Успехи в разработке твердофазного синтеза олигонуклеотидов и методов гибридизации к концу 80-х годов заложили фундамент для возникновения принципиально новой технологии, основанной на использовании матриц иммобилизованных олигонуклеотидов. Объединение большого числа олигонуклеотидных проб на сравнительно небольшой поверхности матрицы (микрочипа) значительно расширило круг решаемых задач по исследованию первичной структуры нуклеиновых кислот. Благодаря олигонуклетидным чипам стали возможными параллельные манипуляции с тысячами проб нуклеиновых кислот. На сегоднешний день сфера применения микрочипов влючает картирование генома, скрининг клонов, упорядочивание библиотек клонов, детекцию специфических нуклеиновых кислот в сложной смеси (исследование экспрессии различних генов, диагностика вирусных и бактериальных инфекций), определение одиночных замен в последовательности (типирование генов, исследование полиморфизма генов, диагностика генетических заболеваний) и секвенирование.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Определение перичной структуры нуклеиновых кислот гибридизацией с микрочипом.
1.1.1 Секвенирование гибридизацией: методы и возможности.
Концепция секвкенирования гибридизацией появилась в конце 80-х (Bains and Smith, 1998; Dramaniac et al., 1989; Khrapko et al., 1989; Southern, 1989). Идея состоит в определении списка всех подпоследовательностей длины L присутствующих в анализируемой последовательности ДНК и последующей реконструкции последовательности путем упорядочивния этих подпоследовательностей по перекрыванию L-1. Список подпоследовательностей присутствующих в ДНК определялся гибридизацией с олигонуклеотидами. Длина олигнуклеотидных зондов предполагаемых для секвенирования составляет 8 нт., что является компромисом о между количеством необходимых олигонуклеотидов (4 =65 536 октамера) и длиной секвенируемого фрагмента.
Очевидно, существует два формата для получения гибридизационных данных: секвенируемая проба иммобилизуется на твердую подложку и последовательно гибридизуется с олигонуклеотидными зондами (дот-блот формат, Dramanac et et, 1989; Craig et al., 1990), либо на твердую подложку иммобилизуются олигонукпеотиды, затем проводится гибридизация с одной пробой (обратный дот-блот формат, Bains and Smith, 1988; Khrapko et al, 1989; Southern, 1989, Pease et al., 1994).
Первый, дот-блот формат оправдан только когда необходимо одновременно анализировать десятки тысяч проб ДНК. В противном случае для получения сравнительно небольшого объема информации приходится затрачивать огромные усилия проводя большое количество гибридизаций. Поэтому такой формат предполагается использовать только для исследования геномов, картирования и упорядочиваня библиотек, иными словами только в очень крупномасштабных проектах (Miloslavljevic et al, 1996; Pharmaceutical Buisiness News, 1996). Реверс дот-блот формат болеше подходит для диагностики, детекции полиморфизма и, в особенности, для поиска неизвестных мутаций. В дальнейшем рассотрении мы обратим больше внимания этому формату. Таким образом, микрочип состоит из набора индивидуальных нуклеиновых кислот ковалентно связанных с твердой подложкой, образуя регулярный паттерн известной топологии. Секвенирующий (=универсальный) микрочип содержит набор всех возможных п-меров и, в первую очередь, используется для гибридизации с неизвестной последовательностью. На диагностическом микрочипе иммобилизован набор олигонуклеотидов специфичных для конкретной последовательности ДНК. Проба ДНК (РНК) фрагментируется (для уменьшения вероятности образования вторичной структуры, что интерферирует с гибридизацие на чипе), метится какой-либо репортерной молекулой и гибридизуется с микрочипом. В идеале ДНК гибридизуется только с теми олигонуклеотидами, которые полностью ей комплиментарны. Теоретически можно представить количественную гибридизацию, когда по результатам анализа гибридизационного паттерна можна будет составить список подпоследовательностей включающий также частоту их встречаемости в анализируемой последовательности (Bains and Smith, 1988). К сожалению, на сегодняшний день экспериментальные данные все еще далеки от такого идеала (см. ниже).
Как следует из вышесказанного, при реконструкции последовательности возникают неоднозначности, если подпоследовательность длиной более L-1 встречается больше одного раза в исследуемой последовательности. Каждый такой повтор является точкой ветвления в процессе реконструкции, так как несколько последовательностей могут иметь одинаковый список подпоследовательностей. Эта проблема является самым существенным ограничивающим фактором для секвенирования de novo (Pevzher et al, 1991). На секвенирующем чипе октамеров однозначно можно реконструировать 94%, 32%, 0,9% фрагментов ДНК случайной последовательноси длиной соответственно 50, 200, 400 нт. (Chetverin and Kramer, 1994). Ситуация еще хуже с природной ДНК, так как она обычно содержит больше повторов. Компьютерная симуляция показывает, что разрешаемая длина для секвенирования на чипах может быть увеличена в четыре раза, если о фрагменте имеется дополнительная информация — например, последовательность концов, примерная длина фрагмента, или количество копий каждого д?-мера в последовательности (Pevsner- 1989; Bains, 1991). Интенсивность гибридизационного сигнала зависит от множества факторов, в частности GC-состава, вторичной структуры ДНК, окружающей последовательности (Southern et al., 1992 Drmanacetal, 1993), так что восстановить количество встречаемости каждого фрагмента по гибридизационному паттерну не представляется возможным.
1.1.1. а. Дополнительная гибридизация встык и лигирование.
В работе {Pieters et al., 1989) было показано, что два пригибридизованных встык гексамерама формируют стабильный дуплекс. Анализ полученных дуплексов с помощью ядерного магнитного резонанса показал их соответствие В-форме ДНК с незначительными отклонениями в области концевых нуклеотидов. Стабилизация происходит за счет стекинг-взаимодействия соседних оснований из разных гексамеров. Таким образом, без дополнительных существенных затрат на синтез, иммобилизованные олигонуклеотиды можно удлиннить за счет гибридизации встык кортоткого олигонуклеотида, который не образует самостоятельно стабильный дуплекс с ДНК (КИгарко е? а/., 1989). Так, дополнительной гибридизацией встык (ДГВ) пентамера на секвенирующем октамерном микрочипе генерируется частичная матрица 13-меров без существенного увеличения сложности микрочипа (удлиняется только часть иммобилизованных олигонукпеотидов, которые уже образовали дуплекс). Как было показано (Parinov et а!., 1996), гибридизация двух пентамеров встык также возможна. Однако, три пентамера расположенные встык самостоятельно образуют достаточно стабильный дуплекс. Таким образом, два раунда ДГВ позволяют получить частичный микрочип 18-меров. Библиотеку пентамеров составляет 1024 олигонуклеотида. Очевидно, что проводить такое количество дополнительных гибридизаций не очень веселое занятие. Однако, количество гибридизаций может быть существенно снижено при использовании в пентамерах универсальных оснований и (или) смеси всех четырех природных оснований вместе с использованием нескольких флуоресцентных красителей (о алгоритме см. УегаЛоу е (а., 1996; Parinovet а1., 1996).
