Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов ?-капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований

Капролактам является сырьем для получения полимерных материалов (капрон, найлон-6), применяемых в различных областях промышленности, сельского хозяйства, медицины, быта. Обратимость процесса получения поликапроамида приводит к тому, что продукты полимеризации всегда содержат определённое количество низкомолекулярных фракций олигомеров, как линейных, так и циклических. Отходы производств капролактама и полимерных материалов в настоящее время сбрасываются в водоемы, подвергаются захоронению или сжигаются, что нецелесообразно с экономической и экологической точек зрения. Кроме того, широкое применение поликапроамида вместе с его низкой биодоступностью создаёт проблему утилизации капроновых изделий, пришедших в негодность. В связи с этим необходимо уделять внимание разработке экспресс-метода контроля, ориентированного на детекцию опасного уровня загрязнения и разрабатывать методы утилизации капролактама и его полимеров и олигомеров.

В настоящее время перспективными считаются методы биохимической диагностики загрязнения, в частности применение биосенсорных методов, сочетающих чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров. Первый подход к созданию биосенсора для детекции капролактама в водных средах представлен в работе Риделя (Riedel), где показана принципиальная возможность получения аналитических сигналов сенсора, основанного на иммобилизованных клетках штамма — деструктора Pseudomonas putida К14 и кислородном электроде, при добавлении капролактама в измерительную ячейку [1]. Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода Pseudomonas контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама — САР-плазмидами. К настоящему времени описан ряд САР-плазмид, которые отличаются по характеру детерминируемой ими способности к утилизации капролактама и его интермедиатов. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика. Гетерогенность плазмид с точки зрения их функциональной экспрессии дает возможность конструирования практически полезных штаммов с повышенной способностью к разложению ксенобиотика;

Использование микроорганизмов в биосенсорных системах предполагает предварительный отборнаиболее активных в отношении исследуемых субстратовштаммов. Ранее: немецкими исследователями была показана возможность проведения скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков при помощи биосенсорных технологий (на основании оценки, их дыхательной активности в присутствии потенциальных субстратов)'[2]- Биосенсорный' подход для экспресс-оценкиокислительной активности штаммов микроорганизмов, в том числе с разным сочетанием" — «бактериальный хозяин — плазмида», является перспективнымдля исследований в области биотехнологии защиты окружающей среды.

Вопрос о биотрансформации олигомеровкапролактама изучен в меньшей степени. Описан1 ряд бактерий^ утилизирующих линейные и циклические олигомеры капролактама, показана принципиальная возможность деградации найлона-6,6 лигнинразрушающими грибами. Однако возможности применения микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и отходов производств, содержащих олигомеры капролактама, а также для создания биосенсорных систем, в настоящее, время только исследуется.

выводы.

1. Разработана лабораторная модель биосенсора кюветного типа, которая позволяет проводить сравнительную оценку окислительной активности штаммов — деструкторов капролактама. Рабочие параметры биосенсорной модели на основе штамма Pseudomonas putida BS394(pBS268) составили: pH среды 7,6- концентрация солей буферного раствора 33 мМсодержание клеток в рецепторном элементе 25 мг (по сырому весу)/мл агарового геля.

2. Впервые показана возможность, применения биосенсорного подхода для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин — САР-плазмида». Выявлено, что на процесс утилизации капролактама большее влияние оказывает выбор бактериального хозяина. ,.

3. Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама in vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама. Наиболее высокую удельную активность наблюдали для штаммов P. putida BS394(pBS268) и P. putida BS394(pBS265): 0,17±0,02 и 0,16±0,02 мкМ/(мг-мин) соответственно.

4. Разработан и опробован на образцах производственных отходов макет биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма P. putida BS394(pBS268) для анализа капролактама в водных средах. Основные характеристики биосенсорной системы: длительность единичного измерения 10 миннижний предел обнаружения 0,005 мМоперационная стабильность 5,3%- долговременная стабильность 10 суток.

5. Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров капролактама под действием бактериальных клеток, содержащих плазмиду биодеградации капролактама: окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Показана принципиальная возможность создания биосенсора для детекции линейных олигомеров в водных средах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

По 'результатам литературного анализа можно заключить, что нерешенными к настоящему времени, однако имеющими важное значение для разработки экспресс-методов контроля степени очистки и методов биологической очистки отходов производств капролактама и полимерных материалов на его основе, являются следующие вопросы:

— выявление влияния видовых и штаммовых различий бактерий и комбинаторики «плазмида-бактериальный хозяин» на деградативную активность штаммов-деструкторов капролактамапоиск метода, позволяющего проводить быстрый скриннинг наиболее активных деструкторов капролактамаисследование фундаментальных закономерностей процессов биодеградации олигомеров капролактама как антропогенных поллютантов окружающей среды, в том числе механизмов приобретения микроорганизмами способности к деградации олигомеров капролактама, генетического контроля и путей деградации олигомеров бактериями различных родов;

— разработка способов оценки эффективности биотрансформации олигомеров капролактама, содержащихся в значительных количествах в промышленных отходах производств полимерных материалов.

Биосенсорные системы вследствие их экспрессности, возможности работы on-line, умеренной стоимости являются хорошей альтернативой существующим методам анализа водных сред. Количество различных типов биосенсоров как сочетаний какой-либо специфической биологической системы и определенного вида преобразователя практически неограниченно.

Биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов (микробные сенсоры) широко используют для экологического мониторинга объектов окружающей среды [73]. Кроме того, такие биосенсоры могут быть использованы не только для аналитических целей, но и для изучения влияния различных факторов на бактериальную клетку in vivo. Благодаря возможности применения «мягких» методов иммобилизации обеспечивается минимальное повреждение клеток микроорганизмов, что дает возможность достоверной оценки прямого воздействия внешних факторов на живые клетки [16].

Выбор бактериальных штаммов-деструкторов капролактама в качестве объекта исследования продиктован актуальностью разработки методов анализа и биологической очистки сточных вод, содержащих данный ксенобиотик. Капролактам — один из наиболее востребованных на мировом рынке и широко используемых химических продуктов, суммарные годовые мощности по его производству в СНГ в 2005 г. составили 446 тыс. тонн. Так, на территории Тульский области расположен один из пяти основных производителей капролактама в СНГ — ОАО «Щекиноазот» (мощность — 50 тыс. тонн капролактама в год).

Целью данной диссертационной работы являлось выявление закономерностей аэробной деградации капролактама и его олигомеров бактериальными штаммами с помощью биосенсорного подхода и разработка макета биосенсора для определения капролактама в водных средах.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

Ьоздать лабораторную модель биосенсорной установки, позволяющую проводить количественную оценку окислительной активности различных бактериальных штаммов — деструкторов капролактамапровести сравнительное изучение окислительной активности бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин — САР-плазмида» с использованием биосенсорной установки;

— выявить корреляцию между параметрами градуир’овочных графиков, полученных с помощью биосенсоров на основе штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин — САР-плазмида», и удельными активностями ферментных систем in vivo этих бактериальных штаммовпредложить подход для экспресс-оценки окислительной активности микроорганизмов;

— на основе наиболее активного штамма — деструктора капролактама разработать макет микробного сенсора (биосенсора проточно-инжекционного типа) для детекции капролактама в водных средах, определить его аналитические и метрологические характеристики;

— применить разработанный макет биосенсорной установки для экспресс-оценки содержания капролактама в процессе его биологической утилизации в модельных системах и реальных образцах технологических вод и отходов производств;

— показать возможность применения биосенсорного подхода в сочетании с другими физико-химическими методами для изучения процессов микробиологической трансформации олигомеров.

В результате анализа литературных данных по микробной деградации капролактама и его производных в работе в качестве бактерий-деструкторов были выбраны представители рода Pseudomonas, для которых хорошо изучены генетический контроль и ферменты деградации данных ксенобиотиков.

