Спиртовое брожение. 
Обмен веществ и превращение энергии в растениях

Уже давно было известно, что преобладающею реакцией при спиртовом брожении является распадепие глюкозы на спирт и углекислоту, вследствие чего и самое брожение получило название спиртового брожения. Затем Гей-Люссак показал, что сумма веса образованного спирта и углекислоты приблизительно равна исчезнувшей глюкозе. Наиболее тщательные расследования касательно изменения жидкости при спиртовом брожении были произведены Пастером ³⁵ Он также нашел, что материалом брожения служит сахар; если в жидкости содержится не глюкоза, а тростниковый сахар, то последний сперва превращается в глюкозу по формуле СиНггОц+НгС^С^Нг^г, присоединяя к себе частицу воды, и затем уже расщепляется па несколько более простых тел. Кроме спирта и углекислоты, уже указанных предшествовавшим? исследователями, Пастеру удалось открыть в числе постоянных продуктов спиртового брожения еще глицерин и янтарпую кислоту. Так, например, из 100 частей тростникового сахара Пастер получил в одном случае 105,26 частей по весу глюкозы, которые при спиртовом брожении дали:

• 51,11 частей алкоголя
• 50,00 «углекислоты
• 3.16 «глицерииа
• 0,67 » янтарном кислоты
• (1,00 часть сахара была при этом усвоена дрожжами.) Другими словами, при спиртовом брожении тростникового сахара из 100 частей его 95 распались па спирт п углекислоту, 4 — на глицерин и янтарную кислоту и 1 часть сахара вошла в состав дрожжей.

Приведенные цифры, по свидетельству Пастера, обнаруживают, однако, колебания н известных пределах, вызванные различиями условий опыта; так, например, количество глицерина колеблется между 2 и 6%, количество янтарной кислоты — между 0,5 и 0,7%.

Пастер поясняет, между прочим, что не следует представлять себе, чтобы при спиртовом брожении указанные реакции были совершенно независимы одна от другой и распределялись по различным молекулам глюкозы. Он рассматривает спиртовое брожение за весьма сложный процесс, вызываемый клетками бродильного грибка; пзменепия, обусловливаемые этими клетками в жидкости, тесно связаны, по представлению Пастера, с жизнью грибка и с созиданием в нем сложных органических соединений, каковы, например, клетчатка, жиры и белковые тела.

Пастер нашел, кроме того, что относительные количества образованного бродильного грибка и разложенного сахара могут быть весьма различны, смотря по условиям опыта. Уже выше было указано, что ему удавалось, регулируя доступ кислорода, изменять по произволу отношение количества образованных дрожжей к разложенному сахару в пределах между V* и '/пв; в этих дробях числитель выражает вес образованных дрожжей, а знаменатель вес разложенного сахара ³⁵ На рис. 61 обстоятельно описан прибор, в котором производилось брожение в отсутствие кислорода и получалось разрастание, хотя и слабое, дрожжей, введенных в жидкость. При этом оказалось, что только очень молодые дрожжи разрастались в отсутствие кислорода, старые же производили брожение, не размножаясь.

Чтобы сделать влияние кислорода на брожение по возможности наглядным, Пастер ^{355[1][2] устроил два параллельных опыта; один из них был произведен в отсутствие кислорода в вышеописанном сосуде; другой — в колбе, сходпой, но гораздо большей; над налитой жидкостью оставался значительный объем воздуха. В оба сосуда введено было одновременно по минимальному количеству Saccharomyces pastorianus. Для брожения была взята смесь отвара дрожжей, заключавшая 5% тростникового сахара. В сосуде с воздухом брожение закончилось через 10 дней; образовавшиеся дрожжи весили после высушивания при 100° С 1,970 г; количество разложенного сахара превосходило по весу в 76 раз количество новообразованных дрожжей. Во втором сосуде при устранении кислорода брожение шло гораздо медленнее, через 19 дней после начала опыта оно еще обнаруживалось, хотя уже в слабой степени; в жидкости оказалось 1,368 г дрожжей; количество разложенного сахара равнялось}

145,4 г, т. е. превосходило вес дрожжей в 89 раз.

