Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов

На современном этапе уделяется большое внимание изучению закономерностей осуществления процессов жизнедеятельности различных организмов во времени, что является таким же важным свойством живой системы, как и их пространственное строение. Временная организация биологической системы определяется как совокупность упорядоченных изменений во времени, в том числе в виде биологических ритмов,* ее структур и функций, иерархически взаимодействующих и согласованных между собой и с колебаниями условий" внешней среды. Поэтому жизнедеятельность организмов,' функционирование органов, и систем, обмен веществ, энергии и информации в живых системах подчиняется закону биологической структурно-функциональной временной дискретности (Агаджанян H.A. с соавт, 1998; Комаров Ф. И. с соавт., 2000; Романов Ю. А., 2000, 2002; Halberg F., 1994, 2006).

Существование эндогенных циркадианных ритмов, наряду со стабильно^ выявляемыми ультрадианными циклическими процессами на всех уровнях организации эукариот, не вызывает сомнений! (Aschoff J., 1960; Dunlap J.C., 1999). Очевидно, что ультрадианные и инфрадианные составляющие являются неотъемлемыми в структуре биологических ритмов прокариот. Однако результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А., 1980; Загускин С. Л., 2006; Young M.W., Kay S.A., 2001; Johnson C.H., 2004; Min H. et. al., 2005; Soriano M.I. et. al., 2010).

В изучении и формировании представлений о пространственно-временной организации используют системный подход, позволяющий дать интегративную оценку ритмической структуры организма и выявить механизмы ее регуляции (Губин Г. Д., 2000; Романов Ю. А., 2002).

Оптимальный уровень функционирования любой живой системы обусловлен реализацией периодической программы, обеспечивающей необходимую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и сбалансированное соотношение ее параметров в каждый момент времени (Ашофф Ю., 1984). С этой точкизрения хронобиологиче-ский подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием (Губин Г. Д. с соавт. 2000).

К сожалению, отсутствуют сведения о суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств госпитальных изолятов микроорганизмов. Не изучен спектр чувствительности госпитальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей, их суточной динамики, что могло бы иметь значение для клиническойпрактики. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноинфраструк-туры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзометаболитовгассоциативной микробиоты. Не определена пространственно-временная' организация проявлений биологических свойств патогенов на популяционном уровне, что имеет важное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. Поставленные выше вопросы требуют своего разрешения.

Цель и задачи исследования

.

Цель исследования — выявить особенности временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и ее изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.

Для реализации этой цели были, поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать суточную динамику пролиферативной, протеазной, ката-лазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и антилизоцимной активности госпитальных изолятов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli.

2. Определить чувствительность госпитальных изолятов S. aureus и P. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики.

3. Выявить изменения хроноинфраструктуры физиологической активности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время1 суток.

4. Охарактеризовать на" популяционном уровне фазово-амплитудную стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. аеп^тозащля определения их временной организации.

Новизна исследования.

Впервые проведены многофакторные исследования и представлен комплексный анализ особенностей хроноинфраструктуры биологических свойств популяций патогенных и условно-патогенных госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и P. aeruginosa в спектре ритмов высокой и средней частоты.

Посредством впервые примененного метода косинор-анализа, адаптированного к микробиологическим исследованиям, выявлен спектральный состав ритмов в популяциях изучаемых прокариот и сформировано представление о временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорганизмов (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2 009 614 932 от 10.09.2009 г. Бюл. № 4), что отражает стратегию распределения патогенных ресурсов микробной популяции во времени.

Доказано наличие как ультрадианных гармоник, так и циркадианных составляющих ритмов биологических свойств патогенных прокариот. У госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa обнаружены в основном ультрадианные ритмы пролиферативной активности и факторов патогенно-сти. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о различных периодах физиологической активности биологических свойств патогенов в течение суток, позволили разработать способ дифференциации госпитальных изолятов S. aureus (патент РФ' на изобретение- № 2 285 258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28) и С. albicans (патент РФ на изобретение № 2 319 747 от 20.03.2008 г. Бюл. № 8) от музейных штаммов.

Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным1 препаратам на модели музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus и Р. aeruginosa. Выявлены периоды резистентностик антибиотикам у музейных (антибиотикочувствительных)* штаммов и периоды, чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.

Выявлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на суточную динамику пролиферативной активности госпитальных изолятов* и музейных штаммов S. aureus, Е. coli и Р. aeruginosa (патент РФ на изобретение № 2 285 257 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28). Изменение хроноинфраструктуры их ритмов^ - свидетельство адаптационных возможностей микроорганизмов к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных рит-мометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.

