NO и гемоглобин

Молекула гемоглобина состоит из двух aи двух b-полипептидных цепей, каждая из которых связана с гемической группой, содержащей порфириновое кольцо и атом Fe2+, способный обратимо связывать 1 молекулу О2. Глобиновые субъединицы дезоксигемоглобина тесно удерживаются электростатическими связями в плотной Т-конформации со сравнительно низким сродством к О2. Присоединение О2 разрывает эти электростатические связи, ведя к релаксированной R-конформации, в которой остальные связывающиеся участки молекулы гемоглобина имеют сродство к О2 в 500 раз выше, чем в Т-конформации. Эти изменения ведут к кооперативности между связывающими участками так, что присоединение одной молекулы О2 с дезоксигемоглобином повышает сродство к нему остальных связывающих участков на этой же молекуле. В организме СГК в значительной степени определяет диффузию кислорода из альвеолярного воздуха в кровь, а затем на уровне капилляров в ткань. Свойство гемоглобина обратимо связывать кислород, является частным случаем общей закономерности взаимодействия протеинов с лигандами. Представляет интерес изучение взаимодействия гемоглобина с NO, так как он имеет гораздо более высокое сродство к гемической группе дезоксигемоглобина, чем О2 и CO, что позволяет предполагать его конкурирование с кислородом за соответствующие участки на молекулах частично оксигенированного гемоглобина.

Взаимодействие NO с гемоглобином в эритроцитах важно для регуляции обеих этих молекул in vivo. Существующие свойства эритроцитов не ограничивают взаимодействие гемоглобина с NO в физиологических условиях, не только не разрушая его биоактивность, но и сохраняя ее. На модели кишечника, в которой создавалась окклюзия верхней брыжеечной артерии и оценивалось образование HbFe2+NO и диэтилдиокарбаната с железом, показано, что NO, высвобождаемый из эндотелиальных клеток диффундирует, прежде всего, не в ткань, а в кровь. При внутриартериальном введении крысам динитрозильных комплексов железа в крови регистрировали сигнал ЭПР парамагнитного мононитрозильного комплекса, локализованного в основном (до 90%) в форменных элементах крови. В плазме в отличие от цельной крови NO превращается в нитрат довольно не эффективно, что указывает на активное участие форменных элементов крови в его метаболизме. Реакция NO с гемической группой гемоглобина может быть частично ограничена гидрофобным компонентом клеточной мембраны, лимитируя процесс его диффузии в эритроцит. NO переносится через клеточную мембрану посредством специального переносчика протеина AE1, или анион-обменник. Проницаемость эритроцитарной мембраны для NO сравнительно невысока, что может иметь значение для его биодоступности, реакции NO с гемоглобином. Предполагается существование цитоскелетного барьера для диффузии NO, реализуемого через особые межбелковые бреши (поры) в эритроцитарной мембране, состояние некоторых регулируемо, и соответственно изменяет вход NO. Скорость реакции гемоглобина с NO, находящегося в эритроцитах, в 800 раз меньше, нежели с эквивалентным количеством свободного гемоглобина. В тоже время показано, что клеточная мембрана эритроцитов не является существенным барьером для NO и его производных и не лимитирует его взаимодействие с гемоглобином. Мембрана эритроцитов рассматривается как некий специализированный насос для NO. Она имеет два компартмента для гемоглобина и активно регулирует транспорт NO из клетки: один находится внутри, а другой — на мембране. Регулируемый кислородом клеточный механизм сопряжения синтеза и экспорта биоактивности NO, образуемого гемоглобином, действует через мембранный механизм (комплекс АЕ1-SNO). Критическими факторами, определяющими скорость захвата NO эритроцитами, является ориентация мембранных молекул и внутриклеточное перераспределение гемоглобина.

В артериальной крови NO в реакции с оксигемоглобином образует нитрат и метгемоглобин, а в венозной — нитрозилгемоглобин (HbFe2+ NO), способный при высоких рО2 распадаться с высвобождением молекулы NO, которая окисляется в присутствии кислорода до NO3- [80]. Гемоглобин взаимодействует с NO через высокоаффинные Fe2±связывающие участки на геме, его сродство к NO в 8000 раз выше, чем к О2. HbFe2+NO имеет шестикоординатную форму гемических групп. Спектр ЭПР HbFe2+ NO в растворе является суперпозицией спектров Tи Rконформеров гемоглобина с преимущественным образованием Т-формы, которые обусловлены обратимыми переходами от сильного ® до слабого (Т) взаимодействия Fe2±гем с проксимальным гистидином. Нитрозилгемоглобин характеризуется выраженным эффектом Бора, что может иметь особенно важное значение при ацидозе. Указывается на возможность реагирования HbFe2+ NO с O2 — с образованием аддукта гема с ONOOи последующим образовании NO3-.