Наибольшую разпицу удалось Пастеру получить при посеве старых дрожжей, с одной стороны, в жидкость, лишенную кислорода, а с другой — оставляя дрожжи в присутствии кислорода в плоской чашке, в тонком слое жидкости ³⁵ При этих опытах несомненным образом выяснилась зависимость роста бродильного гриба от кислорода и возможность спиртового брожения в отсутствие кислорода. Но они не разрешили, но моему мнению, еще вопроса о влиянии кислорода на спиртовое брожение, как полагает Пастер. Он принимает, основываясь па вышеприведенных цифрах, что в присутствии воздуха (кислорода) спиртовое брожение замедляется. Шютценбергер ³⁵⁸ уже высказал, что опыты Пастера нельзя признать вполне доказательными. На результате опыта не могло не отразиться различное разрастание грибка в обоих сосудах; из введенного количества дрожжей в присутствии кислорода образовалось их гораздо больше, чем в сосуде без кислорода. Если бы, несмотря на большое число новообразованпых дрожжей, в сосуде с воздухом было разложено в определенный промежуток времени меньшее количество сахара, то вывод Пастера не подлежал бы сомнению. На самом деле, од^. на ко, произошло обратное; в первом из вышеописанных опытов Пастера в присутствии воздуха все количество сахара оказалось разложенным в первые десять дней, между тем как в сосуде, лишепном доступа кислорода, брожение продолжалось еще на 14-й день опыта. Конечно, результат этот не может опровергнуть заключения Пастера; вследствие более сильного размножения клеток бродильного грибка в присутствии воздуха могло оказаться больше разложенного сахара даже в том случае, если бы, согласно предположению Пастера, кислород замедлял спиртовое брожение. Ослабление спиртового брожения каждой отдельной клетки могло быть не только уравновешено, но и восполнено с избытком несоразмерно большим числом их, что и получилось в опыте Пастера. По справедливому замечанию Шютценберга, вывод Пастера мог бы считаться вполне доказательным в том только случае, если бы равные количества дрожжей разлагали в известный промежуток времени при устранении кислорода больше сахара, чем в его присутствии.

Опыты, удовлетворяющие этому условию, были произведены Негели и привели его к результату диаметральпо протчвуположному, который^[3][4]

он ³⁵⁹ резюмирует в следующих словах: «Не подложит сомнению, что доступ кислорода благоприятствует брожению».

Для устранения влияния размножения клеток на результат опыта Иегели помещал дрожжи в чистый сахарный раствор с целью препятствовать их размножению. Сравнительные опыты производились в двух колбах различных размеров; маленькая колба (А) емкостью в 65 см³ была доверху наполнена бродящею жидкостью; в большую колбу (В), в 1100 см*, было влито также 65 см³ той же жидкости и в каждую, колбу прибавлено по ровному количеству дрожжей. Все пять сравнительных опытов ^{360 * 362 363} дали сходный результат, несогласный с выводом Пастера: в первых двух опытах, разнящихся между собою только тем, что в первом из них, кроме сахара, введена была лимонная кислота (1 г), брожение определялось по количеству выделенной углекислоты; в трех остальных — по количеству образованного спирта.

Результаты:

Опыт Колба, А Колба В.

• 1- й 29,20 36,2 частей углекислоты на 100 частей разложенного сахара
• 2- й 37,40 49,4 «* * «» ««
• 3- й 4,65 13,8 «спирта «» «* *
• 4- й 41,30 48,8 «» «» • * «
• 5- й 3,76 15,7 «» «» * * *

Примечание. Различие в количествах разложенного спирта обусловливается тем что в опытах 3-м и 5-м прибавлено к жидкости от 2,5 до 3 г лимонной кислоты, задерживавшей брожение; в опыте 4-м дрожжи находились в чистом растворе сахара.

Несмотря на более правильную постаповку, опыты Иегели также не решают окончательно вопроса о влиянии кислорода на брожение, так как оп не доказал взвешиванием, что бродильный грибок не увеличил своей массы во время опыта: это дало повод Мейеру³⁶¹ усомниться в точности результатов Не гели.

