Генная и серологическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота

Актуальность исследования.

Бруцеллез сельскохозяйственных животных широко распространен на территории нашей страны. География бруцеллеза в Российской Федерации обширна: Крайний Север, Сибирь, Дальний Восток, Ставрополье, Северный Кавказ, Нечерноземная зона, Поволжье [Урбан В.П., 1980].

В настоящее время наметилась тенденция к снижению уровня заболеваемости сельскохозяйственных животных бруцеллезом. Если в 1998 году в России неблагополучными по этой инфекции было 169 населенных пунктов (около 1,2 млн. голов скота), то к началу 2001 года зарегистрировано 72 населенных пункта (около 500 тыс. голов скота). За 2000 год удельный вес заболеваемости бруцеллезом среди крупного рогатого скота составил 4,49%, инфекционным эпидидимитом мелкого рогатого скота (возбудитель В. ovis) — 6,19% [Яременко Н.А., 2002]. Главную роль в улучшении эпизоотической ситуации сыграло применение методов специфической профилактики в системе мер по борьбе с бруцеллезом и, в частности, иммунизация поголовья рогатого скота вакцинными штаммами В. abortus 19, В. melitensis Rev-1, а в последующем В. abortus 82.

Несмотря на выше изложенное, на сегодняшний день 18 территорий России остаются неблагополучными по бруцеллезу крупного рогатого скота и 6 регионов по бруцеллезу мелкого рогатого скота.

Потенциально опасным с эпизоотической точки зрения может быть импорт племенного скота из ряда стран дальнего и ближнего зарубежья: Голландии, Венгрии, Армении и Прибалтийских республик и мелкого рогатого скота из Польши, США, Австралии.

Не исключена угроза распространения бруцеллеза животных с территории сопредельных государств Среднеазиатского региона и, прежде всего, Казахстана [Косилов И.А. с соавт., 1999].

Ситуация усугубляется тем, что бруцеллез наносит огромный экономический ущерб животноводству, который складывается из недополучения животноводческой продукции (утилизация поврежденных органов и тканей) и снижения ее качества, затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий по ликвидации очага инфекции, яловости и абортов маточного поголовья, нарушения племенной работы из-за выбраковки ценных племенных животных.

Одним из наиболее надежных способов предупреждения энзоотий и ликвидации очагов бруцеллеза является эффективная диагностика инфекции, основанная на лабораторных методах исследования [Антонов Б.И., 1986; Наставления по диагностике бруцеллеза животных, 2000].

Поэтому актуальной задачей является разработка и внедрение усовершенствованных методов диагностики бруцеллеза, а также выбор оптимального комплекса диагностических тестов. Только в этом случае можно с большей вероятностью гарантировать выявление не только манифестных, но и латентных, стертых случаев проявления бруцеллеза, вызванных диссоциированными SR-, R-, L-формами бруцелл.

Решение подобных задач возможно благодаря использованию в ветеринарной практике новых диагностических подходов, в частности, основанного на достижениях современной молекулярной биологии и генной инженерии метода — полимеразной цепной реакции.

Этот генетический способ выявления ДНК микроорганизмов отличают — специфичность (до 100%), высокая чувствительность — lxl 02−1×103 м.к./мл, экспрессность анализа (6−8 часов), биологическая безопасность для персонала, возможность выявления диссоциированных и L-форм бруцелл без специальной подготовки.

Вместе с тем важной проблемой для практического использования ПЦР является разработка оптимальной схемы анализа, стандартизация условий исследования, что позволяет снизить вероятность получения ложноотрицательных ответов и правильно интерпретировать полученные результаты. Для достижения максимальной эффективности ПЦР диагностики необходимо использование для анализа биологических образцов с наиболее высокой вероятностью содержания бруцелл, применение универсальных методов пробоподготовки. Важным является определение контингента животных, подлежащих исследованию в ПЦР, оценка диагностической точности применения полимеразной цепной реакции в комплексе с методами иммуноанализа, специфичности и чувствительности ПЦР-тест-систем различных производителей. Только в этом случае возможно максимальное использование высокого потенциала метода для эффективного выявления бруцелл, определение места ПЦР-анализа в системе лабораторной диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных.