Экспериментально продемонстрировано влияние экзометаболитов мик-робов-ассоциантов на суточную динамику показателей физиологической активности патогенов, обусловливающее десинхронизацию их ритмов.

Предложенный методический подход к изучению биологических свойств. может быть использован в работе научно-исследовательских и практических лабораторий (акт внедрения № 03.1/3068 от 22.12.2010 г.), а также использован в учебно-педагогическом процессе кафедр микробиологии и биологии (акты внедрения результатов диссертационной работы № 03.1/2842 от 16.11.2010 г- № 03.1/2884 от 22.11.2010 г.).

Научно-практическая значимость.

Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации проявления биологических свойств, как на уровне популяции, так и на уровне ассоциативных взаимоотношений прокариот. Выявленные биоритмы пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и< антилизоцимной активности S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa, их лабильность под влиянием экзометаболитов ассоциативной^микробиоты.и антимикробных препаратов, последовательность и синхронность проявления в суточной" динамике расширяют теоретические представленияо биологии патогенных прокариот, их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.

Совокупность полученных данных о циркадианных и ультрадианных ритмах биологических свойств возбудителей позволяет обосновать положение о временной организации изучаемых патогенов и может быть использована не только при определении различных биологических функций микроорганизмов, но и при обосновании их адаптивных реакций. Временная организация биологических свойств возбудителей инфекций, представляющая последовательность упорядоченных во времени изменений биоритмов, взаимодействующих и согласованных между собой под воздействием биотических и абиотических факторов, отражает адаптационные возможности патогенов и служит методическим ключом к изучению механизмов их регуляции.

Практическое значение исследований определяется разработкой хроно-биологического метода изучения пролиферативной активности S. aureus, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микроорганизмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного показателя! возбудителей. Хронобиологические исследования позволили выявить различные периоды активности S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa и их чувствительность к антибиотикам в течение суток, что представляет интерес для разработки рациональных антимикробных мероприятий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Физиологические функции госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорганизмов имеют ультрадианную и циркадианную ритмичность, модифицирующуюся под действием биотических и абиотических факторов среды.

2. Амплитудно-фазоваяоценка суточных ритмов биологических функций госпитальных изолятови музейных штаммов — объективная индивидуальная «характеристика патогенов. ,.

3- Временная! организация биологических свойств возбудителей" госпитальных инфекцийпредставляющая совокупность упорядоченных изменений во времени биологических ритмоввзаимодействующихи согласованных между собой, как и изменения. их спектрального состава под воздействием ассоциативной? микробиоты иантимикробных препаратов — отражение адаптационных, возможностей патогенов и методический ключ изучения механизмов их регуляции.

4: Использование метода косинор-анализа в изучениивременнойорганизации, патогенов раскрывает стратегию распределения: патогенных, ресурсов микробной^ популяции во времени.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на V Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов" — (Оренбург, 2006) — пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва 2007) — научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного' центра РАМН «Медицинскаяакадемическаянаука — здоровью населения Урала» (Челябинск, 2008) — Всероссийской, научно-практической конференции по? ме-дицинской микологииг (Санкт-Петербург, 2008; 2011) — совместном заседании Бюро отделения профилактической медицины Российской академии медицинских наук и президиума Южно-Уральского научного центра РАМН «Профилактика профессиональных, экологически обусловленных и инфекционных заболеваний в Южно-Уральском регионе» (Челябинск, 2009) — заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009; на XVIII Международной научной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 37 научных работ, из них 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получено 4 патента на изобретения и свидетельство на программу для ЭВМ.

223 Выводы:

1. В спектральном составе ритмов госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa доказано наличие циркадианных и ультрадианных гармоник изучаемых биологических свойств, что имеет важное значение для их адаптации к меняющимся условиям внешней среды.

2. Выявленные изменения биологических ритмов основных физиологических характеристик госпитальных и музейных штаммов микроорганизмов отражают их адаптационные возможности^ путем синхронизации собственных ритмов с условиями внешней’среды.

3. Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности1 у госпитальных (антибиотикорези-стентных) изолятов в течение суток.

4. Изменения хроноинфраструктуры пролиферативной активности прокариот бактериально-грибковыми метаболитами ассоциантов — показатель межмикробных симбиотических взаимоотношений, отражающих формирование микросимбиоценозов.