В ряде работ было показано, что чувствительности ДНКлигаз достаточно для выявления одниночных замен в районе сшиваемиго разрыва (1-апс1едгеп еа., 1988; Ватпдег et а1., 1990; Вагапу, 1991). В работе (Broude et а1., 1994) было предложено использовать лигирование смежных олигонукпеотидов для разработки альтернативного метода секвенирования. Основной особенностью предполагаемых чипов является использование «полу-двухцепочечной» иммобилизованной ДНК пробы, содержащей одноцепочечный свисающий конец известной последовательности длиной 5 нт. вместо обычных одноцепочечных проб. Лигирование одноцепочечной радиоактивно меченной ДНК прегибридизованной на эту 5-членную последовательность обеспечивает высокую дискриминацию одиночных З'-концевых мисматчей. Для возможности восстановления структуры повторов и точек ветвления встречающихся в исследуемой последовательности было предложено использовать последовательное сиквенс-специфическое лигирование на олигонуклеотидных микрочипах (Dubiley et al., 1997). Однако, для диагностики, пруф-ридинга и пр., однозначная реконструкция исходного сиквенса в большинстве случаев не является проблемой, так как последовательность частично известна и разница в списках подпоследовательностей достаточна для для детекции мутаций. Для таких задач использование олигонуклеотидных микрочипов основывается на факте что для гаплоидного пробы каждая мутация (или полиморфизм) приводит к появлению новых олигонуклеотидов в списке подпоследовательностей с одновременным исчезновением подпоследовательностей входящих в дикий тип. Одиночная замена приведет к появлению L новых подпоследовательностей, делеция — к L-1, и инсерция к по крайней мере к L новых олигонуклеотидов, в зависимости от длины вставки, причем независимо от плоидности исследуемой пробы. Конечно, может произойти так, что список новых подпоследовательностей вызванных мутацией уже присутствует где: либо в последовательности дикого типа. В этом случае, гибридизационный паттерн останется неизменным и така мутация неможет быть детектирована на микрочипах. Однако, мутация может быть обнаружена если по крайней мере часть из новых подпоследовательностей отсутствует в списке для ДНК дикого типа, либо новый список не содержит часть подпоследовательностей для дикого типа.
1.1.2 Методы производства микрочипов.
В качестве подложки для микрочипов обычно используют кварцевое или обычное стекло (Maskosetal, 1992; Guoetal., 1994; Pease etal., 1994), или кремниевые пластинки (Lamture et al., 1994; Beattie et al., 1995). Стекло — достаточно дешевый материал, обладает хорошими оптическими свойствами, химия его активации хорошо известна и широко используется в твердофазном синтезе и других биологических методах. Кремний — более дорогой материал, но он позволяет интегрировать электронную детекцию гибридизации. Также некоторыми авторами предполагалось использовать полипропиленовые подложки для олигонуклеотидных чипов (Maison et al., 1995; Southern, 1995), так как этот материал очень дешев и химически инертен.
Небольшие размеры микрочипов и полотное расположение олигонукпеотидовнеобходимоы условия работы с реальными количествами образца нативной ДНК в реверс дот-блот формате. Существует два подхода в производстве таких чиповиммобилизация пресинтезированных олигонуклеотидов, либо синтез олигонукпеотидов непосредственно на подложке чипа.
Первый метод имеет ряд преимуществ — разработанный твердофазный синтез олигонуклеотидов на коммерческих автоматических синтезаторах, разработана стандартная химия введения «модифицированных оснований, etc., возможность очистки и приведения концентраций до стадии нанесения олигонуклеотидов на микрочип. Таким способом можно получать чипы с иммобилизованными кДНК, бактериальными клонами, etc. Нанесение олигонуклеотидов с интервалом в 100−300 р возможно с помищью адаптированных роботизорованных систем (Beattie et al., 1995; Shalon et al., 1996; Yershov et al., 1996).
Однако, с точки зрения массового производства таких микрочипов, существуют проблемы. Прежде всего, время и сложность процессинга значительно увеличивается с увеличением длины олигонуклеотидов. Синтез и нанесение 4 096 гексамеров не выглядит задачей запредельной сложности. Однако, процессирование 16 384 гептамеров или 65 536 октамеров уже вызывает сложности.
Синтез in situ позволяет избежать процессирования десятков тысяч растворов, что, безусловно, большое преимущество по сравнению с предыдущим методом. A. Blanchard et al. использовали стандартный подход в in situ синтезе — каждый олигонуклеотид синтезировался отдельно. Стандартная фосфорамидитная химия олигонуклеотидного синтеза была адаптирования к нанообъемам (Blanchard and Hood, 1996). Принцип струйного принтера используется также рядом других групп (.Eggers et al., 1994). Такая технология позволяет синтезировть до 1 ООО олигонукпеотидов с интервалом в 100 р за 2 часа (Blanchard and Hood, 1996). Однако, количество необходимых шагов синтеза и сложность производства драматически возрастает с увеличением длины олигонулеотида. Единственный способ избежать этого — использование комбинаторной химии. Такое решение проблемы на основе фосфорамидитной химии предложил Е. Southern. На активированной подложке микрочипа закрепляется маска таким образом, что образуются параллельные каналы-строки (Southern et al., 1992; Southern et al., 1994; Maison et al., 1995). Один цикл синтеза происходит внутри канала, причем с разными предшественниками в каждом канале. После завершения цикла, подложку чипа поворачивают на 90°, так, что маска образует каналы-колонки, перпендикулярные предыдущим, и проводится следующий цикл синтеза. В результате повторений поворота маски каждый иммобилизационный сайт определяется пересечением строк и колонок, и несет определенный олигонуклеотид. При таком способе синтеза количество циклов синтеза равно длине олигонукпеотида (Southern et. al., 1992). Безусловно, такой подход имеет огромное преимущество для массового производства, так как проще провести 8 шагов синтеза вместо синтезирования 65 536 индивидуальных олигонукпеотидов. Однако, такой подход требует быстрой прокачки жидкостей по поверхности, что осложняет задачу уменьшения размеров чипа. Наименьший размер сайта иммобилизации который удалось получить таким способом — 500×500 ц2 {Matson et al., 1995). Такой размер сайтов слишком велик для использования октамеров в секвенирующих чипахплощадь такого чипа будет составлять более 15 см².
Фирмой Affymetrix предложен другой метод комбинаторного синтеза олигонуклеотидов, позволяющий уменьшение размеров. Защитные группы мономеров модифицированы так, что стандартная стадия депротекции кислотой заменяется фотодепротекцией (Fodoretal., 1991). Перед каждым последующим шагом синтеза освещаются только те сайты, которые должны быть активированы. В результате четырех реакций последовательных реакций с четырьмя мономерами все олигонуклеотиды на микрочипе удлиняются на одно основание и полный набор октамеров на микрочипе может быть синтезирован за 32 реакционных цикла. Более того, положение каждого ологонуклеотида на микрочипе может быть произвольным, в отличие от метода используемого Southern’oM.
Размер иммобилизационных сайтов, получаемых с помощью фотолитографии составляет 25×25 (j2 (Pease et al., 1994) или 10×10 (j2 (Lipschutz et al., 1995). Более того, Affymetrix — единственная фирма, которая производит микрочипы из нескольких десятков и сотен тысяч олигонуклеотидов (Lipschutz et al., 1995; Kozal et al., 1996). Неспецифическая сорбция олигонуклеотидов на поверхности микрочипа может представлять собой серьезную проблему. Давно известно, что оксид кремния может сорбировать ДНК. Более того, в большинстве случаев иммобилизация олигонуклеотидов начинается с аминирования поверхности подложки, обычно с помощью триметоксисилана содержащего аминогруппу (Guo et al., 1994; Pease et al., 1994; Matson et al., 1995). Однако, аминированные поверхности могут неспецифически удерживать ДНК (Elaissari et al., 1994; Elaissari et al., 1995). Сорбция на поверхности может представлять проблему для массового производства микрочипов по многим причинам: падает воспроизводимостьуменьшается количество доступных для гибридизации олигонуклеотидовувеличивается фон неспецифической сорбции меченной гибридизационной пробы. До сих пор не ясно может ли неспецифическая сорбция уменьшать специфичность гибридизации, как это было показано для белков (Lin et al., 1991).
1.1.3 Специфичность гибридизации.
Уже давно известно, что гибридизация олигонуклеотидов с иммобилизованной ДНК (дот-блот формат) может быть очень специфичной (Wallace et al, 1979). Благодаря этом была разработана гибридизация с аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами (ASO) для детекции однонуклеотидных замен в пробах ДНК. Для детекции мутаций таким методом исследуемый нуклеотид должен был находится во внутренней позиции аллель-специфичного олигонукпеотида (Alfarano et al., 1990). Позднее было показано, что для олигонуклеотидов длиной 6−8 оснований концевые мисматчи также могут быть детектировны (Dramanac et al., 1990). Возможность дискриминации концевых мисматчей черезвычайно важна для секвенирования на универсальных микрочипах (см. выше). Авторами также было показано, что фон неспецифической гибридизации в основном обусловлен накоплением нескольких концевых мисматчей {Dramanac et al., 1990; Strezoska et al., 1991) и гибридизацией с октамерами может быть проанализирована ДНК длиной до 8 тпн с приемлемой фоновой гибридизацией (Strezoska et al., 1991).