В диссертационной работе, выполненной на базе Тульского государственного университета, бактерии-деструкторы капролактама рода Pseudomonas были использованы как основа лабораторной модели биосенсора, с помощью которого изучали физиолого-биохимические основы и генетический контроль процессов деградации капролактама и его олигомеров, проводили разработку макета биосенсора проточно-инжекционного типа для детекции капролактама (рис. 1.16).

Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов капролактама разработка лабораторной модели биосенсора кюветного типа I выбор рабочих параметров биосенсора для детекции капрйлактама и выявление наиболее ативного штамма-деструктора изучение регуляция деградации капролактама бактериями с различным сочетанием «бактериальный хозяиин-С АР-плазм ида» исследование процесса трансформации олигомеров капролактама с помощью биосенсорного подхода разработка макета биосенсора проточио-нижекционного тина для определения содержания капролактама в водных средах оценка влияния САР-плазмиды и бактериального хозяина на регуляцию процесса утилизации капролактама выявление пути трансформации олигомеров бактриальными клетками.

•о определение содержания капролактама в реальных объектах определение удельных активностей ферментных систем деградации квпррлякмфи?' установление продуктов биотрансформацииолигомеров с помощью масс-. с№КЩ>ометр ии .

Рис. 1.16 Схема проводимых исследований На первом этапе проводили разработку лабораторной модели микробного сенсора кюветного типа, позволяющую проводить сравнительную оценку окислительной активности штаммов — деструкторов капролактама, В качестве основы рецепторных элементов биосенсоров использовали пять бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин — С АР-плазм ида». Были получены параметры градуировочных зависимостей биосенсоров на основе исследуемых штаммов (эффективная константа Михаэлиса, коэффициент чувствительности, предел обнаружения, линейный диапазон), которые использовали далее для сравнительной характеристики бактериальных штаммов.

Для пяти исследуемых штаммов по скорости утилизации капролактама определили удельную активность ферментных систем деградации капролактама ш vivo, что позволило выявить наиболее активный штамм-деструктор капролактама. Далее провели сравнительную оценку активностей ферментных систем и параметров градуировочных зависимостей биосенсоров. Было показано, что с помощью микробного биосенсора можно проводить экспресс-оценку активности ферментной системы, отвечающей за деградацию капролактама.

Для • биосенсора на основе бактериального штамма, показавшего на предыдущем этапе исследования наибольшую эффективность деструкции капролактама, определили рабочие параметры биосенсорной модели, такие как рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, содержание клеток в рецепторном элементе. Кроме того, были исследованы операционная и долговременная стабильность и селективность микробного биосенсора юоветного типа. Полученные данные послужили основой для разработки макета биосенсора проточно-инжекционного типа, который применили для анализа промышленных образцов технологических и сточных вод производств, содержащих капролактам.

На завершающем этапе изучали способность исследуемых бактерий к трансформации олигомеров капролактама — веществ, содержащихся в значительных количествах в отходах производств полимерных материалов на основе капролактама (на территории Тульской области — предприятие по производству полимерных волокон «Химволокно», г. Щекиномощность 17,8 тыс. тонн полиамида-6 в год). Оценили возможность создания биосенсора для детекции олигомеров в водных средах. С целью выявления пути трансформации линейных олигомеров провели инкубацию линейных олигомеров с исследуемыми бактериальными клетками с последующей идентификацией продуктов трансформации методом масс-спектрометрии.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Биосенсорные измерения.

Для определения концентрации органических соединений применяли микробные сенсоры на основе кислородного электрода, в основе работы которых лежит регистрация изменения дыхательной активности бактериальных клеток, иммобилизованных на поверхности электрода, в присутствии субстратов. Ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямопропорционален концентрации кислорода в приэлектродном пространстве. При добавлении субстрата (например, капролактама) в измерительную кювету происходит его окисление, вследствие чего снижается концентрация Ог. При биосенсорных исследованиях регистрацию сигнала сенсора проводят, как правило, по максимальной скорости изменения силы тока и/или по величине амплитуды изменения силы тока. При этом для построения графических зависимостей используют систему координат «ответ сенсора — концентрация субстрата».