5. На основании амплитудно-фазовой характеристики выявлена стабильность проявления биологических ритмов вирулентных свойств (протеаза, ка-талаза, гемолитическая активность) госпитальных изолятов под влиянием эк-зометаболитов микробов-ассоциантов, тогда как у музейных штаммов патогенные и персистентные свойства проявляли лабильность в течение суток.

6. Трансформация ультрадианного в циркадианный ритм антилизоцимной активности у музейных штаммов под влиянием экзометаболитов госпитальных изолятов можно рассматривать как результат симбионтных отношений патогенов в микросимбиоценозе.

7. Использование метода косинор-анализа в изучении хроноинфраструктуры биологических свойств патогенов позволило сформировать представление о временной организации возбудителей (популяций) госпитальных инфекций. Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил для грамнегатив-ной микробиоты синхронизацию во времени и пространстве пролифератив-ной активности с гемолитической активностью, а у S. aureus (представителя грампозитивной микробиоты) — с плазмокоагулазной активностью. 8. Отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств у грамнегативных патогенов между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне, что отражает перестройку метаболических процессов микробной популяции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В последние годы интенсивно развивается концепция о временной организации биологических систем, которая стала по существу центральной проблемой в хронобиологии. Временная организация биологической системы образуется совокупностью всех ее ритмических процессов, взаимодействующих и согласованных во времени между собой и с изменяющимися условиями внешней среды. Жизнедеятельность организмов, функционирование органов и систем, обмен веществ, энергии и информации в живых системах подчиняется-закону биологической структурно-функциональной временной дискретности (Агаджанян H.A. с соавт., 1998; Комаров Ф. И. с соавт., 2000; Романов Ю. А., 2000, 2002; Halberg F., 1994, 2006).

Оптимальный, уровень функционирования любой живой системы обусловлен реализацией периодической программы, обеспечивающей необходимую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и оптимальное соотношение ее параметров в каждый момент времени (Aschoff J., 1984). Для изучения и формирования представлений о пространственно-временной организации необходимо использовать системный подход, позволяющий дать интегративную оценку ритмической структуры организма и выявить механизмы ее регуляции. С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием (Губин Г. Д. с соавт., 2000; Романов Ю. А., 2002).

Биологические ритмы различных функций хорошо изучены на всех уровнях организации эукариот. Однако результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, порой противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А., 1980; Загускин С. Л., 2006; Young M.W., Kay S.A., 2001; Johnson C.H., 2004; Min H. et al, 2005; Soriano M.I. et al., 2010).

К сожалению, отсутствуют сведения по суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств прокариот, включая госпитальные и музейные штаммы. Не изучен спектр чувствительности госпитальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики. В то «же время это могло бы иметь значение для разработки новых подходов к проведению рациональных антимикробных мероприятий. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноинфраструктуры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзометаболитов’ассоциативной микробиоты. Не определена пространственно-временная организация проявлений биологических свойств патогенов на популяционном* уровне, что имеет немаловажное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. В связи с поставленными выше вопросами целью нашего^ исследования явилось изучение' особенностей' временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и её изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов в течение суток.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи: изучена суточная динамика пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и антилизоцим-ной активности госпитальных изолятов S. aureus, Р. aeruginosa, Е. coliисследована чувствительность госпитальных изолятов S. aureus, Р. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамикиопределены изменения хроноинфраструктуры физиологической активности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, Е. coli, Р: aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время сутокохарактеризована на популяционном уровне фазово-амплитудная стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa для определения их пространственно-временной организации.

Биоритмы пролиферативной активности патогенов изучали на модели госпитальных изолятов (клинические культуры) и музейных штаммов (коллекция АТСС) по разработанной нами методике проведения, биоритмологического исследования и обработке данных, учитывающих особенности работыс микроорганизмами (патент РФ' на изобретение «Способ диагностики госпитальных штаммов» № 2 285 258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28). Для графического представления амплитудно-фазовых, характеристик выявленных стабильных ритмов использован косинор-анализ, служащий базовымметодом для выявления циклических процессов в биологических системах и их моделирования. С помощью прикладной-графической программы «Групповой ко-синор-анализ», адаптированной к микробиологическим исследованиям, по полученным параметрам построены* доверительные эллипсы, отражающие амплитудно-фазовую характеристику выявленных ритмов (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2 009 614 932 от 10 109.2009 г. Бюл. № 4).