Цель исследования — изучение эффективности генной и серологической диагностики бруцеллеза, разработка оптимальной схемы ПЦР-анализа при обнаружении бруцелл у сельскохозяйственных животных.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ эффективности традиционных серологических методов (РА, РСК) и ПЦР, а также оценить перспективы их комплексного применения для лабораторной диагностики бруцеллеза.

2. Оценить диагностическую точность применения тест-системы для выявления Brucella spp. методом ПЦР («Ген-Бру») производства РосНИПЧИ «Микроб» при исследовании материала полученного от животных с верифицированным диагнозом — бруцеллез.

3. Определить возможность применения родоспецифичных праймеров Bru 31−32 для анализа материала от крупного рогатого скота иммунизированного живой вакциной из штамма Бруцелла абортус № 82 в разные сроки после вакцинации.

4. Определить клинический материал для ПЦР-анализа, который обеспечивает надежное и стабильное обнаружение ДНК у сельскохозяйственных животных, больных бруцеллезом.

5. Разработать оптимальную схему выделения ДНК Brucella spp из различного биологического материала от животных при исследовании методом ПЦР.

Научная новизна. Впервые показана высокая диагностическая точность, чувствительность и специфичность тест-системы «Ген-Бру» при лабораторной диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Получены новые данные о сравнительной эффективности ПЦР и серологических методов (РА, РСК) в лабораторной диагностике бруцеллеза. Показано, что ПЦР превосходит по чувствительности РА и РСК в 2−2,4 раза. Выявлено, что наибольшая чувствительность ПЦР-анализа достигается при использовании в качестве диагностического материала образцов крови животных. Установлена возможность детекции ДНК вакцинного штамма В. abortus № 82 в поздние сроки после иммунизации, что свидетельствует о его длительной приживаемости в организме вакцинированных животных. Показано, что частота выявления ДНК бруцелл в крови коррелирует с интенсивностью инфекционного процесса.

Практическая ценность диссертации.

В работе детально рассмотрены важные вопросы, касающиеся схемы ПЦР-анализа на бруцеллез у сельскохозяйственных животных. Рекомендовано использование в качестве материала для исследования кровь, применение модифицированной схемы подготовки материала для ПЦР, при анализе проб молока. Установлена возможность сочетанного применения нескольких ПЦР-тест-систем для повышения верификации анализа.

По результатам исследований составлены «Методические рекомендации по применению ПНР-анализа для лабораторной диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных», (утверждены УМС ИВМиБ протокол № 16 от 6.09.02).

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы СГАУ им. Н. И. Вавилова при чтении курса дисциплины «Ветеринарная микробиология» для студентов специальности «Ветеринария» .

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и доложены на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), III общественных слушаниях «Эпидемиология инфекционных заболеваний, окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2001), ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава СГАУ им. Н. И. Вавилова (Саратов, 1999, 2002).

Материалы работы вошли в отчеты о научно-исследовательской работе «Разработка и внедрение эффективных методов, специфических средств и интегрированной системы мероприятий по борьбе с туберкулезом и бруцеллезом в Саратовской области».

Диссертация обсуждена и одобрена на межкафедральной научной конференции СГАУ им. Н. И. Вавилова (протокол № 20 от 21.06.02).

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 3 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка.

Выводы.

1. Диагностическая чувствительность ПЦР-анализа на бруцеллез животных в 2,0−2,4 раза превышает чувствительность РА и РСК.

2. ПЦР-тест-система «Ген-Бру» может быть применена для диагностики бруцеллеза у неиммунизированных противобруцеллезными вакцинами сельскохозяйственных животных, при этом чувствительность анализа составляет 80−98% и специфичность — 100%.

3. Наибольшая вероятность обнаружения ДНК бруцелл методом ПЦР, при инфекционном процессе, возможна при исследовании крови больных животных. У иммунизированного поголовья вероятность обнаружения ДНК бруцелл в крови и в сыворотке крови является одинаковой.

4. С помощью ПЦР возможно выявление ДНК вакцинного штамма № 82 спустя 2 года после реиммунизации, что может свидетельствовать о его длительной приживаемости в организме привитых животных.

5. Тест-система «Ген-Бру» может быть применена для обнаружения ДНК бруцелл в молоке сельскохозяйственных животных, как метод оценки санитарного благополучия пищевых продуктов животного происхождения.

