Экологические предпосылки гетерогенности популяций хантавирусов и вирусов комплекса клещевого энцефалита в Западной Сибири

Актуальность темы

.

Серьезной проблемой контроля эпидемической активности природных очагов вирусных инфекций является чередование периодов относительного эпидемического благополучия с труднопредсказуемыми периодами эпидемической активности. Так, в последние два десятилетия в России не только отмечались периодические существенные подъемы и спады заболеваемости населения такими традиционными формами, как клещевой энцефалит (КЭ) и геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), но и активизировались после длительного периода покоя природные очаги лихорадки Западного Нила (ЛЗН), Крымской-Конго (КГЛ) и омской (ОГЛ) геморрагических лихорадок.

В Российской Федерации ГЛПС по показателям заболеваемости лидирует среди зоонозных вирусных инфекций, и занимает одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека (ТкасЬепко е1 а1., 1998), при этом абсолютное число случаев заболевания — 97% - приходится на Европейскую часть России, 3% - на Азиатскую часть, главным образом, на Дальний Восток (Ткаченко, 2000). Распространение очагов хантавирусов в Сибири длительное время определялось представлениями о дизъюнкции ареала хантавирусов (Лебедев, 1964). В настоящее время установлено, что из 30 серологически и/или генетически различающихся хантавирусов (8с1тта1]" о1ш е! а1., 1983; РЫбшп е1 а1., 1994; РЬвпт, е1 а1. г 1999; Аузк-гирапс е1 а1., 1995; ЗсЬтаЦоЬп, Н]е11е, 1997; и др.), только для 4 генотипов показана роль возбудителей ГЛПС — Хантаан, Сеул, Пуумала и Добрава (ЗсЬшаЦоЬп, Н]е11е, 1997). Сочетание новых представлений о популяционной гетерогенности состава хантавирусов, с полученными в 60х — 80х годах 20го века данными о находках хантавирусного антигена у грызунов в лесной и тундровой ландшафтных зонах Западной Сибири (Апекина и др., 1990; Мясников и др. г 1984; Мясников и др., 1991), определяли целесообразность проведения исследований по проблеме ГЛПС в регионе.

Клещевой энцефалит (КЭ) продолжает занимать второе место в России (после ГЛПС) по уровню заболеваемости населения зоонозными инфекциями вирусной природы. К настоящему времени является доказанным положение о популяционной гетерогенности вируса клещевого энцефалита фактически на любой территории в пределах его нозоареала (Злобин, Горин, 1996; Леонова, 1997), в связи с чем предпринимаются попытки сопоставить регистрируемую гетерогенность с особенностями клинического течения КЭ у людей (Леонова, 1997). Сведения о неоднородности состава популяций вируса ВКЭ в Западной Сибири к настоящему времени определяются представлениями о распространении генетически различающихся субтипов в пределах административных территорий субъектов Федерации. Целесообразным является изучение распространения генетических вариантов ВКЭ в условиях различных ландшафтов региона, в том числе — в зоне перекрытия нозоареалов клещевого энцефалита и омской геморрагической лихорадки. Природные очаги последней вновь активизировались в последнее десятилетие 20го века после 30™ -летнего периода эпидемического и эпизоотического благополучия^ До настоящего времени отсутствуют достоверные данные о путях резервации вируса ОГЛ. Интенсивное развитие исследований ОГЛ было прервано в начале 70х годов в связи с полным прекращением эпидемической и эпизоотической активности природных очагов ОГЛ в пределах всего нозоареала. Активизация природных очагов ОГЛ дала возможность продолжить исследования с учетом современных возможностей молекулярной биологии.

Исследование проблемы гетерогенности популяций хантавирусов и вирусов комплекса клещевого энцефалита на молекулярно-генетическом уровне будет способствовать решению как практических задач эпидемиологии, так и проблем общебиологического плана, связанных с таксономией и эволюцией вирусов.

Цель и задачи исследования

.