В-серии проведенных экспериментов была выявлена суточная динамика пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa. Ритмометрический анализ временных параметров пролиферативной активности S. aureus показал, что для. госпитальных изолятов S. aureus 2888, 2891 и 2305 характерна ультрадианная ритмичность, для. музейных штаммов S. aureus 25 923 и 209-Р ведущим являлся циркадиан-ный ритм (околосуточный). Отличия были выявлены также по величине амплитуды — показателя, коррелирующего с вкладом ритма, отражающими стабильность и мощность ритма. Выявлены различия между музейными и госпитальными штаммами и по акрофазам ритмов, у госпитальных изолятов S. aureus максимальные значения пролиферативной активности наблюдались в разное время суток, у музейных — только в вечернее и ночное время. Достоверные отличия ритмометрических показателей (вклад ритма, амплитуда и акрофаза) госпитальных изолятов от показателей музейных штаммов являются, вероятно, типовым признаком в хроноинфраструктуре пролиферативной активности S. aureus. Результаты исследований позволили, разработать «Способ диагностики1' госпитальных штаммов», дифференцирующийгоспитальные изоляты S. aureus от музейных культур по отсутствию совпаденияхроноинфраструктуры их биоритмов с биоритмамш последних (патент РФ №'2 285 258- 2006): Метод" дает возможность оценить различные: периоды? физиологической активности возбудителей^ проведении сравнительного анализам госпитальных изолятов с эталонными культурами.

Анализ временных параметровпролиферативной активности Е. coli выявил у госпитальных изолятов ведущий ультрадианныи ритмгс активностью в ночное время, а у музейных штаммов — циркадианный с акрофазой в вечернее время.

Совершенно противоположнаяпролиферативная активность в течение суток регистрировалась у P. aeruginosa: У госпитальных изолятов изучаемый показатель был максимально активен, и в утренние, и дневные часы^ тогда как у музейных штаммов- - только ночыо. В спектральномсоставе биоритмов пролиферативной активности у госпитальных изолятов музейных штаммов ведущим ритмом был ультрадианный.

Интегральная оценка хроноинфраструктуры пролиферативной активностигоспитальных изолятов и музейных: штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa позволила сделать ряд обобщенийУ госпитальныхс микроорганизмов ведущимшвлялся ультрадианныйритм, что имеет большое значение в плане адаптации госпитальных изолятов Saureus, Е. coli, Р. aeruginosa к меняющимся условиям биотической и абиотической среды. Этот факт согласуется с выводами исследований Lloyd A., Rossi Е. (1992), Min Н., Guo Н., Xiong J. (2005). К характерным свойствам таких ритмов относятся: значительная нерегулярность (вариабельность периодов), детерминированность, устойчивость к внешним воздействиям и способность к адаптивному ответу на периодические раздражители (Сергеева Э.П. с соавт., 1987; Нечаева Н. В., Харазова А. Д., 1989; Kippert F., Lloyd D., 1987; Lloyd A., Lloyd D., 1993). Доказанное нами наличие циркадианных ритмов в спектральном составе прокариот одновременно с ультрадианными гармониками усиливало адаптивные возможности популяции. Не исключено, что появление околосуточных ритмов обусловлено’влиянием макроорганизма, как. основнойсреды обитания для S. aureus, Е. coliР. aeruginosa.

Из вышесказанного следует, что ультрадианные и циркадианные составляющие являются неотъемлемыми в структуре спектра1 микробных популяцию Вот почему изучение изменений соотношения ультраи циркадианных. компонентов в спектральном составе, которое при различных воздействиях окружающей’среды не является стационарным, дает возможность отличать патологические нарушения хроноинфраструктуры от приспособительных изменений (Губин Г. Д. с соавт., 1994, 2000; Halberg F. et alt, 1984).

Кроме того, хронобиологический метод позволил выявить практически полную идентичность ритмометрических показателейизучаемых свойств госпитальных изолятов, выделенных из одногобиотопа и подверженных одинаковым воздействиям со стороны окружающей среды (макроорганизма, ассоциативной микробиоты, абиотических факторов и др.).

Для подтверждения’вышесказанного было изучено влияние микробных экзометаболитов на ритмические процессы физиологической активности биологических свойств возбудителей в бактериально-грибковых ассоциациях. Экспериментально доказано, что на пролиферативную активность госпитального изолята S. aureus 2888 оказывали значительное влияние экзометабо-литы грамнегативной микробиоты (Р. aeruginosa и Е. coli), которые достоверно снижали среднесуточную активность пролиферации (W=30,0- р < 0,05), амплитуду, но не изменяли время проявления этой активности в течение суток (акрофазу). Вклад ультрадианного 12-часового ритма уменьшился в 3,9 раза, но увеличилась доля высокочастотных ультрадианных 8-часовых гармоник, что, по-видимому, свидетельствовало об адаптивном напряжении патогена.