Эти эксперименты были проведены в дот-блот формате, с гибридизуемыми олигонукпеотидами находящимися в расстворе. Для реверс дот-блот формата с иммобилизованными короткими олигонуклеотидами также было проведено исследование возможности дискриминации концевых мисматчей. Результаты показали высокую специфичность иммобилизованных октамеров и значительный уровень дискриминации концевых мисматчей (Persson et al., 1995; Yershov et al.,.
1996), включая G: T мисматч, который считается наиболее стабильным (Martin, 1985; Ikuta et al., 1987; Khrapko et al., 1991).
Однако, анализ гибридизационного паттерна становится серьезной проблемой при увеличении количества иммобилизованных. олигонукпеотидов. Надежная дискриминация описанная выше получена когда условия гибридизации и отмывки были специально оптимизированы для определенных олигонуклеотидов. Стабильность котротких дуплексов значительно зависит от последовательности. Таким образом, сложно достигнуть оптимальных условий дискриминации для всех возможных мисматчей одновременно. Дискриминация даже внутренних мисматчей затруднительна при длинах олигонуклеотидов больше 11−12 оснований. Когда проба гибридизуется с секвенирующим чипом для каждого перфектного олигонукпеотида присутствуют 6 олигонуклеотидов с концевыми мисматчами и значительно больше с внутренними мисматчами. Из этого следует, что при недостаточной дискриминации количество ложно-положительных сигналов может оказаться значительно большим чем перфектных, что делает анализ такого паттерна практически невозможным. Вероятно, это наиболее существенная проблема секвенирования на микрочипах, которая до сих пор не решена в полной мере.
Был предложен целый ряд подходов к выравниванию стабильностей дуплексов. Соли тетраалкил аммония, также как и бетаин, подавляют разницу в стабильности дуплексов разного состава {Wood et al., 1985; Jacobs et al, 1988; Rees et al., 1993). Большинство работ были проведены с хлоридом тетраметиламмония (TMACI) группой Southern’s. Было показано, что 4.5 M TMACI значительно уменьшает разницу в стабильности для коротких дуплексов, но не приводит к их полному выравниванию {Maskos and Southern, 1993). Другие соли неисследованы так подробно, вероятно потому, что они приводят к сильной дестабилизации всех дуплексов.
Другой химический подход был предложен недавно (Hoheisel, 1996). Этот метод основан на том, что стабильность дуплекса с ДНК-мишенью уменьшается, если в олигодезоксирибонуклеотид вводить рибонуклеотиды. Дестабилизирующий эффект пропоционален доле замененных нуклеотидов, тогда как полностью дезоксирибо-или рибоолигонуклеотид более стабилен (Hoheisel, 1996). Таким образом, можно создать секвенирующий микрочип, на котором менее стабильные олигонуклеотиды будут полностью гомогенны, тогда как в более стабильных будут произведены частичные замены, что должно привести к выравниванию стабильностей всех дуплексов. Однако, необходимо накопить больше данных для подтверждения работоспособности такого метода. Кроме того, введение рибонуклеотидов может привести к большей «хрупкости» микрочипов и сделать их массовое производство более дорогостоящим.
Молодая биотехнологическая компания Nanogen предложила принципиально новое решение проблемы гибридизационной специфичности. Nanogen предлагает к месту иммобилизации олигонуклеотида на микрочипе подводить микроэлектрод (Heller, 1995). Это позволяет контролировать направление и величину электрического поля для каждого олигонуклеотида. В процессе гибридизации электрическое поле направлено в от микрочипа, что приводит к концентрированию ДНК на иммобилизованных олигонукпёотидах. Благодаря этому достигается высокая скорость гибридизации, вызванная высокой локальной концентрацией ДНК-пробы. В процессе отмывки происходит изменение направления электрического поля на обраное, вымывая негибридизованную часть ДНК-пробы. Скорость диссоциации дуплексов изменяется при изменении напряженности электрического поля. Таким образом можно подобрать условия отмывки для каждого олигонуклеотида, прикладывая электрическое поле с большей напряженностью к более стабильным олигонуклеотидам (Heller, 1995; Sosnovsky, et al, 1997). Этот подход черезвычайно эффективен для нормализации условий отмывки по стабильности дуплексов, позволяет быстро (<15 сек.) и с высоким разрешением достигать дискриминации одиночных мисматчей. Стоимость такого микрочипа также может быть умеренной, так как нет необходимости подводить столько же электродов, сколько иммобилизованых олигонуклеотидов. Пятдесят-сто разных микроэлектродов подведенных к набору иммобилизационных сайтов должно быть достаточно для нормализации всех дуплексов.
Однако, необходимо отметить, что Ыаподеп проводит гибридизацию в неселективных условиях, что приводит к формированию как перфектных таки мисматчевых дуплексов на одном олигонукпеотиде. В условиях отмывки мисматчевые дуплексы быстро диссоциируют, тогда как перфектные диссоциируют медленно. Остаточная интенсивность сигнала перфектных дуплексов может оказаться значительно заниженной из-за исходного присутствия мисматчевых дуплексов (КИгарко et а!., 1991, ?.л^Мз et а!., 1992). Поэтому необходимо нормализовать стабильности дуплексов не только в процессе отмывки, но и во время гибридизации.
Хорошо известно, что температура плавления дуплексов (и их количество) зависит от концентрации цепей. Температура плавления дуплексов зависит от концентрации иммобилизованного олигонукпеотида в условиях когда количество гибридизуемого фрагмента много меньше количества иммобилизованных олигонуклеотидов (?.л/зМв а/., 1992). Благодаря высокой емкости по иммобилизации для полинукпеотидных гелей можно подбирать концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов так, что стабильности дуплексов будут выравнены. Таким образом, можно достигать нормализации не только в процессе отмывки, но и в процессе гибридизации (Уеге/юу е? а/., 1996). К сожалению, такая нормализация приведет к удорожанию микрочипов при массовом производстве. Высокая концентрация иммобилизованных олигонукпеотидов приводит к большим гибридизационным сигналам и позволяет использовать такие условия гибридизации, при которых только 1% олигонуклеотидов находятся в форме дуплексов (.Livshits et al., 1992).
Для любых методов нормализации необходимо знать параметры нормализации для каждого олигонуклеотида (концентрации или напряженности электрического поля). Однако, обычно используемые формулы расчета стабильности дуплексов (Breslauer et al., 1986) не очень точны (Kierzek et al., 1986). Более поздние исследования показали возможность уточнения таких формул (Docticz et al., 1995), это позволяет надеяться, что массовых экспериментов по определению стабильности для каждого дуплекса можно будет избежать.
2. Применение микрочипов в биологических исследованиях. 1.2.1 Изучение экспресии и обнаружение новых генов.
В первой работе Schema et al измеряли дифференциальную экспрессию генов в Arabidopsis thaliana используя микрочип состоящий всего из 2×48 кДНК. В качестве контроля иммобилизовали кДНК TRP4 дрожжей и рецептора глюкокортикоидов крысы. Такой микрочип гибридизовали с набором проб меченных флуоресцеином или лизамином. Калибровку уровня экспрессии проводили против неспецифической AChR мРНК человека. Эксперименты показали высокую специфичность такой детекции. Авторы предполагают нижний предел чувствительности 1:50 ООО w/w от тотальной мРНК (Schena, 1996). Эксперименты показали, что измерение относительного уровня экспрессии возможно при гибридизации двух образцов мРНК на одном микрочипе.