Целью работы являлось изучение феномена гетерогенности состава популяций хантавирусов и вирусов комплекса клещевого энцефалита в Западной Сибири.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

1. Оценить видовой состав и характер распределения в различных ландшафтных зонах Западной Сибири хантавирусов и вирусов комплекса клещевого энцефалита.

2. Оценить феномен штаммовой гетерогенности хантавирусов (в т.ч. возбудителей ГЛПС) и вирусов комплекса клещевого энцефалита внутри различных ландшафтных зон Западной Сибири.

3. Оценить степень участия пространственно-географического аспекта изоляции хантавирусов и вирусов комплекса клещевого энцефалита в формировании и поддержании феномена популяционной гетерогенности.

4. Оценить степень участия экологического аспекта изоляции хантавирусов и вирусов комплекса клещевого энцефалита (на примере Ьоэ^ эффекта) в формировании и поддержании феномена популяционной гетерогенности.

Научная новизна работы.

В Западной Сибири впервые была установлена гетерогенность состава хантавирусов, оценен характер ландшафтного и биотопического распространения их природных очагов, описан (единовременно и независимо от финских исследователей) новый генотип хантавирусов, ассоциированный с популяциями леммингов на Таймыре (получивший название Топографов по представлению финских коллег). Показано значение реассортации и рекомбинантных событий в формообразовании западносибирских хантавирусов Пуумала и Тула.

Впервые на юге Западной Сибири оценены особенности ландшафтного и биотопического распространения различных субтипов и геновариантов ВКЭ. Полууенные результаты указывают на общность происхождения природных очагов КЭ юга Западной Сибири и европейских территорий.

Впервые по результатам секвенса двух генов вирусов ОГЛ показана высокая пространственная и временная консервативность штаммов ОГЛ, предполагающая отсутствие существенного генетического дрейфа. Показано, что вирусы ОГЛ образуют компактную группу изолятов в пределах вирусов комплекса КЭ, филогенетически наиболее близкую западному субтипу ВКЭ.

Практическая ценность работы.

Впервые определены и депонированы в Международный компьютерный банк данных вепВапк нуклеотидные последовательности М (АР367 061- АЕ442 615- АР442 616- АР442 617) и Б-сегментов {АР367 064- АЕ367 065, АР367 066- АР367 067- АЕ367 069- АР367 070- АЕ367 071) геномов западносибирских изолятов хантавирусов генотипа Пуумалануклеотидные последовательности структурной части Б-сегмента западносибирских изолятов хантавирусов генотипа Тула (АР442 618- АР442 619- АЕ442 620- АГ442 621). Показана эпидемическая значимость на территории Западной Сибири хантавирусов генотипов Пуумала и ДобраваБелград.

В ГКВ и-та вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН депонированы штаммы вируса ОГЛ «Ондатра-М1-Курган-1992» (ГКВ № 958) — «Ондатра-19М-НСО-1989» (ГКВ № 962) — «Ондатра-15П-НСО-1989» (ГКВ № 961) — «Ондатра-31П-НСО-1989» (ГКВ № 960) — мОндатра-31М-НСО-1989″ (ГКВ № 940) — и штаммы вируса КЭ «41-А.Аауезсеп8- НСО (Карасук) — 1989» (ГКВ № 943) — «Ыетепа-Омск (Тюкалинск)-1986» (ГКВ № 942) и «Ыетепа-Омск (Черлак)-1986» (ГКВ № 959). Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов Е (длиной 545 и 597 н.к.) у 20 штаммов, и N85 (длиной 596 н.к.) — у 16 штаммов вируса омской геморрагической лихорадки, в том числе у.

17 штаммов, изолированных в современный период активности очагов с трех административных территорий региона (Курганская, Омская и Новосибирская обл.).

На защиту выносятся следующие положения:

• Хантавирусы на территории Западной Сибири представлены 4 генотипами — Топографов, Пуумала, ДобраваБелград и Тула, распространение природных очагов которых в регионе имеет выраженную ландшафтно-биотопическую приуроченность. Спорадическая заболеваемость населения ГЛПС, регистрируемая на юге Западной Сибири, вызывается хантавирусами генотипов Пуумала и ДобраваБелград.