На пролиферативную активность госпитального изолята Е. coli- 2364 наиболее активное воздействие оказывали экзометаболиты S. aureus и Р. aeruginosa. В результате произошло нивелирование циркадианного ритма: и появление дополнительной гармоники: 8-часового ультрадианного ритма (вклады ритма-34,3%, 29,9%), смещалась акрофаза, показателяснижалась амплитуда. Мезор достоверно не изменялся по сравнению с контролем (W=6,0- р>0,05). Экзометаболиты С. albicans не изменялиакрофазу, но> достоверно снижали амплитуду (р < 0,05).

Экзометаболиты5 Saureus, Е. coli, С. albicans стимулировали появление циркадианного? ритма пролиферативной активности Р. aeruginosa 2364* (р<0,05), акрофаза изучаемого показателя смещалась с 01.38 часа на 11.00 часов, мезор и амплитуда различий не дали (W— - 10,0- р > 0,05).

Таким образом, результаты исследованияпозволили выявить, что у S. aureus, Е. coliР. aeruginosa сохранялись ультрадианныеритмы пролифера-тивнойактивности подвоздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя. Появление дополнительных гармоник способствовало усилению адаптивных возможностей популяции.

Выявленный эффект изменения хроноинфраструктуры пролиферативной активностипрокариот бактериально-грибковымиэкзометаболитами отражает напряженность биологической системы, которая? неизбежная процессе формирования межмикробных взаимоотношений: Смещение времени проявления максимальной пролиферативной активности, по всей видимости, будет приводить к изменению ритмометрических параметров других биологических свойств.

Учитывая, что при взаимодействии микроорганизмов с различными стрессовыми факторами возможны изменения численности популяции, стрессоустойчивости, факторов патогенности (Красильников А.П., 1994; Эль-Регистан Г. И., 2001; Ильинская О. Н., 2002; Бухарин О. В. с соавт., 2002; Иванова Е. Б., 2004), мы предприняли попытку изучить влияние антимикробных препаратовна биоритмы пролиферативной активности госпитальных изоля-тов и музейных штаммов S. aureus и P. aeruginosa.

Под воздействием суббактериостатических концентрацийгентамицина у музейного штаммаS. aureus-(гентамицинчувствительный)-существенноснижались-все ритмометрические параметры пролиферативной активностит.е. наблюдалась десинхронизация ритма. Изменения показателей хроноинфра-структуры биоритмов музейного штамма S. aureus, вероятно, отражают состояние сильного стресса, десинхроноза, который может привести к необратимым изменениям и гибели микроорганизмов;

У госпитального изолята-S. aureus (гентамицинрезистентного) достоверных изменений при таком-же режиме воздействия гентамицином не выявлено (р>0,05). Госпитальный изолят сохранял свой суточный ритм пролиферативной активности после обработки антибиотиком в отличие от музейного штамма. Выявленные различия были положены, в основу дифференциации госпитальных изолятов S. aureus от музейных штаммов S. aureus (Патент РФ на изобретение № 2 285 257 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).

Под действием суббактериостатических концентраций ванкомицина на пролиферативную активность S. aureus (все штаммы ванкомицинчувстви-тельные) было выявлено стимулирующее воздействие препарата на изучаемый показатель и изменение всех ритмометрических показателей, как у музейного штамма, так и у госпитального изолята (W = -34- -30 соответственно, р<0,05). Полученные данные согласуются с результатами работы Н.Е. Сузи-ной с соавт. (2001), обнаруживших ростстимулирующий эффект низких концентраций химических препаратов. Полученные результаты свидетельствовали о существенном воздействии на антибиотикочувствительные штаммы патогенов суббактериостатических концентраций антибиотиков, что может быть рассмотрено как один из подходов к рациональной антимикробной терапии.

На следующем этапе работы была изучена суточная динамика функциональных показателей, отражающих патогенные свойства S. aureus, Р. aeruginosa и Е. coli (протеазная, каталазная, гемолитическая активность) И' влияние на нее экзометаболитов ассоциативной гмикробиоты.