Неблагоприятными для выводов Иегели оказались опыты Педерсена ³⁶² и Ганзена^звз. Педерсен нашел, что, пропуская ток воздуха через жидкость, заключающую бродильный грибок и способную к брожению, можно получить в 2 раза большее против обыкновенного количества бродильного грибка. Количество разложенного спирта тоже несколько возросло, но далеко не соразмерно разрастанию грибка.

Ганзен произвел целый ряд определений количества клеток бродильпого грибка посредством гематометра Гайсма и Наше. В жидкости, сквозь которую пропускалась струя воздуха, получилось в 3 раза большее количество клеток бродильного грибка, между тем как разложение^[5][6]

Pedersen. Meddelelser fra Carlsberg Labaratoriet, H. 1. p. 22 (французский текст).

спирта возросло всего в 2 раза сравнительно с сосудом, в котором жидкость оставалась спокойною. При этом причина более сильного разрастания грибка в жидкости, через которую проходил ток воздуха, остается невыясненною, если обратить внимание на другую работу Ганзена, помещенную вслед за первой. В этой второй работе Ганзен имел в виду проверить показание Горвата касательно замедления или даже совершенной приостановки развития простейших организмов под влиянием сотрясений. Одинаковые количества дрожжей были помещены в жидкость, способную к брожению, в два одинаковых сосуда; условия культуры разнились только тем, что один из сосудов стоял спокойно, между тем как в другом жидкость находилась в беспрерывном движении от погруженных в нее пластин, вращаемых часовым механизмом. Получился результат, диаметрально противуположный выводу Горвата; в сосуде с жидкостью. поддерживаемою в движении, образовалось от 2—3 раз больше бродильного грибка. Принимая во внимание благоприятное влияние перемешивания жидкости на развитие бродильного грибка, остается нерешенным, обусловливалось ли в первой работе более сильное развитие бродильного грибка в сосуде, через который проходила струя воздуха, кислородом или передвижением жидкости, вызванным струей воздуха.

На основании приведенного разбора наиболее выдающихся работ я считаю вопрос о влиянии кислорода на брожепие еще далеким от окончательного решения.

Во всех этих работах сделано одно весьма важное упущение, именно не принято вовсе во внимание влияние накопляющихся продуктов брожения па развитие грибка и на дальнейший ход брожения. Между тем влияние их не подлежит сомнению; при посредстве бродильного грибка удается получить количество спирта, не превышающее 14—15%; брожение, вначале быстрое, со временем постепенно слабеет, наконец прекращается совершенно. По опытам Бланкенгорна ³⁸‘, Saccharomyces Cerevisiae переносит только до 14—15% спирта; от прибавления спирта к жидкости брожение замедляется тем больше, чем значительнее количество спирта, прибавленного к бродящей жидкости. В полном согласии с этими результатами находятся указания Брефельда^[7][8][9], что при 12% спирта останавливается разрастание бродильного грибка, а при 14% прекращается спиртовое брожепие. Непосредственным доказательством влияния продуктов разложения сахара на ход спиртового брожения служат опыты Бусенго ^36в; ему удалось, удаляя из жидкости спирт и углекислоту по мере их образования, довести спиртовое брожение до конца в весьма короткое время. Жидкость пагревалась до 40° С и при посредстве воздушного насоса поддерживалась в кипении. Выделявшийся спирт собирался в охлажденном приемнике. Брожение, несмотря на очень значительное содержание сахара в жидкости, шло до конца с одинаковою скоростью, между тем как при обыкновенных условиях она замедляется, как мы видели, по мере накопления спирта в жидкости. Во всех опытах, имевших целью выяснить влияние кислорода на брожение жидкости, лишенной кислорода, брожение замедлялось от накопления спирта; обстоятельство это влияло, помимо воли экспериментатора, на результат опыта; если принять во внимание, кроме того, косвенное влияние различной убыли сахара, а равно и изменения в количествах дрожжей в зависимости от кислорода, то становится понятным, почему, несмотря на значительную затрату времени и труда, вопрос о влиянии кислорода па брожение остается неразрешенным.