• В пределах северной и средней тайги Западной Сибири имеет место разрыв ареала хантавирусов.

• Происхождение западносибирских хантавирусов генотипов Пуумала и Тула связано с геновариантами северной и (или) центральной Европы. Формообразование западносибирских геновариантов хантавирусов связано с механизмами рекомбинации и (или) реассортации (малый и средний сегменты генома).

• Штаммовое разнообразие вирусов клещевого энцефалита на юге Западной Сибири (Омская и лесостепные территории запада Новосибирской обл.) представлено восточным, западным и урало-сибирским субтипами, распределение которых по территории имеет выраженные ландшафтные особенности. Полный комплекс геновариантов и субтипов регистрируется только в лесостепном ландшафте. Доминирование урало-сибирского субтипа при значительном участии западного, определяет близость западносибирских очагов ВКЭ восточно-европейским.

• Эпизоотическая активизация природных очагов омской геморрагической лихорадки (ОГЛ) в современный период происходит в рамках известных эндемичных территорий.

• Штаммы вируса ОГЛ образуют компактную группу (независимо от времени, места и источника изоляции) в пределах комплекса КЭ, наиболее близкую западному субтипу ВКЭ.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита», Иркутск, 1990; Международной научной конференции «Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами», Листвянка, Иркутск, 1996; Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 75-летию ОНИИПИ, Омск, 1996; Всероссийской научно-практической конференции «Природноочаговые инфекции в России: современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения», Омск, 1998; Научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М. ГЬЧумакова, Москва, 1999; Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ОНИИПИ, Омск, 2001; Пятой Международной конференции «HFRS, HPS and hantaviruses», Франция, 2001; Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2002; 8 Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002; Российско-американском семинаре «Экология инфекционных заболеваний». Новосибирск, ГНЦ ВБ «Вектор», 2002; Межгосударственном семинаре «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 2003; 4th International Conferences on Emerging Zoonoses. Ames, USA, September 18−21,.

2003; International Conference on Emerging Infectious Diseases. Atlanta, February 29 — March 3, 2004.

По материалам диссертации имеется 30 публикаций.

Объем и структура диссертации.

Предлагаемая диссертационная работа состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (218 отечественных и зарубежных источников) и 9 приложений. Объем работы составляет 282 стр. машинописного текста, в том числе 38 таблиц и 48 рисунков.

Результаты исследования изолятов с территории очагов ОГЛ с использованием ОТ ПЦР демонстрируют присутствие ампликонов двух типов — полученных с использованием специфических праймеров к ОГЛ и к ВКЭ соответственно. Последующий секвенс подтверждает присутствие обоих вирусов. Наличие подобных естественных микстов не обязательно связано с работой с объединенными пробами исследуемых организмов (как это имеет место при работе с членистоногими убежищного комплекса), что показывает возможность сосуществования в организме одной особи хозяина (по крайней мере на протяжении ограниченного числа пассажей) вирусов ОГЛ и КЭ. Эксперименты на убежищных членистоногих продемонстрировали элиминацию ВКЭ при длительном (более 2 месяцев) существовании в условиях микст-инфекции.

Филогенетический анализ изолятов ОГЛ с представителями комплекса ВКЭ показывает достоверную дистанцированность данного вируса от всех известных представителей комплекса, включая вирус Кьяссанурской лесной болезни (КЛБ). С другой стороны, штамм вируса комплекса КЭ Алькурма, изолированный в Саудовской Аравии, практически идентичен (на участках генов Е, NS1 и NS5) вирусу КЛБ. Как известно, клинические проявления вируса ОГЛ и КЛБ имеют сходные черты, вирус Алькурма также вызывает лихорадку с выраженной геморрагией. Эти обстоятельства позволяют ставить под сомнение целесообразность применения клинических критериев (критерий нозоформы) в систематике по крайней мере вирусов комплекса клещевого энцефалита. составе циклов циркуляции ВКЭ эпидемически значимых переносчиков или уровня их численности.