Результаты хронобиологического анализа1 патогенных характеристик госпитального изолята S. aureus показали, что циркадианный ритм протеаз-ной активности проявлялся в вечерне-ночной период и был-синхронизирован с пролиферативной активностью возбудителя. Косинор-анализ выявил фазовую стабильность протеазы под воздействием экзометаболитов, однако ак-рофазы каталазной и гемолитической активности изменялись под влиянием ¦ экзометаболитов ассоциативной микробиоты. В’этой связи следует отметить стимулирующую роль экзометаболитов Р. aeruginosa, которые в-3 раза увеличивали гемолитическую активность S. aureus (W = - 36,0- р<0,05), характеризуя лабильность проявления. этих патогенных свойств в течение суток.

Следует также отметить чувствительность хронобиологического метода, позволившего выявить, признак гемолитической активности госпитального изолята S. aureus, типированного традиционным бактериологическим методом как негемолитический вариант. Это открывает перспективы * для выявления нестабильно экспрессируемых биологических свойств патогенов.

Анализ амплитудно-фазовой характеристики патогенных свойств госпитального изолята Е. coli 2364 показал, что для этого возбудителя каталазная активность проявлялась по дневному типу и характеризовалась фазовой стабильностью под влиянием экзометаболитов. Дестабилизацию акрофаз протеазной и гемолитической активности вызывали экзометаболиты S. aureus, Р. aeruginosa и С. albicans.

У госпитального изолята P. aeruginosa 2364 активность протеазы проявлялась в циркадианном ритме, как и у S. aureus и Е. coli. Акрофаза (22.48 часа) не изменялась под воздействием метаболитов. Выявлено сходство ритмов активности протеазы P. aeruginosa и Е. coli, выделенных из одного’биотопа. Эти возбудители проявляли протеазную активность в едином циркадианном ритме. По всей видимости, согласованность ритмов по этим* позициям в условиях пребывания в одном биотопе для них биологически обоснована: Гемолитическая активность P. aeruginosa проявлялась в циркадианном ритме, отличаясь стабильностью под влиянием экзометаболитов «(акрофазу регистрировали1 в 01.20 час). Под влиянием экзометаболитов С. albicans и Е. coli активность, гемолиза^ тест-культуры-усиливалась. Каталазная активность Р: aeruginosa также проявлялась в циркадианном ритме, с акрофазой в 07.00 часов, но фазовая характеристика не отличалась стабильностью — метаболиты Е. coli и С. albicans смещали акрофазу на ночной период суток.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что-при интенсивном' функционировании одних биологических свойств бактерийактивность других признаков снижается: в одной-и той же клетке адаптивная интенсификация синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ин-гибированием продукции других. Вероятно, это связаносо способностью экономии, материальных и энергетических ресурсов и максимальной концентрацией их на главном участке развертывания приспособительной реакции в определенный временной период (Лукомская К.А., 1987; Комаров Ф: И., 2000).

Для выявления согласованности различных функций.S. aureus, P. aeruginosa и Е. coli, обеспечивающих их приспособление к различным условиям обитания, мы провели корреляционный анализ между пролиферативной активностью и патогенными характеристиками. У госпитального изолята S. aureus выявлена положительная корреляция пролиферативной активности с ка-талазной активностью (г = 0,57- р<0,05). С протеазной и гемолитической активностью достоверной корреляции не отмечалось (г = - 0,07- р>0,05 и г = - 0−3- р>0,05 соответственно), но в период минимальной пролиферативной активности выявлено увеличение продукции протеазы и гемолизинов. У госпитального изолята Е. coli выявлена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеазной и каталазной активностью? (г = - 0−4- р<0,05 и г = - 0,6- р<0⁰⁵ соответственно) и сильная прямая связь с гемолитической активностью (г = 0,7- р<0,05).У госпитального изолята установлена корреляция только с гемолитической активностью (г.— - 0,4- р>0,05).

Исследование суточной" динамики, чувствительности S. aureus к антибиотикам с применениемхроыобиологического метода позволило выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммови периоды чувствительности у госпитальных (антибиоти-корезистентных) изолятов в течение суток, что может иметь значение для дальнейших исследований в направлении рационального' применения" антимикробных препаратов;

Биологические ритмы персистентных свойств патогенов (S. aureus, Е. coli, Рaeruginosa) и их модификация под влиянием экзометаболитов ассоциативной? микробиоты были изучены на примере антилизоцимной активности- (АЛА)/ патогенови их способности формировать биопленки (БПО). Перси-стентные свойства микроорганизмов изучались под влиянием экзометаболи-тов музейных штаммови госпитальных изолятов., Достоверные изменения АЛА и БПО были зарегистрированы только иод воздействием экзометаболи-тов госпитальных изолятов.