В исследованиях применяли два режима измерений: кюветный и проточно-инжекционный. Типичные отклики сенсоров (графическое отображение изменений силы тока) приведены на рис. 3.4 и 3.19. При юоветном режиме измеряемым параметром (ответом сенсора) являлась максимальная скорость изменения силы тока (нА/с), при проточно-инжекционном — амплитуда изменения силы тока (нА). I.

2.1.1 Формирование рецепторного элемента.

Клетки бактерий осаждали центрифугированием (8000 об/мин, центрифуга «MiniSpin» (Eppendorf, Германия), 10 мин), отмывали 33 мМ фосфатным буфером рН=7,6 (соли Na2HP04 и КН2РО4, Диа-М, Россия), сырую массу клеток разбавляли в 5 раз (по массе) буферным раствором, полученную суспензию смешивали в соотношении 1:7 с 2% агаровым гелем (агар-агар бактериологический, Диа-М, Россия), охлажденным до 50 °C. Полученную смесь выдерживали при температуре 20−24 °С в течение часа до полного застывания геля и отделяли фрагмент толщиной 1 мм и диаметром 5 мм. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода (ЗАО «Кронас», Москва) и фиксировали с помощью капроновой сетки. Содержание клеток в агаровом геле составляло 25 мг сырого веса клеток/мл, что соответствует 9×10 КОЕ/мл.

2.1.2 Кюветный способ регистрации сигнала В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат 1РС2000 (ЗАО «Кронас», Москва): рабочий потенциал -700 мВобъем кюветы 4 мл. Используемый буферный раствор — фосфатный, рН=7,6, концентрация солей 33 мМперемешивание магнитной мешалкой 200 об/минввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (20−200 мкл, 200−1000 мкл) («ЛЕНПИПЕТ», Россия).

2.1.3 Проточно-инжекционный способ регистрации сигнала Клеточное дыхание регистрировали с помощью проточно-инжекционного анализатора растворённого кислорода «БиоланЮЮ», используя кислородный электрод Кларка (ЗАО «Кронас», Москва), на I поверхности которого располагали рецепторный элемент. Рабочий потенциал -700 мВскорость протока 0,6 мл/минобъём пробы 50 мклобщее время анализа 300 секунд- 100 секунд — предпромывка системы- 100 секундконечная промывка системы. Для работы использовали фосфатный буферный раствор рН=7,6, концентрация солей 33 мМ.

Обработка результатов проводилась с помощью встроенной программы «Вю1ап1010».

2.2 Калибровка биосенсора При определении содержания капролактама в модельных растворах и образцах промышленных отходов биосенсорным методом в качестве референтных использовали методы тонкослойной хроматографии и фотометрии.

2.2.1 Тонкослойная хроматография Измерение концентрации капролактама проводили согласно [20]. 100 мкл анализируемой пробы разбавляли до 10 мл, подкисляли добавлением 100 мкл ледяной уксусной кислоты и экстрагировали хлороформом (х.ч.) дважды по 5 мл в течение 2 мин. Хлороформенный экстракт упаривали до5 объема 1 мл. Аликвотную часть 50 мкл наносили на пластинку силуфол с помощью хроматографического шприца. Пластинку помещали в хроматографическую камеру с подвижным растворителем (хлороформ — уксусная кислота 40:1). После окончания операции хроматографированияпластинку извлекали из камеры, высушивали до удаления паров растворителя и проявляли спиртовым раствором нингидрина.* Затем пластинку экспонировали при 130 °C в течение 301 мин. Количественное определение осуществляли по площади пятна по предварительно построенному калибровочному графику.