5. При наличии выраженного селективного воздействия организма хозяев из числа членистоногих в условиях лабораторного эксперимента на некоторые штаммовые характеристики ВКЭ, уровень выявленного воздействия не обнаруживает изменений систематического положения исследуемых штаммов внутри группы ВКЭ.

6. Регистрируемая эпидемическая и эпизоотическая активизация природных очагов омской геморрагической лихорадки на юге Западной Сибири территориально перекрывает известные эндемичные территории (период 40х — 70х гг. 20 века).

7. Изоляты вируса ОГЛ характеризуются высоким уровнем консерватизма на участках гена Е и NS5. Выраженной географической (кром^ изолята из Курганской обл.) и временной вариабельности изолятов не выявлено. На участках данных генов вирус ОГЛ наиболее близок западному субтипу ВКЭ в связи с наличием выраженной нуклеотидной гомологии наг отдельных фрагментах. Размах нуклеотидной и аминокислотной дивергенции вируса ОГЛ перекрывается с таковым у западного субтипа ВКЭ. #.

8. Членистоногие убежищного комплекса и гидробионты из числа Diptera и Hydrachnidae в периоды эпизоотической активности очагов ОГЛ включаются в циркуляцию возбудителя. Членистоногие убежищного комплекса из числа доминирующих в сообществе видов мезостигматных клещей, адаптированных к обитанию в гнездах или убежищах позвоночных-хозяев, способны резервировать вирусы ОГЛ и КЭ и обеспечивать переживание неблагоприятного периода существования очагов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хантавирусы.

В продолжение работ предшествующего периода (Мясников и др., 1984, 1991, 1992), поставивших под сомнение наличие дизъюнкции ареала ГЛПС на территории Сибири, проведена оценка распространения хантавирусов (в том числе — возбудителей ГЛПС), их генотипического состава, путей вероятного происхождения, эпизоотической и эпидемической активности в различных ландшафтных зонах Западной Сибири, от переходных тундр до степей.

Результаты исследований показывают, что на территории Западной Сибири циркулируют хантавирусы 4 генотипов — ТопографовУГаймыр, Пуумала, ДобраваБелград и Тула, в том числе 2 (Пуумала и Добрава) являются возбудителями ГЛПС. Распространение хантавирусов неравномерно и связано с определенными ландшафтами. Так, генотип Топографов в условиях Западной Сибири распространен в зонах переходных и северных субарктических тундрПуумала и Добрава — в подзонах мелколиственных лесовТула — в степях. В Обь-Енисейском (северная тайга) и Обь-Иртышском (средняя тайга) междуречьях по-видимому действительно существует разрыв ареала хантавирусов, также как отсутствуют постоянные, эпизоотически активные очаги хантавирусов в подзоне южной тайги и зоне лесостепи к востоку от р. Ишим (Омская и Новосибирская обл.).

Генотип ТопографовУГаймыр обнаружен в популяции сибирского лемминга в припойменных тундрах рек северного (Уара1аМ е1 а1., 1999) и юго-западного (наши данные) Таймыра. Изоляты, полученные с северных и южных территорий Таймыра характеризуются высоким уровнем нуклеотидной гомологии, что позволило их отнести к единому генотипу (Топографов). Выраженная стенотопность распространения данного вируса позволяет говорить о его происхождении от южных форм хантавирусов в процессе формирования арктических и субарктических ландшафтов.