Способность к БПО S. aureus регистрировалась в циркадианном ритме, Е. coli и Р. aeruginosa — в-ультрадианном. У S. aureus ритм БПО вечернего типа, у Е. coli — ночного и дневного типа, у Р. aeruginosa — утреннего, дневного и вечернего типов. Под воздействием экзометаболитовассоциативной микробиоты положение акрофаз не изменялось. Корреляционный анализ позволил выявить только у Р. aeruginosa наличие отрицательной корреляции между пролиферативной активностью и способностью образовывать биопленки (г = -0,67- р<0,05).

Изучение АЛА показало наличие в спектральном составе всех госпитальных изолятов циркадианного ритма с акрофазами в утреннее и-дневное время. У музейных штаммов наблюдалась гетерогенность ритмов х преобладанием в спектре ультрадианных гармоник и регистрация акрофаз в различные периоды суток. При-изучении влияния экзометаболитов ассоциативной микробиоты. на АЛА возбудителей (на модели музейных штаммов) отмечено,-что у S. aureus появлялся циркадианнышритм АЛА с нестабильной акрофа-зой, но амплитуда не изменялась.

Под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты ультрадиан-ные ритмы АЛА Е. coli менялись на циркадианные, акрофазы которых регистрировались в вечернее и ночное время, амплитуда увеличивалась в 2−3 раза, а мезор снижался только при воздействии экзометаболитов, С. albicans (W = 26,0- р<0,05).

Для Р. aeruginosa была характерна гетерогенность ритмов, однако под влиянием-экзометаболитов всех исследуемых штаммов ассоциативных микроорганизмов ведущим оставался циркадианный ритм, а акрофаза, амплитуда" и мезор оставались без изменения (р>0,05).

Таким, образом, влияние экзометаболитов способствовало появлению у музейных штаммов 1 возбудителей 24-часового ритма АЛА, что было свойственно только госпитальным изолятам. По всей видимости, это можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифической резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Мати-яш И.Н., 1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В., 1999). Из всех изучаемых микроорганизмов только для Е. coli были характерны изменения ритмометрических параметров АЛА, свидетельствующие о напряжении механизмов адаптации и поиске биосистемой адекватной реакции на изменение условий функционирования.

Для выявления функциональной согласованности пролиферативной и антилизоцимной активности проведен корреляционный анализ, показавший обратную корреляцию у музейного штамма Е. coli (г = - 0,47- р<0,05) и прямую связь этих показателей у госпитального изолята Р. aeruginosa (г = 0,44- р<0,05). У остальных возбудителей корреляционная. зависимость не выявлена. Обнаруженные изменения биологических ритмов! пролиферативной активности, патогенных и персистентных свойств (протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазнойбиопленкообразующей, антилизоцимной активности), чувствительности к антибиотикам госпитальных изолятов под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов, отражают адаптационные возможности патогенов, биологические ритмы которых подстраиваются к новой среде обитания в целях максимальной возможности микроорганизма адаптироваться к окружающей среде путемсинхронизации его собственных ритмов с внешними циклами (Агад-жанян H.A., 1998; Губин Г. Д., 1989; Смирнов В. М., 2002; Маркина В. В., Романов Ю. А., 2005).

Состояние временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa позволило представить в определенной последовательности амплитудно-фазовую стабильность суточных ритмов биологических свойств возбудителей при применении адаптированной к микробиологическимисследованиям прикладной графической программы «Групповой косинор-анализ» (свидетельство РФ, 2009), где местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства — амплитуд и фаз) отражают временную область проявления ритма изучаемых биологических свойств.

Результаты косинор-анализа показали, что у музейного штамма S. aureus в период минимальной пролиферативной активности (06.00 — 13.00 часов) продукция ферментов (протеазы, каталазы, плазмокоагулазы) была максимально выражена. Небольшая площадь их эллипсов отражала значительное постоянство основных параметров ритма. С увеличением пролиферативной активности (18.30 — 21.30 часов) максимальных значений достигала продукция факторов адгезии и вирулентности — биопленкообразования и гемолитической активности. АЛА проявлялась по ночному типу (доверительный интервал от 23.00 до 05.00 часов) с акрофазой около 02.00 часов.

У госпитального изолята S. aureus регистрировали ультрадианные ритмы изучаемых показателей в отличие от циркадианных ритмов музейных штаммов. Учитывая, что у госпитального изолята S. aureus активность физиологических функций* проявлялась с 12-часовым периодом, можно отметить, что пролиферативная, каталазная, протеазная и плазмокоагулазная активности относились к ночному и дневному типам активности. АЛА и гемолитическая активность относились к утреннему и вечернему типам ритмичности.