Авторы опубликовали работу, по мониторингу экспрессии генов человека отвечающих на тепловой шок и обработку форболовым эфиром на 1046 кДНК неизвестной последовательности используя «двухцветный» анализ (Schena etat., 1996). Авторы определили чувствительность такого анализа в 1:500 ООО w/w от тотальной мРНК человека. Препараты тотальной мРНК выделяли из Т-кпеток подвергшихся тепловому шоку или экспонированых к форболовому эфиру. кДНК активировавшихся генов секвенировали и идентифицировали по базе данных EST. Было показано, что в ответ на тепловой шок активируются уже известные гены хит-шока. Экспозиция к форболовому эфиру приводила к экспрессии генов характерных для сигнального пути форболового эфира, таких как фосфатаза активированных клеток и ядерный фактор кВ1. Кроме того, был обнаружен низкий уровень экспрессии трех генов, ранее не относимых к сигнальному пути форболового эфира и идентифицированы 4 новых гена экспрессирующихся на низком уровне. Возможно, используемые ранее способы скринирования были недостаточно чувствительны для обнаружения таких генов. Хотя выводы о количественном определении ' экспрессии несколько спорны, эти эксперименты показали возможность использования микрочипов с иммобилизованной кДНК для быстрого получения данных по корреляции экспрессирующихся генов с биохимическими путями.
Аналогичный подход бы использован в анализе профилей экспрессии некоторых клеток при воспалительных заболеваниях ревматоидным артритом и кишечных воспалениях (Heller et al., 1997). На основе библиотеки кДНК из клеток периферии крови был создан микрочип с иммобилизованными 1046 кДНК. При сравнении профилей экспрессии была выявлена активация генов цитокинов интерлейкина 3, хемокина Gro-a и матриксной металло-эластазы ранее не ассоциировавшихся с воспалительными заболеваниями. Было покозано значительное повышение уровня экспрессии тканевых ингибиторов металлопротеиназы I, легкой цепи ферритина и дисмутазы надоксида Мп при ревматоидном артрите. Полученные данные позволяют говорить о возможности быстрого получения информации о природе заболеваний с помощью анализа профиля экспресии на микрочипах кДНК. De Saizieu et al. исследовали уровень экспрессии некоторых генов Hemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae. Интересным аспектом данной работы было использование препарата тотальной РНК клетки без предварительнго выделения мРНК. мРНК составляет всего 4% от тотальной РНК бактерий и далеко не вся мРНК полиаденилирована. На ¦ микрочипе было иммобилизовано 64 ООО олигонуклеотидных пробы представляющие 100 генов S. pneumoniae. Авторы утверждают возможность детектирования таким методом мРНК представленной всего 1−5 копиями на клетку (De Saizieu et al., 1998).
DeRisi et. al. использовали микрочип содержащий все известные рамки считывания Saccharomyces cerevisiae для изучения на уровне всего генома метаболических изменений в дрожжевой клетке при недостатке глюкозы и переключении на этанол как источник углерода. Изучение профилей экспрессии известных генов позволило определить гены затрагиваемые репрогмированием клетки. Так был пооказано значительное увеличение экспрессии гена алкогольдегидргиназы и одновременное деактивирование гена ацетальдегиддегидрогеназы при переключении на этанол. Паттерн экспрессии множества ранее неохарактеризованных генов может послужить ключем к определению их возможной функции.
1.2.2 Детекция мутаций и исследование полиморфизма.
На примере мутаций в гене протеазы из вируса HIV-1 приводящих к устойчивости к лекарственным препаратам проверяли возможности детекции одиночных замен на микрочипах с синтезированными in situ олигнуклеотидами в сравнении с стандартным секвенированием по Сэнгеру. Было проанализировано 114 образцов вирусного изолята, оба метода давали совпадающие результаты в 98% случаев ОKozal et al. 1996).
Для детекции всех возможных мутаций в 11 экзоне гена BRCA1 приводящих к возникновению рака молочной железы' и яичников использовали микрочип содержащий более 96 тысяч двадцатимеров (Hacia et al. 1996). Меченные разными флуорофорами анализируемая проба и проба ДНК дикого типа гибридизовались одновременно для идентификации различий в гибридизационных паттернах. 14 из 15 проанализированных образцов ДНК пациентов с известными мутациями были корректно определены. Кроме того, было обнаружено восемь полиморфных сайтов. Следует отметить, что для анализа возможных мутаций во всех 22 экзнах гена BRCA1 необходим микрочип содержащий 400 ООО 20-меров.
Аналогичный подход был использован для идентификации полиморфных сайтов в 16,6 т.п.н. митохондриальной ДНК (Chee et al., 1996). Для этого использовали микрочип с 135 тысячами 25-меров. Анализ митохондриального генома был проведен для десяти пациентов, при этом автоматически детектировано 505 сайтов полиморфизма. Согласно расчетам авторов, анализ всего митоходриального генома на микрочипе занимает всего 12 мин. (без учета предварительных стадийприготовления пробы и собственно гибридизации).
3-талассемические мутации были проанализированы на микрочипе с пресинтезированными деканукпеотидами иммобилизованными в полиакриламидном геле (Yershov et al., 1996). Для усиления дискриминации одиночных мисматчей был использован метод дополнительной гибридизации встык (ДГВ) флуоресцентно меченного пентамера.
1.2.3 Картирование генов и упорядочивание библиотек.
Shalon et al. приготовили микрочип содержащий 1744 элемента соответствующих 864 физически картированных Л-клонам. Этот набор клонов представлял собой 75% генома S. cerevisiae. Два набора изолированных хромосом дрожжей (6 наибольших иЮ маленьких) меченных различными флуорофорами гибридизовали с микрочипом. Таким образом авторами была продемонстрирована возможность применеия микрочипов для массового физического картирования генов (Shalon et al., 1996). Олигонуклеотидный микрочип был использован для упорядочивания космидной мини-библиотеки S. cerevisiae — 12 клонов (Sapolsky and Lipshutz, 1996). Авторами показано, что данный метод упорядочивания не требует получения предварительной информации о последовательности клонов. Для упорядочивания клонов использовали статистический анализ. Десять клонов были упорядочены в один непрерывный сиквенс по перекрыванию гибридизационных паттернов.
1.3 Минисеквенирование.
Минисеквенирование на сегодняшний день один из наиболее точных и надежных методов идентификации полиморфных сайтов. Предложенный (Syvanen et al., 1990) метод состоял из двух шагов. На первом этапе одноцепочечный продукт интересующего участка геномной ДНК. На втором этапе проводился отжиг и энзиматическое удлиннение на один нуклеотид секвенирующего праймера прилегающего с 5'-конца к анализируемому сайту. Наличие мутации определяли по включению комплиментарного нуклеотида, несущего радиоактивную метку. Авторы использовали Taq ДНК полимеразу, Sequenase и Klenow фрагмент E. coli DNA полимеразы I. Было показано, что в отличие от первых двух, Klenow фрагмент DNA полимеразы I из Е. coli допускает высокий уровень неправильного включения, в результате чего значительно повышает фон. Авторы предполагают, что уровень чуствительности этого метода достаточен для детекции 1% молекул мутантных по анализируемому сайту.
Растворный вариант минисеквенирования, а особенно минисеквенирование в плашках с иммобилизованными праймерами, широко используется для анализа полимирфизма (Nikiforov et al., 1994; Tully et al., 1996), диагностики точечных мутаций {Fahyetal., 1997), определения’копийности генов (Laan eta!., 1995) и количественого анализа низкопредставленных мРНК (Ikonen et al., 1992). Для проведения множественного минисеквенирования было предложено использовать праймеры различной длины с последующим их электрофоретическим разделением (Tully et al., 1996), либо использовать масспектрометрические методы (Haff and Smirnov, 1997). Недавно появились работы показывающие возможность проведения минисеквенирования с праймерами иммобилизованными на стекле (Pastinen et al., 1997; Pastinen et al., 1998).
