Определение первичной структуры белков

Определению первичной структуры предшествует денатурация и разрыв поперечных дисульфидных связей в белке. Это достигается посредством избытка меркаптоэтанола следующим образом:

Как видно из уравнения, цистин превращается в два остатка цистеина, которые затем блокируют избытком иодуксусной кислоты, чтобы предотвратить обратное образование связей —S—S—.

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину. Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с УУ-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновос (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого /V-аминокислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток.

который становится концевым. Метод Эдмана можно автоматизировать, используя секвенатор (от англ, sequence — последовательность), с помощью которого ФТГ-производные отщепляются от полипептида и идентифицируются посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии:

Ф. Сэнгер впервые полностью расшифровал первичную структуру белкового гормона инсулина, используя метод Эдмана.

Другим высокочувствительным методом является так называемый дансильный метод, связанный с присоединением к концевой аминокислоте дансилхлорида (1-диметиламино-нафталин-5-сульфохлорида) по следующей схеме:

Первичная структура белка может быть установлена косвенно следующим образом: сначала получают соответствующую кДНК, затем идентифицируют клон, относящийся к анализируемому белку, и по чередованию в нем нуклеотидов с использованием библиотеки аминокислотных последовательностей определяют первичную структуру белка.