Существуют и другие физиологические механизмы связывания циркулирующего в крови NO. Недавно было установлен участок в глобиновой цепи гемоглобина, в котором NO связывается в форме S-нитрозотиола, а именно S-нитрозогемоглобина (SNO-Hb). Масс-спектрометрические и кристаллографические данные однозначно идентифицировали b93-цистеин как место связывания NO с гемоглобином. При очень больших концентрациях нитрозотиолов in vitro образуются и другие формы SNO — Hb, у которых нитрозилируется аминокислота цистеин в положении 12 и 104 bи a-белковых цепей, соответственно. NO, образуемый in vitro при добавлении индуцибельной изоформы NO-синтазы к эритроцитам, может превращать содержащийся в них гемоглобин в SNO-Hb. Кислородсвязывающие свойства SNO-Hb сильно зависят от pH (величина эффекта Бора для него близка к обычному гемоглобину). Протонирование соответствующих аминокислот (b146-гистидина и b93-цистеина) взаимосвязано, что может способствовать высвобождению NO. S-нитрозилирование гемоглобина облегчает отсоединение NO с гема и поступление его к гипоксическим тканям. SNO-Hb выступает в роли акцептора или донора е-, внося тем самым вклад в редокс-равновесие гема, однако значение этих функций минимально в условиях покоя.

Перенос NO от S-нитрозотиола на гемоглобин регулируется аллостерически и функционально связан с присоединением О2. По мере связывания гемоглобина с О2 в лёгких его сродство для S-нитрозотиола растёт, а при отдаче снижается, благодаря чему NO высвобождается в ткани. Существует О2-зависимое равновесие между SNO-Hb и HbFe2+NO (при отсутствии низкомолекулярных тиолов вроде цистеина, мишенью NO является гем с Fe 2+, а в его присутствии следует перенос NO-группы на цистеиновый остаток b-глобина). Положение редокс-равновесия между SNO-Hb и HbFe2+ NO связано с аллостерическим состоянием гемоглобина. После дезоксигенации большая доля SNO-HbO2 превращается в HbFe2+ NO. Дезоксигенация облегчает как реакцию транснитрозирования, в которой получаются вазорелаксирующие нитрозотиолы, так и восстановительную реакцию запасания NO, образующую нитрозилгемоглобин.

HbFe2+ NO + 4О2 SNO-Hb (О2)4 + e;

Артериовенозное распределение HbFe2+NO обратно пропорционально SNO-Hb, т. е. большие концентрации нитрозильного гемоглобина обнаруживаются в деоксигенированной крови, и наоборот. Существует цикл связывания О2 и NO в легких и их высвобождения на периферии. SH-группа S-нитрозотиола существенно защищает NO от гашения присоединением к гему. Равновесие между HbFe2+NO и SNO-Hb связано с конформацией белка: образование SNO-Hb облегчается в R-структуре, а HbFe2+NO преимущественно образуется в Т. Высвобождению NO из тиолов способствуют дезоксигенация и окисление гема (Т-структура, высокоспиновая); что согласуется с термодинамическими особенностями его связывания. Первичным аддуктом гемоглобина и NO, образуемого при дыхании NO, у нормальных индивидуумов является HbFe2+NO и в небольшом количестве SNO-Hb. SNO-Hb также находится в равновесии с низкомолекулярными нитрозотиолами. Гидроксимочевина реагирует с различными формами гемоглобина, образуя до 6% HbFe2+NO и не образовывая SNO-Hb.

Глутатион может влиять на равновесие SNO-Hb и HbFe2+ NO, что может влиять на процессы оксигенации и деоксигенации крови в капиллярах малого и большого кругов кровообращения. NO, высвобождаемый из SNO — Hb в присутствии глутатиона, не вызывает заметных сосудистых эффектов в изолированном легком в связи с быстрым окислением NO и образования метгемоглобина. Главным продуктом взаимодействия GSH с SNO-Hb in vivo, вероятно, является HbFe2+NO, за счет чего происходит модификация СГК, сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо.

SNO-Hb (О2) +GSH + e- «HbFe2+NO + GS- + О2.

Анализируя взаимодействие in vivo NO с Hb предполагается следующие соотношения между реакциями, ведущими к образованию NO-производных: метгемоглобин и NO3 + >>> HbFe2 + NO > SNO-Hb, хотя другие авторы указывают на более высокое содержание HbFe2+ NO и SNO-Hb, преобладающее над уровнем метгемоглобина. Связывание NO с оксигемоглобином является кооперативным, его окисление в метгемоглобин при физиологических условиях ограничено и преобладают реакции, ведущие к усиленному образованию HbFe2+NO. Исследование реакции с NO и гемоглобином, ведущих к образованию метгемоглобина, далеко не всегда доминируют в условиях in vivo. Взаимодействие NO с HbO2 не уничтожает его активность, а более того, обеспечивает его сохранение («гемоглобин рационально вводит новую химию, когда его насыщение кислородом высоко, лимитируя окисление NO и сохраняя его биоактивность»).