За последние восемь лет появился целый ряд методических работ посвященных различным модификациям этого метода. Наиболее интересными являются работы (Chen et al., 1997). Для повышения специфичности метода и понижения фона авторы предложили использовать перенос энергии между двумя флуоресцентными метками. Перенос энергии между двумя флуоресцентными молекулами возможен, если они находятся в непосредственной близости друг от друга и спектр эмиссии одной перекрывается со спектром поглощения другой (Clegg, 1995). Энергетический перенос определяется диполь-дипольными взаимодействиями, когда возбуждающая энергия поглощенная одной молекулой (донором) не рассеивается в виде флуоресценции, а передается другой (акцептору). При возбуждении донора интенсивность его специфической эмиссии падает (затухает), тогда как интенсивность специфической эмиссии акцептора возрастает. Таким образом, изменение в интенсивности флуоресценции донора и акцептора может быть использовано как показатель расстояния между двумя флуоресцентными молекулами. Хотя увеличение расстояния • между двумя флуорофорами существенно уменьшает эффективность энергетического переноса, гидрофобное взаимодействие между органическими красками в расстворе делает возможным наблюдение переноса энергии даже если флуорофоры разнесены в олигонукпеотиде на расстояние в 20 оснований. Таким образом, возможность детектировать внутримолекулярный перенос энергии на фоне межмолекулярного позволила использовать это как уникальную детектирующую систему. Для этого, фрагмент ДНК содержащий сайт полиморфности гибридизовался с секвенирующим праймером (несущим на 5'-конце'флуоресцеин), в присутствии ДНК полимеразы и четырех дидезоксинукпеозид трифосфатов, один из которых конъюгирован с производным родамина. После включения ДНК полимеразой соответствующего нуклеотида в секвенирующий праймер две флуоресцентные метки оказываются достаточно близко расположенными для возникновения резонансного переноса энергии.
В 1997 году появилась работа РавИпеп et а1. в которой была продемонстрирована возможность использования принципа минисеквенирования на олигонуклеотидных чипах. Олигонукпеотиды иммобилизовали на стекле. Замены детектировали достраиванием иммобилизованного секвенирующего праймера используя смесь дидезоксинукпеозид трифосфатов, один из которых нес радиоактивную метку. Чип содержал один олигонуклеотид на исследуемый сайт, таким образом, для определения типа замены необходимо было провести четыре реакции и, соответственно, использовать четыре олигонуклеотидных чипа. Авторами было показано, что для ТЬегтоБериепазе и ОуЫАБед отношенние ложно положительного сигнала к положительному составило 1:65 и 1:87 соответственно.
В последнее время интенсивно разрабатываются методы секвенирования нуклеиновых кислот с применением масс-спектроскопии (MALDI). В 1993 году Keough с соавторами предложил использовать масс-спектроскопический анализ для проверки качества синтеза олигонуклеотидов длиной до 18. Познее было показано, что использование delayed ion extraction technique значительно улучшает разрешение метода (Juhasz et al., 1996; Smirnovet al" 1996). Опубликован ряд работ показывающих возможность детектирования одиночных замен минисеквенированием (Haff and Smirnov, 1997) и проведения секвенирования коротких последовательностей (Koster et al., 1996) с последующей детекцией продуктов реакции MALDI-TOF MS.
ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 Использованные приборы и реактивы.
В работе были использованы следующие реагенты: 2', 3'-дидезоксинуклеотид 5'-трифосфаты ddNTP (Pharmacia) 2'-дезоксинуклеотид 5'-трифосфаты (dNTP) (Pharmacia) 7-deaza-dGTP, dUTP (Boehringer Mannheim) Bind-Silane (метакрилоксипропилтриметилоксисилан) (Pharmacia) DNA Rapid Ligation kit (Boehringer Mannheim) М, М-диметилакриламида (BioRad Laboratory) Ы^-метилен-бис-акриламида (BioRad Laboratory) Na2HP04 (Aldrich) NaH2P04 (Aldrich).
Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene) QIAquick PCR purification kit (QIAGene).
Repel-Silane (2% раствор диметилдихлорсилана в 1,1-дихлорэтане) (Pharmacia).
Т4 полинуклеотид киназа (Epicentre Technology).
Taq Plus Precision (Stratagene).
TEMED (BioRad Laboratory).
ThermoSequenase ДНК полимераза (Amersham).
Tris (Sigma).
Tween-20 (Aldrich).
Ацетат триэтиламмония (Fisher Scientific) Ацетон (JC Backer).
Ацетонитрил для HPLC (Fisher Scientific).
Боргидрид натрия (Sigma) Борная кислота (Sigma) Гидроксид калия (Aidrich) Глицерин (JC Backer) Карбамид (USB).
Концентрированная соляная кислота (Sigma) Метиленовый синий (Fisher Scientific) Муравьиная кислота (Aldrich) Периодат натрия (Aldrich) Персульфат аммония (Sigma) Перхлорат лития (Sigma) Пиперидин (Aldrich).
Пиридиний борановый комплекс (Aldrich).
Реактивы для олигонуклеотидного синтеза (Glen Research).
Трифторуксусная кислота (JC Backer).
Триэтиламин (Fisher Scientific).
Уксусная кислота (JC Backer).
Урацил ДНК гликозилаза (Boehringer Mannheim) флуоресцеин-дидезоксинуклеотид 5'-трифосфаты (ddNTP-FL) (NEN DuPont).
Формамид (Aldrich).
Хлороформ (JC Backer).
ЭДТА (Sigma).
Этанол (JC Backer).
2.2 Синтез и очистка олигонуклеотидов.
Олигодезоксинуклеотиды с 5'-концевым амином, которые были использованы для иммобилизации на твердом носителе, а также олигодезоксинуклеотиды, которые использовались в качестве праймеров, фрагментов ДНК и флуоресцентно меченные олигодезоксинуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидным методом на ДНК/РНК синтезаторе ABI-394 (Applied Biosystems Inc.). Очистку олигонуклеотидов проводили обратнофазной высокоэффективной жидкосной хроматографией на приборе HPLC (Rainin), в следующих условиях: Cie Nucleosil колонка, 10−50% CH3CN в 0.1 М ацетате триэтиламмония. Тритилированный продект собирался, высушивался на вакуумном испарителе Labconco. Детритилирование проводили в 100 мкл воды 5% трифторуксусной кислоты, раствор нейтрализовали добавлением 15 мкл триэтиламина, затем высушивали.
2.3 Приготовление олигонуклеотидных микрочипов. 2.3.1 Приготовление микроматриц.
Для приготовления микроматрицы гелевых элементов разделенных гидрофобной поверхностью был использован метод фотополимеризации (Guschin et al., 1997). Для получения однородной активной поверхности стандартные предметные стекла для микроскопа (Corning) подвергали обработке. 30 мин в 4 М растворе КОН для активации силановых групп на поверхности стекла, затем 30 мин в 4 М растворе HCI для замещения ионов калия на силановых группах на протоны. На стекло для пришивки ПААГ наносили тонкий слой спиртового раствора Bind-Silane (200 мкл 96% этанола, 2 мкл ледяной уксусной кислоты, 10 мкл Bind-Silane (Pharmacia)), избыток удаляли этанолом.
Обработку фотополимеризационной маски Repel-Silane (Pharmacia) проводили в течение 5 мин, промывали спиртом и затем водой и высушивали. Маска для фотополимеризации представляет собой кварцевое стекло размером 100×100×1.5 мм2 на внутреннюю сторону которого нанесен непрозрачный слой хрома толщиной 1 мкм. В хромовом покрытии на расстоянии 200 мкм расположены прозрачные «окошки» размером 100×100 мкм2.
Из предметнго стекла и маски собирали «сэндвич» с тефлоновым спейсером толщиной 20 мкм. «Сэндвич» заполняли раствором 4%-го М, 1М-диметилакриламидаN.N-метилен-бис-акриламида — Ы-(5,6-ди-0-изопропилиден)гексилакриламида (19:1:0.05), 40% глицерина, 0.002% митиленового синего, 0.012% TEMED в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7.0 и помещали для полимеризации под источник света (длина волны 254 нм) на 30 мин. После полимеризации маску снимали, микроматрицу промывали водой и высушивали.
2.3.2 Иммобилизация олигонукпеотидов.