Эпизоотически активные очаги генотипа Пуумала на территории Западной Сибири локализованы в подзоне мелколиственных лесов (подтайге) к западу от долины р. Иртыш, биоценотически приурочены к реликтовым липовым и заболоченным осиново-березовым лесам в Ишим-Иртышском междуречье. Основными хозяевами данного генотипа в сибирских очагах являются рыжая и красно-серая полевки. В таежную зону возбудитель проникает, по-видимому, по долинам рек, где может формировать псевдоочаги, существующие на протяжении длительности жизни инфицированных животных. Результаты секвенса 8 и М-сегментов геномов полученных изолятов показывают высокий уровень гомологии (вплоть до идентичности отдельных изолятов) западносибирских изолятов, независимо от вида источника изоляции (рыжая или красно-серая полевки), места и времени изоляции. Результаты секвенса 8 и М-сегментов геномов сибирских изолятов позволяют говорить о происхождении данных вариантов в результате реассортации 8 и М-сегментов вариантов, идентичных карело-финским и центрально-европейским в местах совместной циркуляции при экспансии Пуумала-подобных вирусов в Восточную Европу. Конечный (сибирский) вариант по-видимому сформировался в результате контактов геновариантов Пуумала, циркулирующих в южном и северном Приуралье. Есть основания предполагать, что на территории среднего Зауралья возможны находки всех трех геновариантов Пуумала. Эпидемические проявления природных очагов Пуумала в западной Сибири носят эпизодический локальный характер. Это же относится и к генотипу ДобраваБелград, существование которого обнаружили по наличию заболевания у людей. Природных очагов данного генотипа к настоящему времени выявить не удалось.

Эпизоотически активные природные очаги генотипа Тула локализованы в зоне степи, с возможностью выноса в лесостепную зону по долинам рек. Циркуляция хантавируса осуществляется в популяциях узкочерепной полевки и степной пеструшки. Результаты секвенса 8-сегмента полученных изолятов показывают наличие в уровне гомологии внутри группы, связанной с видом источника изоляции, что может быть объяснено особенностями пространственной структуры этих видов грызунов. Филогенетический анализ показывает наличие более высокого уровня гомологии в структурной части гена, кодирующего нуклеокапсидный белок, западносибирских изолятов с центрально-европейскими, чем с российскими (Тульская обл.). Наличие в геноме западносибирских изолятов участков возможной рекомбинации, позволяют предполагать происхождение данных вариантов в процессе экспансии разных геновариантов данного генотипа из Центральной в Восточную Европу, подобно хантавирусам генотипа Пуумала.

Вирусы клещевого энцефалита и омской геморрагической лихорадки.

ВКЭ. В продолжение ранее проведенных исследований (Злобин, Горин, 1996; Леонова, 1997; Беликов, 2000; и др.), показавших циркуляцию на территориях отдельных крупных регионов полного или почти полного набора субтипов и геновариантов ВКЭ, в данной работе показана неоднородность штаммового состава ВКЭ в различных ландшафтных зонах регионов Западной Сибири (Омская и западные части Новосибирской обл.) и горного Алтая. Независимо от ландшафтной принадлежности, на указанных территориях Западной Сибири в природных очагах ВКЭ абсолютно доминируют два субтипа — западный и урало-сибирский (с преобладанием второго), что является критерием, сближающим восточно-европейские и западносибирские территории. Принципиальным является то, что в зональных ландшафтах, каковыми являются тайга и степь, регистрируются только два субтипа ВКЭ — западный и урало-сибирский. Интразональный ландшафт, каковым является лесостепь, характеризуется наличием очагов ВКЭ с полным представительством геновариантов и субтипов. Здесь, как и в других ландшафтах, доминируют западный и урало-сибирский субтипы, однако в отдельные сезоны выявляется присутствие в очагах и восточного субтипа. Обращает на себя внимание, что за период исследований ни разу не регистрировали единовременного присутствия на территории исследования всех трех субтипов, однако присутствие двух субтипов является по-видимому нормой. Состав фауны иксодид, их пространственное распределение и особенности динамики численности оказывают влияние на устойчивость и пространственную структуру очага, уровень его эпидемической активности, но, по-видимому, не влияют на уровень активности разных субтипов в очаге. В природных очагах КЭ высокогорий Алтая (безиксодовая зона) циркуляция вируса осуществляется в сообществах теплокровных позвоночных и членистоногих убежищного комплекса из числа доминирующих в сообществе видов гамазоидных клещей. Здесь отмечен высокий уровень эпизоотической активности вирусов западного и урало-сибирского субтипов, которые отмечены и в межгорных котловинах и долинах рек, в популяции иксодовых клещей. Нигде (в рамках использованных критериев результатов МГНК) не отмечали связи источника изоляции штаммов с принадлежностью вируса тому или иному субтипу.