2.2.2 Фотометрический метод Содержание капролактама проводили фотометрическим методом с гидроксиламином согласно [72]. Отбирали 50 мл анализируемой сточной воды, переносили в колбу вместимостью 100 мл и нейтрализовали 0−1 н раствором кислоты, или щелочи. Добавляли 20 мл 3 М раствора гидрохлорида гидроксиламина, 5 мл 1 н раствора гидроксида натрия, присоединяли к колбе обратный холодильник и кипятили 30 мин. После охлаждения к раствору добавляли^, 5 мл 2 н раствора соляной-кислоты, 15 мл 10% раствора хлорида железа (III) и доводили объем до 100 мл. Через 10 мин измеряли оптическую плотность при А,=500 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см. Количественное определение осуществляли по предварительно построенному калибровочному графику.

2.3 Определение удельной активности ферментной системы деградации капролактама.

Удельные активности ферментных систем бактерий-деструкторов определяли по убыли концентрации капролактама при инкубации с бактериальнымиклетками. Для этого в реакционный сосуд помещали суспензию клеток (концентрация клеток 190 мг сырого веса/мл, что соответствует 2×109 КОЕ/мл) в буферном растворе (33 мМ фосфатный буфер, рН=7,6), затем добавляли е-капролактам до конечной концентрации 2,5 мМ.

Общий объеме реакционной смеси' 1 мл. Измерения проводили при 20 °C и постоянном перемешивании. На начальной стадии1 и через, 60 минут с ¦ момента добавления отбирали 300 мкл раствора, центрифугировали 5 мин, 12 000 об/мин. В'- супернатанте определяли: концентрацию капролактама методом тонкослойной! хроматографии- [20] и биосенсорным методом. За удельную активность ферментной системы in vivo принимали изменение концентрации, субстрата за единицу времени (мин), отнесенную к сырой" массе клеток (мг).

2:4 Практическое применение биосенсорных систем 2.4.1 Определение концентрации капролактама в образцах промышленных отходов В работе использовали образцы двух типов — технологические воды цеха' предприятия по-, производству капролактама, полученные на. предприятии, «Щекиноазот», г. Щёкино (образец № 1), и капролактам-олигомерный концентрат (КОК) предприятия-но производству полимерных, волокощ предприятие «Химволокно», г. Щекино (образец № 2). Концентрацию7 капролактамав, образцах определяли с помощью биосенсора на основе P. putida BS394(pBS268), фотометрическимметодоми методом тонкослойной хроматографии.

2.4.2. Оценка степени биодеградации капролактама в образцах промышленных отходов Для определения степени биодеградации капролактама образцыразбавляли фосфатнымбуфером так, чтобы концентрация содержащегося в них. капролактама' составляла 2 мМКлетки штамма-деструктора P. putida BS394(pBS268) добавляли в количестве 2,3×109 КОЕ/мл. Смесь, инкубировали при 24 °C в течение 6 ч, после чего отбирали" пробы, клетки? удаляли центрифугированием, в супернатанте определялисодержание капролактама биосенсорным методом.

2.5 Определение пути биотрансформации олигомеров.

2.5.1 Оценка способности бактериальных клеток к росту на олигомерах Культивирование бактерий P. putida BS394(pBS268) проводили на жидкой минеральной среде Эванса (Е) с добавлением олигомеров капролактама в качестве единственных источников углерода и энергии. Линейные олигомеры добавляли в количестве 0,05−0,1%. Среду стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 1 атмосфере. Необходимый для роста ауксотрофных штаммов цистеин добавляли в концентрации 50 мкг/мл. Культивирование культуры осуществляли на орбитальном шейкере-инкубаторе BIOSAN ES-20/60 (Латвия) при 28 °C и скорости вращения 180 об/мин.

2.5.2 Инкубация бактерий-деструкторов капролактама в присутствии олигомеров.

Изучение процесса трансформации олигомеров бактериальным штаммом P. putida BS394(pBS268) проводили в условиях длительной инкубации бактериальных клеток в присутствии субстрата (табл.2.1). Клетки штамма-деструктора капролактама P. putida BS394(pBS268) добавляли в фосфатный буферный раствор, содержащий 2 мМ линейного олигомера, в количестве 2,3×109 КОЕ/мл. Смесь инкубировали при 24 °C в течение 24−48 ч при постоянном перемешивании.