Непосредственно перед нанесением олигонукпеотидов микрочип обрабатывали Repel-Silane. Для генерации на геле альдегидных групп микрочип помещали в 2% трифторуксусную кислоту на 5 мин, промывали водой и обрабатывли 100 мМ Nal04 10 мин. (Е. Timofeev et. al., 1996). Один нанолитр раствора олигонуклеотида наносили на элемент микрочипа с помощью специально сконструированого в Институте молекулярной биологии им. Энгельгардта робота, оснащенного термостатируемой иглой. Воспроизводимость нанесения составляла ±8%. Температура иглы поддерживалась на уровне точки росы для того чтобы избежать испарения переносимого олигонуклеотида и конденсации влаги.
Иммобилизацию олигонукпеотидов проводили в 1% растворе пиридиний борана в насыщеном водой хлороформе в течение 12 ч. Непрореагировавшие альдегидные группы восстанавливали 100 мМ NaBhU 10 мин. После иммобилизации олигонуклеотидов микрочип отмывали водой при 65 °C в течение 60 мин.
2.4 Детекция и обработка флуоресцентного сигнала.
Для анализа флуоресцентных сигналов на микрочипе в Институте молекулярной биологии имени Энгельгардта (Москва) при сотрудничестве с Государственным Оптическим Институтом (Скт.Петербург) был разработан эпифлуоресцентный микроскоп, оборудованный ПЗС-камерой TE/CCD512SF (Princeton Instruments). Специальный объектив с 4 мм полем зрения покрывает до 1000 элементов микрочипа. Детекция флуоресцентных красителей проводилась с использованием различных комплектов фильтров (OMEGA Optical) для TMRHEX и FAM. Изображение микрочипа на • ПЗС-камере анализировалось на персональном компьюторе с помощью специальной программы, разработанной в Институте молекулярной биологии имени Энгельгардта.
Для печати использовалось линейное преобразование приводящее наиболее яркие сигналы к одному уровню для всех рисунков.
Для цифровых обсчетов использовали программу «Hybridization Results Processing Toolbox», разработанную E. Кирилловым (Институт молекулярной биологии имени Энгельгардта).
Для анализа данных использовался следующий алгоритм. Предлагалось, что фоновая флуоресценция стекла и сорбировавшихся на нем флуоресцентных молекул одинакова для всего микрочипа. Сорбция флуоресцентных молекул на гелевые элементы одинакова для всего микрочипа. Каждый гелевый элемент окружался двумя концентрическими квадратными рамками: внутренней, которая полностью накрывает гелевый элемент, и внешней, несколько большего размера, но не накрывающей соседние элементы микрочипа. Флуоресцентный сигнал усреднялся по площади внутренней рамки © и по площади между внутренней и внешней рамками (В, фон). Флуоресцентный сигнал (J) вычисляется по формуле J = (C-B)/B, что позволяет компенсировать разницу в интенсивности возбуждающего света. В случае анализа сухих микрочипов вычисленный по приведенной формуле сигнал отличается от реального из-за сорбции флуоресцентных молекул на гелевые элементы. Для этих случаев флуоресцентный сигнал D определяется вычитанием флуоресцентного сигнала пустого гелевого элемента (J) из сигнала с элемента микрочипа в котором иммобилизован олигонуклеотид {JS):D = JS-Jg. 2.5 Получение ДНК.
2.5.1 Полимеразная Цепная Реакция.
В 100 мкл ПЦР смеси содержалось 200 мкМ dATP, 200 мкМ dCTP, 180 мкМ dGTP, 20 мкМ 7-deaza-dGTP, 180 мкМ dTTP, 20 мкМ dUTP, ДНК, 50−100 пмоль каждого праймера, 5 едениц Taq Plus Precision DNA polymerase mixture (Stratagene), 1 еденица Perfect Match PCR Enhancer (Stretagene), в 1xTaq Plus Precision буфере (Stratagene). Все реакции проводили в амлификаторе GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co.). В случаях когда это было необходимо, после проведения реакции ПЦР продукт очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) согласно протоколу производителя.
Получение фрагмента LeF гена из В. anthracis. Для амплификации фрагмента длиной 100 пн использовали 30 нг очищеного фрагмента LeF гена длиной 104 пн (получен из USAMRID) и праймеры lef-up 5'-atatgaacccgtacttgtaat-3', lef-low 5'-ccttgataatatcttacctattt-3 Температурный режим: 95°С/ 5 мин, 30 циклов (94°С/ 20 с 50°С/ 20 с 72°С/ 25 с), 727 7 мин.
Получение фрагмента РА гена из В. anthracis. Для амплификации фрагмента длиной 245 пн использовали 50 нг очищеного фрагмента РА гена длиной 249 пн (получен из USAMRID) и праймеры pag-up 5'-agttcccaggggttactagga-3 pag-low 5'-tacttcttggtcatctacccaca-3 Температурный режим: 95°С/ 5 мин, 30 циклов (95°С/ 20 с 52°С/20 с 72°С/45 с), 727 7 мин.
Получение фрагмента 2-го экзона гена HLA DQA1. Для амплификации фрагмента длиной 249 пн. 2-го экзона гена DQA1 использовали 0.5 мкг геномной ДНК человека и праймеры 2DQA1-up 5'-atggtgtaaacttgtaccagt-3 2DQA1-low 5'-ttggtagcagcggtagagttg-3'. Температурный режим: 95°С/ 5 мин, 20 циклов (95°С/ 20 с 55°С/ 20 с 72°С/ 45 с), 727 7 мин.
Получение фрагмента ß—глобинового гена человека. Для амплификации фрагмента длиной 421 пн использовали 0.5 мкг геномной ДНК и праймеры beta-up 5'-tgccagaagagccaaggacagg-3 beta-low 5'-taagggtgggaaaatagacc-3'. Температурный режим: 95°С/ 5 мин, 20 циклов (95°С/ 30 с 65°С/ 20 с 72°С/ 60 с), 727 7 мин.
2.5.2 Фосфорилирование олигодезоксинуклеотидов.
Фосфорилирование олигонуклеотидов проводили прямым кинированием в избытке АТР при 37 °C в течение 60 мин. В 10 мкл реакционной смеси содержалось 50 пмоль олигонукпеотида, 1 еденица Т4 полинукпеотид киназы (Epicentre Technology), 500 пмоль АТР в 1х PNK буфере (Epicentre Technology). Олигонуклеотид очищали электрофорезом в 20% ПААГ в денатурирующих условиях (Трис-боратный буфер, 7 М мочевина) при напряжении 40 вольт/см. Полоски геля, содержащие олигонуклеотидный материал, вырезали под источником ультрафиолета (254 нм) по тени которую оптически плотный материал оставлял на флуоресцирующей пластинке для тонкослойной хроматографии «Silufol» (Kavalier). Элюцию из геля проводили в течение 1 ч при 65 °C 2 М раствором UCI04, после чего олигонуклеотиды осаждали десятью объемами ацетона (15 мин при -20°С).
2.5.3 Фрагментирование ДНК.
2.5.3. а Химическое фрагментирование.
ДНК была фрагментирована реагентами используемыми в методе секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту [Maxam et al., 1980]. ДНК растворяли в 20 мкл 80% муравьиной кислоты (Sigma) и инкубировали 10 мин при 20 °C. Реакция останавливалась добавлением 20 объемов холодного 2% LiCI04 в ацетоне и охлаждением 10 мин до -20°С. ДНК осаждалась 3 мин в микроцентрифуге (Eppendorf) при 14 000 оборотов/мин. Осадок промывали дважды 500 мкл ацетона, сушился на воздухе и растворяли в 100 мкл 10% пиперидина и инкубировали 50 мин при 95 °C. Пиперидин дважды экстрагировали хлороформом, ДНК осаждали 10 объемами 2% LiCI04 в ацетоне. Осадок промывали 70% этанолом, затем ацетоном.
2.5.3.Ь Энзиматическое фрагментирование.
ДНК содержащую урацил фрагментировали урацил гликозилазой (Boehringer Mannheim). ПЦР продукт расстворяли в 1xTaq Plus Precision буфере (Stratagene) и инкубировали с урацил гликозилазой (1 единица фермента на 1 мкг ДНК) 60 мин при 37 °C, затем прогревали при 95 °C в течение 10 мин.
