Токсико-микологический контроль качества кормов

животное корм нитритный микологический ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ЗЕРНОФУРАЖА.

5 г зернофуража после измельчения помещают, а колбу с притертой пробкой, заливают 10 ил ацетона и экстрагируют при встряхивании на шуттель-аппарате в течении 2-х часов. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр и фарфоровую чайку и выпаривают под тягой. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона, переносят в стеклянную колбу, доливая туда воду 500 мл из аквариума. В колбу помещают5Ь рыбок гуппи и наблюдают за ними в течение 24 часов, результаты через 1,2,4,8, и 24 ч. Если корм не токсичен, за одни сутки погибает не более одной рыбки (20%), очень слабо токсичен — через 12−24 часа погибает 2−3 рыбки (40−60%), токсичен — через 1−2 часа гибнет 5 рыбок (100%). Контролем служит 1% раствор ацетон, в котором рыбки должны оставаться живыми в течение 3-х суток.

Определение токсичности комбикорма путем постановки кожной пробы на кролике.

Готовят экстракт из комбикорма. В колбу берут 5О г комбикорма, добавляют спирт + эфир (1:3), бензол с таким расчетом, чтобы раствор покрывал пробу корма на 2−3 см, отстаивают 24 часа. Затем жидкость сливают.

Для опыта используют белого кролика. Выстригают персть сбоку (3×6 см²). Стеклянной палочкой втирают экстракт. Затем производят учат кожной реакции:

• — 1 степень — покраснение, шелушение, исчезающее через 1−2 дня поели нанесения экстракта;
• — 2 степень — покраснение, болезненность, желтоватые пузырьки. Корма 1−2 степени считаются слаботоксичными.
• — 3 степень — покраснение, утолщение, болезненность (корм токсичный);
• — 4 степень — покраснение, сильный отек, язвы (корм очень токсичный).

МЕТОД РАЗЛИВКИ (среда Чапека.).

10 г комбикорма помещают в колбу, куда добавляют 100 мл воды. Встряхивают 2 минуты. Готовят разведение 1:100, 1:1000, 1:10 000. Производят высев из разведения 1:10 000 на среду Чапека, разлитую в 5 чашек (на дно чашки no 1 мл в неостывшую расплавленную среду). Рост колоний учитывает через 3,5 и 9 суток после высева. Подсчитывают колонии и вычисляют по формуле:

X = 10 000 / 5.

где X — количество токсических грибов в 1 г комбикорма;

— количество, выросших колония на 5 чашках из разведения 1:10 000.

Затем берут иглой частицу колонии (гриба) на предметное стекло, добавляют 1 каплю 96° этилового спирта 1 каплю глицерина и 1 каплю воды. Покрывают предметным стеклом и при малом увеличении микроскопа определяют вид гриба, пользуясь атласом патогенных грибов. (Саркисов А. Х. Атлас патогенных грибов для сельскохозяйственных животных и птиц.-М., 1953).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВЫХ ДРОЖЖЕЙ.

Берут навеску дрожжей 100 г в колбу с 300 мл ацетона, встряхивают на шуттель-аппарате 2−3 часа, фильтруют. Добавляют 2,5 мл растительного масла и выпаривают на водяной бане до исчезновения запаха ацетона. Для опыта используют 5 белых мышей (18−20 г весом), с помощью шприца вводят 0,5 мл экстракта. Наблюдают за мышами 3 суток. В случае отсутствия надежа мышей, убивают эфиром и вскрывают. В качестве контроля 5 мышам вводят растительное масло 0,5 мл.

Учет токсичности.

Корм нетоксичен — мыши живые, при вскрытии у убитых патологоанических изменений нет.

Корм слабо токсичен — мыши живы, при вскрытии у убитых геморралисеское воспаления желудочнокишечного тракта, чаще очаговое.

Корм токсичен — гибнут все или 1 мышь, при вскрытии геморралическое воспаление желудочно-кишечного тракта, дегенерация печени, почек или кровоизлиянии в паренхиматозных органах.

ЭКСПРЕСС — МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВ.

Тест-объект.

Инфузория тетрахимена пириформис.

Приготовление углеводно-солевой дрожжевой среды.

• 1OO мл дистиллированной йоды, 1,5 г глюкозы, 0,1 г морской соли,
• 0,1 г дрожжевого экстракта. PH доводят до 7−7,6 и стерилизуют ь кипящей воде 30 минут.

Сохранение маточной культуры инфузорий.

Культуру тетрахимены пириформис поддерживают в пептонной среде: на 100 мл дистиллированной воды берут 2 г пептана, 0,5 г глюкозы, 0,1 г дрожжевого экстракта, 0,1 г морской соли. pH = 7−7,5. Среду разливают по 2 мл в пробирки с пробками и стерилизуют при 1 атм. ЗО мин. Пересев культур производят через каждые 4−5дней стерильной бактериологической петлей.

Консервация тетрахимены периформис.

Готовят 5% раствор глюкозы, затем разливают по 10−20 мл на плоскодонные колбочки (объем на 50 мл) сдоем не выше 1 см, стерилизуют при 0,5 атм.20 минут, охлаждают, вносят 0,5−1,0 мл культуры тетрахимены пириформис, выращенной на пептонной среде в течение 3 суток. Хранят колбы в затемненном месте при комнатной температуре 60 дней.

Подготовка образца к исследованию.

5 г комбикорма, зерна (измельченного), 20 мл ацетона, экстрагируют и выпаривают до полного исчезновения запаха ацетона.

Проведение исследования.

