Особенности формирования банка вегетативных и генеративных диаспор орхидных для длительного хранения

Коллекция тропических и субтропических орхидных (Orchidaceae Juss.) Фондовой оранжереи ГБС РАН, на сегодняшний день, насчитывает 1120 видов, подвидов и форм из 222 родов, а также более 300 сортов и является самой представительной коллекцией орхидных в России (Демидов, Коломейцева, 2007).

В оранжерейных условиях имеется ряд трудностей, связанных с получением полноценных семян. Прежде всего, это ограниченное число образцов из разных популяций, представленных в коллекциях, а также нестабильность цветения. Как правило, семена орхидных получают с помощью искусственного опыления. Успешное перекрестное опыление предполагает наличие в коллекции генетически различных образцов и детальное изучение особенностей репродуктивной биологии (Буюн, 2009).

Успешность прорастания семян орхидных в асимбиотических условиях зависит, прежде всего, от степени развитости зародыша (или зародышей), наличия биологического и экологического покоя и др. Немаловажное значение имеет и строение семенной кожуры, ее плотность и скульптурность, наличие в ее клеточных стенках дубильных или иных веществ, ингибирующих прорастание (van Waes, Debergh, 1986; Коломейцева, 2005). Для снятия физиологического механизма торможения прорастания широко применяют методы предпосевной обработки семян (удаление ингибиторов путем длительного вымачивания зрелых семян), оптимизации питательных сред и условий содержания сеянцев, однако наиболее эффективен посев незрелых семян в асимбиотической культуре по методике «green pod culture» (Tsuchiya, 1954; Sauleda, 1976). Культивирование незрелых семян позволяет не только повысить их всхожесть, но и существенно сократить срок созревания (Withner, 1955; Arditti et al, 1982; Rasmussen, 1995).

Немногочисленные исследования по криоконсервации семян представителей семейства орхидных свидетельствуют о том, что, благодаря особенностям структуры, семена этих растений являются идеальным объектом для криосохранения, поскольку не требуют криопротекторов и сложных методов защиты от повреждающего действия сверхнизких температур (Pritchard, 1984; Никишина и др., 2001, 2003).

Альтернативой длительному хранению вегетативных и генеративных диаспор орхидных в жидком азоте является создание банка протокормов в культуре in vitro, что особенно актуально в целях сохранения сортового разнообразия коллекций и массового (промышленного) размножения (Черевченко и др., 2009).

Актуальность настоящих исследований обусловлена и тем, что все представители семейства орхидных включены в списки редких и исчезающих видов растений, в частности, в Международную Красную книгу и Приложения I и II к Конвенции о международной торговле видами дикой флоры и фауны, находящимися под угрозой исчезновения (IUCN, 1994, 2001; CITES, 1995, 1997, 2001).

Цель исследования: Выявление специфики развития генеративных структур редких видов орхидных и оптимизация способов длительного хранения их семян и протокормов.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности цветения и искусственного опыления орхидных в оранжерейной культуре;

2. Выявить механизмы автоопыления;

3. Оптимизировать генеративное размножение редких видов орхидных;

4. Оценить жизнеспособность и изучить морфологические особенности семян;

5. Вывить экологическую дифференциацию семян видов из родов Paphiopedilum Pfitz. и Dendrobium Sw.;

6. Разработать методы длительного хранения протокормов in vitro.

7. Оценить возможность использования зрелых семян для криосохранения орхидей.

Научная новизна исследований:

Впервые изучены особенности искусственного опыления и выявлено многообразие по степени перекрестноопыляемости у орхидных в оранжерейной культуре. Изучены механизмы автоопыления и выявлены различия их проявления у разных образцов одного вида. Выявлены особенности и динамика развития семян в плодах 4 редких видов орхидных. Впервые проведено сравнительно-морфологическое изучение семян 95 видов и внесены уточнения в разработанную R. Dressler (1993) классификацию типов семян орхидных. Выявлена корреляция между морфометрическими показателями семян и принадлежностью видов к разным экологическим группам. Впервые установлены сроки созревания плодов 95 видов орхидных в оранжерейных условиях. Получены данные о высокой криоустойчивости семян 5 видов орхидей при прямом погружении в жидкий азот и показаны различия в методах оценки жизнеспособности криосохраненных семян. Практическая значимость работы:

1. Криобанк семян орхидных пополнен 85 видамиразработаны паспорта семян, хранящихся в жидком азоте;

2. Создан банк протокормов in vitro, включающий 38 видов;

3. Установлены оптимальные схемы скрещивания 120 видов тропических и субтропических орхидных;

4. Определены наиболее ранние оптимальные сроки посева незрелых семян.

