структурных особенностей того или иного вида сырья, способности к ферментативной деструкции, а также для выявления новых источников получения БАД, из гонад различных видов гидробионтов были приготовлены ферментативные гидролизаты. По накоплению низкомолекулярных продуктов оценивали перспективность использования молок различных видов рыб и беспозвоночных для выделения водорастворимой ДНК.

В гонадах рыб и беспозвоночных выявлены протеолитические и нуклеазные ферменты, оказывающие значительное влияние на состав препаратов, получаемых ферментативным способом. Значения скорости гидролиза белков и нуклеиновых кислот зависели от вида объектов, рН среды, концентрации ткани в реакционной смеси. Во всех исследуемых объектах преобладающей явилась активность кислых дезоксирибонуклеаз.

Наибольшее значение активности кислых ДНКаз наблюдалось в молоках горбуши, показатели активности щелочных ДНКаз самые высокие в молоках сельди.

При исследовании дезоксирибонуклеазной активности используемых ферментных препаратов были рассмотрены кинетические закономерности. На основании кинетических характеристик пары фермент — субстрат определены приоритеты по применению ферментных препаратов. Если для гидролиза белков могут быть использованы все исследуемые в работе препараты, то для того, чтобы добиться высокой степени гидролиза нуклеиновых кислот, целесообразнее применять пилорин и гепатопанкреатин. Дезоксирибонуклеазы, выделенные из пилорических придатков лососей обладали наибольшим сродством к ДНК молок рыб этого вида при самой высокой скорости гидролиза.

Состав препаратов, получаемых из гонад различных видов гидробионтов с помощью ферментативного гидролиза, определялся активностью эндогенных протеолитических и нуклеазных ферментов. Эндогенные нуклеазы и протеазы молок гидробионтов инициировали процесс гидролиза нуклеиновых кислот и облегчали доступность субстрата для экзогенных ферментных препаратов. Таким образом, показана взаимосвязь активности эндогенных нуклеаз в молоках гидробионтов, молекулярной массы продуктов ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот и биологической активности препаратов на их основе.

На основании проведенных исследований разработана технология получения водорастворимой формы ДНК из гонад гидробионтов «Нуклеатин», в которую была включена стадия фракционирования олигонуклеотидов посредством ультрафильтрации. Данная стадия позволила получить более очищенные препараты, на основе которых можно будет в дальнейшем проводить разработки новых лекарственных форм. Разработанный метод выгодно отличается от известного метода (спиртового осаждения) получения нуклеопротеидного комплекса из молок лососевых по многим параметрам: во-первых, для производства не требуется применение органических растворителей, во-вторых, получаемый препарат обладает хорошей растворимостью в широком диапазоне рН, что расширяет сферу его применения, в-третьих, за счет комплексного состава «Нуклеатина» проявляются новые биологические свойства. Кроме того, для производства можно использовать не только молоки лососевых, но и другие распространенные виды сырья. По результатам исследований разработаны рекомендации по применению препаратов, полученных из гонад разных видов гидробионтов.

Медико-биологические испытания БАД «Нуклеатин» показали ее безопасность. Были исследованы следующие показатели биологической активности: антиокислительная и влияние на физическую работоспособность. Кроме того, было исследовано влияние препаратов на рост и развитие инфузорий Tetrahymena pyriformis. Добавка препаратов к основному субстрату в низких дозах стимулировала усвоение его питательных составляющих, что совпадает с биологической активностью компонентов препарата.

Таким образом, «Нуклеатин» можно рекомендовать как общеукрепляющее средство, обеспечивающее интенсификацию внутриклеточного метаболизма как отдельных систем, так и всего организма в целом, и активно влияющее на общие и местные механизмы его регуляции.