Временная^ организация биологических свойств грамнегативной микро-биоты.отличалась от таковой S. aureus. У музейного штамма Е. coli пролиферативная, гемолитическая и каталазная активности синхронизированы между собой и для них характерен дневной тип ритмичности. Их акрофазы отмечались, соответственно, в 14.30, 15.00 и 16.00 часов. Небольшая площадь эллипсов и относительно узкие доверительные интервалы их акрофаз указывали на высокую стабильность параметров их циркадианных ритмов. Акрофаза АЛА смещалась на вечерние часы с максимумом около 20.00 часов. Акрофаза показателя протеазной активности имела утренний тип ритмичности с максимумом около 08.00 часов, доверительным интервалом в пределах ± 90 минут и находилась в полной противофазе к АЛА и БПО, у которых прослеживалась четкая синхронизация проявления активности во времени.

У госпитального изолята Е. coli показатели пролиферативной и гемолитической активности сохраняли те же фазовые характеристики, которые присущи музейному штамму, но стабильность их ритмов несколько слабее, о чем можно судить по большим площадям их доверительных эллипсов. Акрофазы катал аз ной и протеазной активности по сравнению с музейным штаммом смещались на вечерние часы, претерпевая фазовую инверсию по отношению друг к другу. Акрофаза АЛА госпитального изолята, напротив, сдвигалась.в. дневную область — 10.00 часов, тогда как у музейного штамма пик активности регистрировался в вечерние часы. При этом в обоих случаях ритмы были достаточно стабильны.

У музейного штамма P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой и имели утренний тип ритмичности, их акрофазы приурочены-к 09.00 и 07.00 часам. Показатели АЛА, биопленкообразующей, каталазной и протеазной активности также были синхронизированы между собой, но имели вечерне-ночной тип активности. Их акрофазы отмечались в 20.00 — 23.00 часа.

У госпитального изолята P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой, как и у музейного штамма, но акрофазы регистрировались в ночное время, (02.00 часа). Показатели протеазной активности сохраняли те же фазовые характеристики, что и у музейного штамма. Существенные различия при сравнительном анализе амплитудно-фазовых характеристик госпитального изолята и музейного штамма касались местоположения акрофаз показателей АЛА и каталазной активности в связи со сменой утреннего типа ритмичности на вечерний.

Анализ амплитудно-фазовой стабильности биологических ритмов возбудителей выявил следующие особенности. У музейного штамма S. aureus определена синхронизация во времени (17.30 -20.00 часов) основного биологического признака (пролиферативная активность) с фактором адгезии (БПО) и гемолитической активностью. В период минимальной пролиферативной активности музейных штаммов S. aureus наблюдалась продукция факторов вирулентности (плазмокоагулазы, протеазы, каталазы).

У госпитального изолята S. aureus обнаружена иная временная зависимость, которая, возможно, сформировалась под воздействием экзометаболи-тов микробов-ассоциантов и макроорганизма в целом. У госпитального изолята S. aureus дневной тип проявления максимальной пролиферативной активности, который синхронизирован с каталазной, протеазной и плазмокоа-гулазной активностью.

Для всех изучаемых вариантов грамнегативной микробиоты характерна синхронизацияво времени и пространстве пролиферативной активности с одними из, основных факторов" патогенности — гемолитической активностью. Для них также отмечены значительные' временные интервалы отсутствия максимальной" активности биологических свойств между временем проявления факторов агрессии. и персистенции в суточном диапазоне.

Анализ амплитудно-фазовых взаимоотношений между изучаемыми показателями позволил выявить определенную последовательность проявления: биологических свойств возбудителей и сформировать представление о пространственно-временной организации* госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa.

Таким образом, стабильность акрофазы предопределяет устойчивость ритмического колебания во времени, ориентирует на разработку эффективных способов микробиологической диагностики и антимикробных мероприятий.

Оценивая полученный фактический материал в целом, следует выделить следующие моменты:

— Доказано наличие как циркадианных, так и ультрадианных ритмов-физиологической активности биологических свойств у гетерогенных популяций патогенных и условно-патогенных прокариот.

— Выявлено модулирующее влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов на ритмические процессы биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот.

— Исследование ритмичности физиологической активности биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот с применением коси-нор-анализа позволило составить пространственно-временную характеристику их последовательности и согласованности.