4 редких видов;

5. Произведен посев семян 95 видов орхидей на питательные среды в культуре in vitro;

6. Разработана безгормональная питательная среда, ингибирующая прорастание и органогенез протокормов орхидных в целях их длительного хранения.

Полученные данные могут быть полезны для уточнения спорных вопросов систематики и филогении, в селекционной практике, а также при дальнейшей работе по созданию банка семян и протокормов орхидных.

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены на студенческой конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2005 г), 10-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2006 г), VIII Международной конференции «Охрана и культивирование орхидей» (Тверь, 2007 г), XVI Международной научной конференции «Роль ботанических садов в изучении онтогенеза интродуцированных растений» (Харьков, 2008 г), II Всероссийской научно-практической конференции «Биология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2008 г), 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2008 г), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2009 г), международной научно-практической конференции «Сохранение биоразнообразия тропических и субтропических растений» (Киев, 2009 г), VIIv международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т. И. Серебряковых (Москва, 2009 г), ученых советах ГБС РАН.

Научные публикации по теме диссертации. По материалам исследований опубликовано 15 научных работ (10 статей, 5 тезисов докладов), в которых отражено основное содержание диссертационной работы. Одна статья опубликована в рецензируемом научном журнале.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 360 страницах печатного текста, состоит из введения, литературного обзора, 6 глав, заключения, выводов, библиографического списка (369 наименований, в том числе 272 на иностранных языках), приложения. Диссертация иллюстрирована 87 рисунками, включая фотографии, и содержит 25 таблиц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

При интродукции в условия защищенного грунта полный цикл онтогенеза проходят не все тропические растения. Одними из них являются представители семейства орхидных, связанные с окружающей средой сложными биотическими взаимоотношениями.

В ходе проведенных исследований выявлено, что наиболее эффективным способом опыления тропических и субтропических орхидей является перекрестное опыление (68,6%), для осуществления которого необходимо наличие в коллекции нескольких генетически различных образцов растений одного вида, интродуцированных из разных естественных популяций. Степень и проявление реакции самонесовместимости видоспецифичны: отсутсвие самонесовместимости обнаружено у видов из подсемейств Cypripedioideae и Orchidoideae, тогда как в подсемействе Epidendroideae выявлены три группы по степени проявления этой реакции: 1) отсутсвие самонесовместимости {Sobralia, Flickingeria, Cattleya, Epidendrum, большинства видов из трибы Vandeae, Cymbidium, Lemboglossum, Osmoglossum, виды из подтрибы Zygopetalinae, Peristeria, Stanhopea) — 2) наличие строгой самонесовместимости (большинство видов Coelogyne, Bulbophyllum, Brassia, Rodriguezia, виды из подтрибы Maxillariinae), при этом эффективность перекрестного опыления составила от 32 до 100%. 3) частичная самонесовместимость {Dendrobium (14 видов из 27 проявляли строгую самонесовместимость, у остальных видов ЭИО колебалась от 33 до 100%), Encyclia, Oncidium, Miltonia).

В Фондовой оранжерее ГБС РАН часть видов тропических и субтропических орхидей регулярно образует плоды и жизнеспособные семена посредством автоопыления. На примере шести экспериментальных видов показано, что механизм автоопыления сложен и включает в себя несколько процессов, из которых наиболее распространенными являются избыточная секреция рыльца и отсутствие или растворение ростеллума. Автоопыляемые виды самостоятельно проходят большой жизненный цикл онтогенеза в оранжерейных условиях, и их семена способны успешно прорастать, вступая в симбиоз с оранжерейными грибами.

Несмотря на то, что только небольшой процент семян тропических орхидей содержат ингибиторы прорастания, а их семена на искусственных агаризованных средах прорастают сравнительно легко, мы рекомендуем оптимизировать генеративное размножение редких видов путем посева незрелых семян, поскольку длительное вынашивание плодов ослабляет растения.

Выявлено, что особенности развития семян в плодах четырех редких видов орхидей {Paphiopedilum appletonianum, P. haynaldianum, Dendrobium cruentum и D. crumenatum) во многом сходны. Клетки семенной кожуры в процессе развития отмирали и накапливали ингибиторы прорастания, зародыш увеличивался в размерах вплоть до окончания срока созревания плода. При этом всхожесть семян по мере их созревания уменьшалась и имела минимальное значение у наземных видов рода Paphiopedilum (2−5%), тогда как у эпифитных видов рода Dendrobium к моменту полного созревания плода она составила 65−75%. Наиболее ранние оптимальные сроки посева незрелых семян в асимбиотической культуре in vitro соответствуют 3 мес. после опыления у Dendrobium cruentum, 2 мес. после опыления у D. crumenatum, 5−6 мес. после опыления у Paphiopedilum appletonianum и 3,5 мес. после опыления у Р. haynaldianum, что составило 50−70% от полного срока созревания их плодов.