Все вышепоименованные виды Saccharomyces оказались совершенно сходными по отношению к спиртовому брожению. Различие между ними проявилось пока лишь в том, что некоторые виды не содержат ипиертина и, обладая способностью производить спиртовое брожение глюкозы, не разлагают раствора тростникового сахара. По указанию Ганзена ^зв к последним относится Saccharomyces apiculatus; подобную же форму бродильного грибка, не образующую ипвертина, нашел Ру^[10][11][12] на поверхности кусков глюкозы. Грибок этот отличался малым размером и округлою формою клеток.

Выше уже было указано, что S. Mycoderma появляется обыкновенно па поверхности перебродивших жидкостей и вскоре затягивает ее в виде сплошной морщинистой пленки. В этом случае грибок живет как плеснь, развивается весьма быстро, поглощая громадное количество кислорода, ио не производит вовсе спиртового брожения. Если же стряхиванием и взбалтыванием погрузить пленку на дно сосуда, то при содержании сахара в жидкости обнаруживается по наблюдению Пастера^[11], спиртовое брожение, отличающееся от обыкновенного только гораздо меньшею интенсивностью.

По исследованиям Пастера, подтвержденным Фицем и Брефельдом, спиртовое брожение вызывается в сахаристых жидкостях при недостаточном доступе воздуха не только бродильными грибками, но и некоторыми из наиболее известных плесней (Mucor, Penkillium, Aspergillus). Подобно бродильным грибкам, эти плесни питаются и развиваются различно, смотря по количеству предоставленного им кислорода. В присутствии достаточного количества кислорода они очень сильно разрастаются, поглощают очень большое его количество, выделяют соответствующий объем углекислоты и не производят вовсе спиртового брожения. При недостатке же кислорода грибки эти развиваются очень слабо и, как бы взамен роста, вызывают спиртовое брожение в жидкости.

Из Mucor оказались способными производить спиртовое брожение различные виды этого рода.

Наиболее интереса представляет в этом отношепии М. racemosus, исследованный Пастером^[14] и Брефельдом^[15]. По определению Брефельда, при посредстве М. racemosus удается получить в сахаристой жидкости до 5% спирта.

Для этого удерживают его мицелий на дне сосуда, подвергая жидкость частому взбалтыванию. Погруженный в жидкость мицелий не образует спорангиев; удлиненные клетки его повторенным поперечным делением распадаются на короткие членики, которые затем вздуваются и принимают округлую форму. Они покрываются шаровидными выпуклостями и отделяют почкованием ряды шаровидных клеток. Через некоторое время мицелий Mucor принимает совершенно своеобразный вид и является построенным из клеток, сходпых по форме с бродильным грибком, от которого они, однако, легко отличаются по гораздо большему размеру. В этом измененном виде М. racemosus вызывает брожение. Если же при посредстве выделяющихся пузырьков углекислоты мицелий всплывает на поверхность жидкости, то он вновь начинает жить как нлеснь; округлые клетки его разрастаются в длинные членики, из каждого членика вырастает в воздух ножка, заканчивающаяся спорангием, возобновляется поглощение кислорода, сопровождаемое выделением углекислоты, и в это же время совершенно прекращается спиртовое брожение.

Брожение, вызываемое Mucor racemosus, оказалось, по исследованиям Фица^пг, почти тождественным с брожением, производимым S. Cerevisiae. Подобно последнему, Mucor racemosus обладает способностью изменять тростниковый сахар в превращенный; выделяемый при брожении газ оказался чистою углекислотою; спирт и углекислота образовались в таких же приблизительно отпосительпых количествах, как при брожении от бродильного грибка; между продуктами разложения Фиц нашел янтарную кислоту.

Спиртовое брожение, производимое Mucor racemosus, останавливалось, по наблюдениям Фица, когда количество образованного спирта достигало 3*Д—4%; по Брефельду^{[16][17][18][19]} — 5%. По достижении этого предельного содержания спирта клетки Mucor racemosus, прекращая брожение, тем не менее не погибали, и Брефельду удавалось сохранять их в этой жидкости живыми в продолжение шести месяцев. Кроме обыкновенных продуктов брожения, Брефелъд находил постоянно сивушноемасло и ароматическое соединение приятного запаха, напоминающее грушу.