2.5.4 Последовательное лигирование гель — иммобилизованных олигонуклеотидов.
Микрочип приготавливали по методике описанной выше. В элемент микрочипа иммобилизовали 0.1 пмоль предварительно фосфорилированного олигонуклеотида 5'-tgatgactgg-3 Четыре последовательных раунда гибридизации встык и лигирования пентамеров проводились в одинаковых условиях. Микрочип гибридизовали с синтетической одноцепочечной ДНК s-21 5'-gtccccagtcatcacatacatacatacatacatacaatt-3' комплементарной иммобилизованному олигонуклеотиду и одним из флуоресцентно меченным пентамером (P1-FL 5'-FAM-gtatg-3 P2-FL 5'-FAM-tgtat-3 P3-FL 5'-FAM-atgta-3 P4-FL 5'-FAM-tatgt-3 P5-FL 5'-FAM-aattg-3 P6-FL 5'-FAM-aaaat-3 P7-FL 5'-FAM-ttgta-3 P8-FL 5'-FAM-tatgt-3'). Гибридизационный раствор содержал 0.1 мкМ одноцепочечной ДНК s-21, 0.1 мкМ флуоресцентно меченного пентамера в 1х гибридизационном буфере (1 М NaCI, 1 мМ EDTA, 10 мМ фосфта натрия, pH 6.8). Гибридизацию проводили в объме Юмкл при 7 °C в течение 5 мин. Наличие гибридизации с пентамером опредиляли по флуоресцентному сигналу. Флуоресцентный сигнал детектировали как описано выше. Микрочип после гибридизации отмывали в 0.1х гибридизационном буфере 10 мин при 37 °C, затем промывали водой 15 мин при комнатной температуре. Перед проведением реакции лигирования олигонуклеотиды Р1 5'-gtatg-3 Р2 5'-tgtat-3', РЗ 5'-atgta-3 Р4 5'-tatgt-3' фосфорилировали как указано выше. В 4 мкл лигазной смеси содержалось 4 пмоля одноцепочечной ДНК s-21, 40 пмолей фосфорилированного пентамера (Р1, Р2, РЗ или Р4) 1 еденица Т4 ДНК лигазы (Boehringer Mannheim), в смеси 0.5х dilution и 1х ligase буферов (Boehringer Mannheim). Лигазной смесью накрывались элементы микрочипа с иммобилизованным олигонуклеотидом. Реакцию проводили при комнатной температуре (~22°С) в течение 4 ч. Затем микрочип отмывали от непрореагировавшего пентамера водой 10 мин при 37 °C и проводили следующий раунд гибридизации — лигирования.
2.6 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах. 2.6.1 Анализ ДНК методом 3' концевых мисматчей.
Для проведения реакции приготавливали микрочип по методике описанной выше. Количество олигонукпеотида иммобилизовавшегося в элемент чипа варьировали от 0.2 до 1 пмоля на элемент. Реакционная смесь (50 мкл) содержала анализируемую ДНК, 10 мкМ ddATP, 10 мкМ ddCTP, ЮмкМ ddGTP, ЮмкМ ddUTP (DuPont, все дидезоксинукпеотид трифосфаты конъюгированы с флуоресцеином), от 3 до 5 едениц Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene), от 5 до 30 едениц ThermoSequenase DNA polymerase (Amersham) в буфере для ThermoSequenase (Amersham). Концентрация ДНК варьировалась от 0.06 до 6 нМ. Реакционная смесь дегазировалась, наносилась на подогретый до 75 °C микрочип и герметично закрывалась камерой для in situ ПЦР (Perkin Elmer Co.). Избыточный расствор (примерно 25 мкл) выдавливался из камеры, микрочип помещался в ПЦР амплификатор (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer Co.). Реакцию проводили от 10 до 360 мин при постоянной температуре от 58 до 74 °C. В случае двухцепочечной ДНК проводили дополнительную денатурацию при 95 °C в течение 5 мин. После проведения реакции микрочип отмывали от несвязавшейся флуоресцентной метки в 1% Tween 20 в течение 15 мин, затем помещали в прибор для горизонтального электрофореза (Pharmacia Biotech). Отмывку электрофорезом проводили 15 мин при напряжении 10V/cm в 0.5х трис-боратном буфере.
2.6.2 Анализ ДНК методом прилегающих праймеров.
В ячейку микрочипа иммобилизовали 0.6 pmol олигонуклеотида по методике описанной выше. Для определения нуклеотида в сайте полимофности проводилось четыре отдельных реакции (А-, С-, G-, и Т-реакции). Реакционная смесь содержала анализируемую ДНК, один, флуоресцентно меченый и три обычных дидезоксинукпеотид трифосфата, от 3 до 5 едениц Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene), 30 едениц ThermoSequenase DNA polymerase (Amersham) в буфере для ThermoSequenase (Amersham). Флуоресцентно меченые дидезоксинуклеотид трифосфаты использовали в концентрации 4 цМ для ddATP-FI, 7 цМ для ddCTP-FI, 5 рМ для ddGTP-FI, и 14 цМ для ddUTP-FI. Концентрация трех дополнительных немеченых ddNTPs составляла 10 рМ.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1 Последовательное лигирование на микрочипе гель-иммобилизованных олигонуклеотидов.
Принцип последовательного лигирования представлен на рис. 1. В стандартных условиях гибридизации тетраили пентануклеотид не образуют стабильных дуплексов с ДНК. Стабильность таких дуплексов повышается при гибридизации коротких олигонуклеотидов встык с более длинным олигонуклеотидом. Однако, три пентамера расположенные встык формируют стабильный дуплекс, что ограничивает эффективность такого метода гибридизации всего двумя пентамерами. Очевидно, что дестабилизирующий эффект одиночных мисматчей для пентамеров выше чем для октамеров. Наличие мисматча в пентамере во многих случаях полностью.
Рис. 1- Схема последовательного лигирования СБН.
3'.
Т=*.
Duplex 3'.
Labeled oligo.
3'.
Washing v.
Phosphorilated oligo.
Enzyme.
Ligation.
3'.
3'.
CSH.
Elongated olig.
3'.
Labeled oligo предотвращает гибридизацию. Гибридизация пентамера встык является черезвычайно чувствительным методом определения мисматчей и используется для определения последовательности прилегающей к б'-концу иммобилизованного олигонукпеотида. Затем, с помощью Т4 ДНК лигазы 5'-фосфорилированный перфектный пентамер ковалентно присоединяется к 5'-фосфорилированному олигонуклеотиду. Таким образом, происходит специфическое удлинение иммобилизованного олигонуклеотида и создается новый сайт для гибридизации следующего пентамера и последующего раунда лигирования.
Рассмотрим принцип последовательного лигирования на примере секвенирования фрагмента псевдогена г|-глобина человека содержащего прямой тетрануклеотидный повтор длиной 20 п.о. (рис. 2. А, повтор выделен жирным шрифтом). В результате гибридизации этого фрагмента с микрочипом всех возможных октануклеотидов.
Рис. 2. Последовательность фрагмента псевдогена пглобина человека (А) — подпоследовательности, восстанавливаемые на секвенирующем микрочипе (В) — начало списка вариантов реконструкции полной последовательности (G).
A.
GTCCCCAGTСАТ СACATACATACATACАТАСАТАСААТ ТТ Т СС С.
B.
A. GTCCCCAGTCATCACATACA 2 0 нт.
B. АСАТАСАТАСА 11 нт.
C. АСАТАСААТ Т Т Т С С С 15 нт.
C.
GTCCCCAGTCATCA CATA CATA СААТТТТССС 32 нт.
GTCCCCAGTCATCA CATA CATA CATA СААТТТТССС 36 нт.
GTCCCCAGTCATCA CATA CATA CATA CATA СААТТТТССС 40 нт.
GTCCCCAGTCATCA CATA CATA CATA CATA-CATA СААТТТТССС 44 нт.