Срок созревания плодов экспериментальных видов варьировал в широких пределах: от 1 мес. (Stenorrhynchus speciosum) до 29,5 мес. (Coelogyne trinervis)., В зависимости от срока их созревания выделяли 5 групп: от 1 до 3 мес. (9 видов), от 3,5 до 6 мес. (24 вида), от 6,5 до 9 мес. (37 видов), от 9,5 до 12 мес. (15 видов) и более 12 мес. (10 видов), что составило 9%, 25%, 39%, 16% и 11% от общего числа видов соответственно. При этом некоторое число видов орхидных в оранжерейных условиях образовывали плоды, содержащие нежизнеспособные семена (без зародыша) или плоды, не содержащие семян.

Сравнительно-морфологический анализ полученных семян орхидей показал, что они относятся к 11 типам и 1 подтипу, в соответствии с К. Вгеэзкг (1993): тип Оооёуега (1 вид) — тип Ышоёогиш (22 вида) — тип Ер1ёепёгиш (5 видов) — тип Р1еигоШаШ8 (1 вид) — тип БепёгоЬшш (32 вида) — тип Еи1орЫа (1 вид) — тип В1ейа (1 вид) — тип СутЫсНит (4 вида) — тип МахШапа (9 видов) — тип МахШапа, подтип СЬопёгогЬупсЬа (2 вида) — тип 81апЬореа (1 вид) — тип Уапёа (14 видов). Два вида (МШота эреМаМШ и ОпЫсИит ongipes) отнесены к переходному типу Уапс1а-МахШапа.

При сравнительно-морфологическом изучении семян, относящихся к типам 1лтос1огит, Оооёуега, Еи1орЫа, В1ейа, СутЫсИит и МахШапа выявлена корреляция между морфометрией семян и их экологической и систематической принадлежностью, при этом наиболее значимым признаком, на наш взгляд, является внутренний объем воздушного пространства. Для наземных видов характерно наличие крупных веретеновидных семян с большим объемом воздушного пространства внутри семени, что играет важную роль при анемохории, тогда как для эпифитов и литофитов отмечены более короткие эллипсовидные семена с минимальным объемом внутреннего воздушного пространства.

Для большинства изученных типов семян не выявлено корреляции между способом опыления и процентом неполноценных семян: высокий процент семян, не имеющих зародыша, отмечен в плодах, полученных как в результате перекрестного опыления, так и в результате различных способов самоопыления. Доля беззародышевых семян в плодах автоопыляемых видов колебалась от 0,1 до 35%. <

В ходе проведенного анализа были внесены уточнения и дополнения в разработанную классификацию семян орхидных: уточнены размеры семян в типах вооёуега, Ытоёогит, ОепёгоЫит и МахШапа, а также выделены две основные формы у семян, принадлежащих к последним трем типамэллипсовидная и веретеновидная.

Микосимбиотрофизм орхидных предопределил развитие в их плодах большого количества семян микроскопического размера, в связи с этим, технология их проращивания имеет специфические особенности. Максимальная скорость прорастания характерна для семян, относящихся к типам Dendrobium, Cymbidium, Epidendrum, Bletia и Stanhopea, а наиболее длительным периодом прорастания характеризовались виды, семена которых относятся к типам Vanda, Eulophia, Maxillaria (Chondrorhyncha var.), Pleurothallis, Limodorum и Goodyera. Медленно прорастающие семена имели плотную, как правило, окрашенную семенную кожуру, в клеточных стенках которой содержались ингибиторы прорастание.

С целью замедления прорастания семян и приостановки органогенеза протокормов орхидных создан банк протокормов in vitro, путем оптимизации химического состава питательных сред и условий культивирования. При заданных климатических режимах, в том числе при комнатной температуре и 16-ти часовом фотопериоде, разработанная безгормональная среда Thomale-м оказывала ретардантное действие на прорастание семян и органогенез протокормов орхидных. Зародышы в семенах, культивируемых на этой среде, оставались живыми в течение 12−14 мес. (у видов Cymbidium erythrostylum, Dendrobium crumenatum, D. hercoglossum и Cleisostoma birmanicum). При пересадке протокормов Dendrobium bullenianum с питательной среды Thomale-м на среду Knudson наблюдали восстановление нормального роста и развития.

Семена орхидей имели высокую криоустойчивость и были успешно криосохранены путем прямого погружения в жидкий азот без криопротекторов и сложных методов защиты от повреждающего действия сверхнизких температур. В результате проведенных исследований, криобанк семян тропических и субтропических орхидных пополнен 85 образцами, на каждый из которых разработаны специальные паспорта.