К экстракту из корма приливают 10 мл углеводно-дрожжевой среды и фильтруют. Для анализа отбирают по 3−5 мл фильтрата во флаконы из-под антибиотиков и вносят 0,1−0,2 мл 3−5 суточной культуры инфузорий и оставляют при комнатной температуре в защищенном месте от прямых лучей (солнечных).

Учет и оценка результатов.

Черев 3,10,30 минут и 1,2,3, часа учитывают эффект биопробы в капле нанесенной пипеткой на предметное стекло, под микроскопом (увеличение 7+10) путем осмотра всего объеме капля и всех ее слоев.

Наблюдения проводят не фоне контроля — среде углеводно-дрожжевая.

Сильно-токсичные корма — гибель тетрахимены пириформис в первые 5 минут (в первые секунды происходит ускорение движения с последующим замедлением, гибелью и лизисом инфузорий).

Токсичные корма — гибель инфузорий наступает черев 10−30 мин.

Слабо — токсичные корма — гибель инфузорий наступает в течение трех часов. При этом происходят изменения формы тетрахимены — вакуолизация. Движения инфузорий угасают, наступает атаксия и они лизируются.

Не токсичные корме — гибели и каких-либо морфологических изменений не возникает даже при наблюдении за ними в течение 24 часов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ КОМБИКОРМОВ (биопроба на белых мышах).

10 г комбикорм, добавляют к 30 ил ацетона и экстрагируют при встряхивании на шуттель-аппарате в течение 30 минут. Фильтруют. Экстракт выпаривают на водяной бане до объема 50 мл. На одну пробу берут 4 белых мышей массой 18−20 г. Стерильным шприцем набирают экстракт и вводят подкожно 0,2 мл. Контроль — 4 мыши и подкожно 0,2 мл стерильного растительного масла. Наблюдают за мышами 3 суток. В случае отсутствия падежа мышей убивают (усыпляют эфиром) и вскрывают внутреннюю сторону бедра конечности, а затем бедро, под кожу которого экстракт не введен. Отмечают отсутствие иди наличие воспалительного процесса, характеризующегося местным полнокровием сосудов, инфильтрацией подкожной соединительной ткани, наличие экссудата, припухлости.

Корм не токсичен — все мыши живые, на месте инъекции нет воспалительного процесса.

Коры слабо-токсичен — все мыши живы, но у 2−4 наличие воспалительных процессов на месте инъекций.

Корм токсичен — гибель хотя бы одной мыши и наличие воспалительного процесса у всех остальных мышей.

Введение

экстракта белым мышам в желудок.

Пробы исследуемого корма измельчают, заливают стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2 — 1:5 (в зависимости от вида корма). Оставляют при температуре 4−6° С на 24 часа, периодически перемешивая. После отстаивания массу отжимают, а вытяжку фильтруют через марлевый фильтр. Полученную таким образом вытяжку вводят по 0,5 мл ежедневно 3−4 мышкам в течение трех дней с помощью зонда в желудок, натощак. В качестве зонда можно использовать шприц с тупой слегка изогнутой иглой длиной 3−4 см.

Пробы на бородках кyp.

Готовят спиртово-эфирные экстракты в соотношении 1:2. Экстрагируют измельченный корм в речение 24 часов. Сливают и выпаривают до полного исчезновения запаха эфира и спирта. После этого экстракт разбавляют: к 0,5 мл экстракта добавляют 4,5 мл стерильного подсолнечного масла. Масляный экстракт вводят в одну из бородок курицы в дойн 0,1−0,2 мл. В другую бороздку вводит масло.

Ha мести введения экстракте из токсичного корма отмечают воспаление, отек, кровоизлияние или даже некроз. Толщину бородки можно замерить кутиметром. На контрольной бородке изменений нет. Через 3−4 часа не бородке развивается горячий диффузный отек. Толщина бородки постепенно увеличивается в 3−0 раз, достигая максимума через 20−24 часов. Если экстракт был резко токсичным, на месте образования отека отмечается кровоизлияние, придающее бородке сине-фиолетовый цвет. Рассасывание отека 4−8 дней.

Оценку реакции проводят по наличию изменения. Если диффузный отек бородки наступил черев 4−24 ч, толщина ее увеличилась до 8 мм и больше, в на вторые сутки в центре отеке возникло кровоизлияние с последующем развитием некроза реакция считается резко положи — тельной.

Когда же диффузный отек появляется через 24 часа, толщина бородки 5−8 мм, в кровоизлияние и некроз не развиваются — реакция положительная. В случае, если через 24 часа появляется только ограниченная припухлость бородки, а ее толщина не более 4 мм — реакция считается отрицательной.

БИОПРОБА.

Ее используют как единственный метод подтверждения диагноза, когда микологическими исследованиями установлено наличие грибов в кормах, среди которых один вид гриба токсичен, а лабораторные методы не дают положительного результата. Для установления токсичности такого корма его скармливают наряду с доброкачественным кормом двум группам Сне менее 3-х голов в группе животных). Суточную норму кормов заменяют исследуемым и скармливают его подопытным животным в течение 10 дней. При постановке биопробы группы животных содержат изолировано. Контрольной группе скармливают заведомо доброкачественный корм. Следует учитывать, что токсикоз проявляется быстрее, если пораженный корь скармливать подопытным животным на голодный желудок, т. е. после 5−6 часовой голодной диеты. Дачу воды не ограничивают.

Биопроба считается положительной, если животные, которым скармливают корм, заболевают или отказываются от него, в то время как животные контрольной группы ведут себя локально.