Из других видов Mucor оказались способными производить спиртовое брожение Mucor stolonifer, М. mucedo, М. circinelloides (до 5,5% спирта), М. spinosus (до 2%); по Гейону «⁴, последние три вида не способны обращать тростниковый сахар в превращенный.

Совершенно подобную зависимость от условий культуры обнаружили, по опытам Пастера™, Penicillium glaucum и Aspergillus glaucus. Развиваясь па поверхности жидкости, они покрывались спорангиями и конидиями и вовсе не вызывали спиртового брожения, при погружении в жидкость изменяли форму клеток в округлую и разлагали сахар па спирт и углекислоту. Из минимального количества спор Penicillium Пастер³⁷⁸ получил при свободном доступе воздуха около 1 г мицелия; жидкость не заключала и следа спирта. Про культуре грибка на дне сосуда в отсутствие кислорода мицелий разросся очень мало; в жидкости же накоплялось значительное количество спирта.

Примечание. Для открытия слабого брожения и малых количеств спирта прибегают обыкновенно к следующему приему. Жидкость, в которой предполагают присутствие спирта, подвергают перегонке и собирают для исследовании первую, перешедшую в приемник порцию. В нее вливают крепкий раствор едкого кали и прибавляют затем йоду по кусочкам. При осторожном нагревании появляется характерный запах йодоформа; при этом по охлаждении жидкости оседает на дне трубочки йодоформ в виде желтого осадка, составленного из правильных шестигранных табличек.

Эту реакцию удалось Мюнцу^[20][21] сделать до такой степени чувствительной, что он был в состоянии открывать спирт при содержание 1 части спирта в 1000 000 частях воды.

Примечание 2. По опытам Брефелъда (Landw. Jahrb. 5, 308 [1876]), Oidium lactis тоже производит спиртовое брожение в отсутствие кислорода.

• [1] Pasteur. Eludes s. 1. biere, 1876.
• [2] Pasteur. Etudes s. 1. biere, p. 236.
• [3] *" 1Ь., р. 244.
• [4] Schiilzenberger. S. 1. fermentations.
• [5] зь9 Nageli. Theorie d. Gahrung, p. 25 (1879). 3eo Nageli. L. c., p. 23. 3e‘ Mayer. Land. Vers. 25, 301 (1880).
• [6] Hansen. Compt. rend. d. travaux du laboratorie de Carlsberg, p. 88.
• [7] Blankenhorn. Ann. d. Oneol. 4, 168. (Just. Jahresb. 1874, p. 351).
• [8] Brejeld. Landw. Jahrb. Jahrg. 5, p. 306 (1876).
• [9] Boussingaull. C. R. 91, 373 (1880).
• [10] 387 Hansen. Zeitschr. f. d. g. Brauwcsen 4, 449. Jahresb. Agric. Chem. 1881, p. 501.
• [11] Roux. Bull. soc. chim. 35, 371. (Jahresb. Agric. Chem. 1881, p. 581).
• [12] 389 Pasteur. Etudes s. 1. biere, p. 110.
• [13] Roux. Bull. soc. chim. 35, 371. (Jahresb. Agric. Chem. 1881, p. 581).
• [14] Pasteur. Etudes s. 1. biere, p. 126.
• [15] Brefetd. Flora, 1873, p. 385.
• [16] Fitz. Вег. d. d. chem. Ges. 6, 48 (1873).
• [17] 3,3 Brefeld. Unters. iib. Gahrung. II, p. 111.
• [18] Cayon. C. R. 86, 52 (1878).
• [19] Pasteur. Etudes s. 1. biere, p. 86.
• [20] 374 Pasteur. Ib., р. 99 и 100.
• [21] Muntz. С. R. 92, 499 (1881). 373 Van Thiegem. Ann. des Nat. S. 5, t 8, 210 (1867).