Экспериментальные исследования, направленные на оценку изменений штаммовых характеристик, вероятно происходящих в организмах хозяев — позвоночных и членистоногих, продемонстрировали следующее. Накопление изменений в геноме ВКЭ при пассажах на теплокровных (белые мыши) происходит постепенно. При пассажах вируса через организм иксодовых клещей изменения происходят уже на первом пассаже, вероятно — по типу низкой множественности заражения. Характер регистрируемых изменений (как в организме белых мышей, так и иксодовых клещей), тем не менее, не приводит к изменению принадлежности штамма исходному субтипу (при используемых критериях результатов МГНК), что может служить признаком уровня значимости регистрируемых изменений в геноме. Подтвердить или опровергнуть данное предположение можно только путем секвенирования изучаемых фрагментов генома с последующим анализом наличия аминокислотных замен.

Результаты анализа нуклеотидных последовательностей на участках генов Е, NS1 и NS5 штаммов ВКЭ, относящихся к разным субтипам, демонстрируют выраженную неоднородность нуклеотидного состава на отдельных участках генов трех субтипов. Восточный субтип наиболее дистанцирован от западного и урало-сибирского, последний занимает некое промежуточное положение между ними. Все три субтипа ВКЭ дистанцированы от представителей комплекса ВКЭ, кроме, соответственно, вируса ОГЛ и Louping 111. Последний на участках анализируемых генов практически идентичен западному субтипу ВКЭ. По-видимому формирование урало-сибирского субтипа (исходя из наличия в их генах пространственно разделенных протяженных участков с высоким уровнем сходства нуклеотидных последовательностей с западным и восточным субтипами) можно рассматривать как результат неких рекомбинантных событий при микст-инфицировании обоими субтипами.

Оценка изменений некоторых фенотипических характеристик штаммов в экспериментах показывает отсутствие изменений (по критерию бляшечного фенотипа) при серийных пассажах на мышах, и появление изменений фенотипа на мелкобляшечный при пассаже на иксодовых клещах. Однако при последующих пассажах на клещах по-видимому происходит восстановление исходного фенотипа.

Тем не менее, отмечается наличие критериев, связанных с источником изоляции штамма, имеющих существенное эпизоотическое (вероятно — и эпидемическое) значение. Отмечается уровень крайне низкой периферической активности штаммов (ВКЭ и ОГЛ), изолированных от Hydracarinae и кровососущих комаровуровень высокой периферической активности — от убежищных членистоногих.

ОГЛ. По-прежнему остаются невыясненными пути резервации вируса ОГЛ. Наблюдения за развитием эпизоотий ОГЛ в популяциях ондатры на эндемичных территориях Западной Сибири показывает, что активизация очагов ОГЛ современного периода происходит в границах прежних очагов Курганской, Омской, Новосибирской и, вероятно, Тюменской обл.

При развитии эпизоотии в циркуляцию вируса включается достаточно широкий круг позвоночных и членистоногих, включая мышевидных млекопитающих, членистоногих убежищного комплекса, кровососущих двукрылых и водяных клещей. Значение последних двух групп, вследствие низкой периферической активности изолируемых от них штаммов, в циркуляции возбудителя неясно.

Молекулярно-генетические исследования полученных изолятов показывают, что по результатам секвенса фрагментов двух генов — структурного гена Е (кодирующего поверхностный гликопротеин) и неструктурного гена N85 (кодирующего вирусную полимеразу) — штаммы вируса ОГЛ (независимо от времени, источника и места изоляции) образуют компактную группу в составе вирусов комплекса КЭ. На достаточно протяженных участках данных генов все изоляты ОГЛ обнаруживают выраженное сходство с западным субтипов ВКЭ. Несколько дистанцированным в группе штаммов ОГЛ оказывается изолят из Курганской области (Ог-М1-Курган-1992).