GTCCCCAGTCATCA CATA CATA CATA CATA CATA CATA СААТТТТССС 4 8 нт. секвенирующим микрочипом) последовательность можно будет реконструировать до трех субфрагментов (рис. 2. В). Последующее восстановление сиквенса по гибридизационному паттерну невозможно вследствие повторяющегося участка (субфрагмент В): паттерн гибридизации с полным чипом 8-меров совпадает для всех фрагментов ДНК перечисленных на рис. 2.С. Субфрагмент В имеет «кольцевую» структуру длиной 11 нт., поэтому реальная длина повторяющегося участка последовательности не может быть определена на октамерном микрочипе. Как видно из рис. 2. С, варианты реконструкции последовательности отличаются количеством повторов тетрануклеотида «CATA».
Рис. 3. Определение длины тетрануклеотидного повтора с помощью последовательного лигирования на микрочипеA-D — последовательность шагов гибридизации-лигирования пентамеров. Для каждого шага в верхней строке представлен анализируемый вариант последовательности. В скобках приводится структура иммобилизованного олигонуклеотида после лигирования. Прилигированные пентамеры обозначены строчными буквами. Гибридизуемый флуоресцентный пентамер обозначен звездочкой. Пентамеры р1-р4 комплиментарны участку повтора. Пентамеры р5, рб, р7 и р8 соответствуют вариантам фланкирующей области для разных длин повтора, 20, 8, 12 и 16 нт. соответственно.
A.
5 ' GTCCCCAGTCATCA САТАС АТАСА АТТТТ ССС (3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt) TAAAA* (3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt) ATGTA*.
B.
5 ' GTCCCCAGTCATCA САТАС ATACA TACAA TTTTCCC (3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt) ATGTT* (3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt) ATGTA* С.
5 ' GTCCCCAGTCATCA CATAC ATACA TACAT ACAAT TTTCCC (3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt atgta) TGTTA* (3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt atgta) TGTAT*.
D.
5 ' GTCCCCAGTCATCA CATAC ATACA TACAT ACATA CAATT TTCCC.
3'GGTCAGTAGT gtatg tatgt atgta tgtat) GTTAA* (dl0+pl+p2+p3+p4)+p5* +.
3 ' GGTCAGTAGT gtatg tatgt atgta tgtat) GTATG* (dl0+pl+p2+p3+p4)+pl* +/.
На рис. 3 приводится вариант разрешения длины такого 20-нуклеотидного повтора с использованием последовательного лигирования. Как видно из рисунка, четырех.
Структура Сигнал dl0+pl+p2)+p6* (dl0+pl+p2)+p3* dl0+pl+p2)+p7* (dl0+pl+p2)+p3* + di 0+pl+p2+p3)+p8 * di0+p 1 +p2+p3)+p4* + шагов гибридизации-лигирования достаточно для реконструкции исходной последовательности.
Следует отметить два фактора ограничивающих надежность метода последовательного лигирования — неколичественное лигирование гель-иммобилизованных олигонукпеотидов и разная эффективность флуоресценции для пентамеров. Последнее приводит к сложности в количественной интерпретации результатов гибридизации. Недостаточная эффективность ферментативной реакции уменьшает количество субстрата для каждого последующего шага лигирования и, в случае повторов, ограничивает максимальную длину разрешаемого повтора.
3.1.1 Определение длины тетрануклеотидного повтора.
Для демострации метода последовательного лигирования были проведены модельные эксперименты. Деканукпеотид с (70 (3'-ggtcagtagt-5'), фланкирующий район повтора, иммобилизовали на микрочип по З'-концу и гибридизовали с исследуемой последовательностью ДНК. Два пентанукпеотида р1 (3'-д1а1д-5') и р2 (3'-!а1д1−5'), комплиментарных району повтора, были последовательно лигированы к иммобилизованному 10-меру. Информацию о наличии этих пентануклеотидов в последовательности дает анализ результатов гибридизации с секвенирующим микрочипом. Полученный в результате двух шагов лигирования 20-мер гибридизовали встык с тремя флуоресцентно меченными пентанукпеотидами рб* {3'4аааа-5'), р7*(3'-а1дй-5') и рЗ* (3'^да-5'). Как видно из результатов гибридизации (Таблица 1), низкий гибридизационный сигнал для пентамеров рб* и р7* позволяет установить что длина участка повтора превышает 8 и 12 нт. соответственно. Положительная гибридизация с пентанукпеотидом рЗ*, комплиментарным району повтора, указывает на продолжение повторяющегося участка и необходимость дальнейшего анализа. После лигирования фосфорилированного пентамера рЗ проводили следующий раунд гибридизации встык с р4* (З'^а^б1) и р8* (3'-4дйа-5') пентамерами. Гибридизационный сигнал для р4* вдвое превышал сигнал для р8*, что позволяет предположить длину повтора более 16 нт. Вслед за лигированием фосфорилированного 5-мера р4 проводили гибридизацию с олигонуклеотидами р1* (3-gtatg-5') и р5* (3'-дйаа-5'). Как видно из.
Таблица 1- Результаты гибридизации различных пентамеров с дуплексом ДНК’иммобилизованный декануклеотид после последовательных раундов лигирования. Структура удлиненого лигированием олигонукпеотида приведена в скобках. Перфектные сигналы выделены серым цветом.
Флуоресцентный сигнал, у.е.
Гибридизуемый пентамер Структура иммобилизованного олигонукпеотида сИО) (с!10+р1) (с!10+р1+р2) (с!10+р1+р2 +рЗ) (сИ0+р1+р2. +рЗ+р4) р1* 51 37 39 р2* 16 48 20 рЗ* 7 70 21 рб* 5 р7* 24 р4* 14 49 16 р8* 23 р5* 11 60.
Таблицы 1, флоресцентные сигналы для р1* и р5* примерно совпадают, что вызвано неполным лигированием 5-мера р1. Пентануклеотид р5* является фланкирующим для повтора длиной 20 нт. Положительный гибридизационный сигнал для р5* указывает на окончанее участка повтора. В первом столбце Таблицы 1 приводятся значения фоновых сигналов для пентамеров р2*-р5* и перфектного сигнала для р1* полученные гибридизацией встык к иммобилизованному 10-меру. Светло-серым цветом обозначены остаточные перфектные сигналы для пентамеров получаемые вследствие неполного лигирования.
Таким образом, эффективность лигирования с гель-иммобилизованными олигонуклеотидами достаточна для «прочтения» тетрануклеотидного повтора длиной до 20 нт.
Использование метода последовательного лигирования позволит существенно увеличить эффективную длину иммобилизованных олигонуклеотидов.
3.2 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах.
выводы.
1. Продемонстрирована возможность проведения ферментативных реакций с гель-иммобилизованннными'олигонуклеотидами (биологическими микрочипами).
2. Предложен метод последовательного лигирования позволяющий анализировать длину и состав повторяющихся участков в последовательности ДНК.
3. Разработан метод позволяющий с высокой точностью идентифицировать точечные замены в ДНК.
4. В модельной системе исследованы особенности реакции минисеквенирования на микрочипах.
5. Предложен подход прозволяющий детекторовать низкопредставленные последовательности ДНК в сложных смесях.
6. Продемонстрировано практическое применение метода минисеквенирования на матрицах гель-иммобилизованных олигонуклеотидов для диагностики и анализа генного полиморфизма.
БЛАГОДАРНОСТИ.
Я глубоко признательна своим научным руководителям, Андрею Дарьевичу Мирзабекову и Валентину Владимировичу Шику. Благодарю Ев. Кириллова, И. Иванова, С. Паринова, Ев. Булыгину, Г. Ершова, А. С. Заседателева, Ю. Лебедь, А. Кухтина, И. Таран, С. Суржикова, В. В. Чупееву, Эд. Крейдлина, А. СетплеП, М. Вайас1паууа, Ел. Новикову и других коллег по лаборатории за помощь и сочувствие. Большое спасибо иоапу иасктап (ивАМРЮ) и Т. Молчановой за присланные образцы ДНК.