6. Показана высокая эффективность модифицированного метода выделения и очистки специфической ДНК с применением ацетона из молока крупного рогатого скота больного бруцеллезом., ф X.

Заключение

.

С момента открытия бруцелл Брюсом (1887) и Бангом (1897) произведено колоссальное количество исследований в разных странах и изучен широкий перечень вопросов, относящихся к бруцеллезу животных. Однако и в наши дни эта хроническая инфекционная болезнь представляет большую проблему глобального масштаба и для органов здравоохранения и для ветеринарных специалистов.

Первые сведения о бруцеллезе сельскохозяйственных животных в России относятся к 1860 году, когда в Московской губернии отмечались массовые случаи «повального выкидыша» у коров. Проведенный ретроспективный анализ имеющихся эпизоотологических данных показал, что в появлении и распространении бруцеллеза в нашей стране основную роль сыграл импорт племенного скота из стран Западной ЕвропыГолландии, Дании и Германии [Урбан В.П. с соавт., 1980]. Каких-либо специальных мер борьбы с бруцеллезом в то время не существовало, единственный способ диагностики — регистрация факта аборта. Примечательно, что самих животных после выкидыша считали выздоровевшими.

В настоящее время бруцеллез сельскохозяйственных животных на территории РФ распространен почти повсеместно. Очаги бруцеллеза регистрируются на Крайнем Севере, в зоне промышленного оленеводства [Калиновский А.И. с соавт., 1997], в Нечерноземье, Сибире, Дальнем Востоке, Поволжье и юге России [Димов С.К., 1980; Желудков М. М. с соавт., 1997]. Спектр возбудителей энзоотий бруцеллеза, протекающих в данных регионах, представлен В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. ovis и в отдельных случаях В. canis.

Основу борьбы с бруцеллезом составляют плановые предупредительно-профилактические мероприятия. Их важными составляющими являются лабораторные методы диагностики инфекции и контроля эпизоотического статуса поголовья. Поэтому успех в ликвидации очага бруцеллеза во многом определяется качеством применяемых диагностических тестов, главными критериями которых являются специфичность, высокая чувствительность и эффективность. Строгое соблюдение этих условий может гарантировать выявление всех инфицированных животных. К сожалению, в арсенале ветеринарных лабораторий на данный момент нет таких методов, которые бы в полной мере сочетали в себе приведенные выше требования. Это объясняется многими факторами и, прежде всего, принципиальными особенностями применяемых диагностических подходов, ограничивающими их возможности, а также чрезвычайной «пластичностью» возбудителя (наличие S-, R-, SR-, L-, М-форм), медленным ростом на питательных средах, перекрестными серологическими реакциями с большим количеством микроорганизмов [Вершилова П.А., 1972; Триленко П. А., 1980; Соколова Е. Е., 1986].

В последнее время наблюдается интенсивное развитие ДНК-технологий, объективными причинами которого стали революционные открытия в области молекулярной биологии и генной инженерии (Стент Г., 1974). Это обусловило возникновение нового направления в лабораторной методологии — генодиагностики инфекционных болезней. Принцип генетической диагностики заключается в определении различными способами специфичного для искомого микроорганизма участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Основными направлениями генодиагностики являются ДНК-зондирование и методы амплификации нуклеиновых кислот.

Наибольшее распространение из них получила полимеразная цепная реакция. Техника постановки ПЦР относительно доступна и вместе с тем обеспечивает достаточно высокие эффективность, специфичность и чувствительность анализа. Продолжительное время ПЦР оставалась прерогативой научно-исследовательских лабораторий и институтов.

Применение этого метода в ветеринарной практике носило единичный характер [Шумилов К.В. с соавт., 1996]. В 1995 году ситуация коренным образом изменилась с выходом приказа МСХ и П № 350, направленного на интенсивное внедрение ПЦР в ветеринарию.

На данный момент полимеразная цепная реакция разработана для детекции у животных Mycobacterium spp., Chlamidia spp., Salmonella, Listeria monocytogenes, Y. enterocolitica, Micoplasma spp., Campilobacter jejuni, Lyssavirus и в том числе для обнаружения Brucella spp. Применение ПЦР позволило обеспечить эффективную детекцию бруцелл с чувствительностью 1×102−1×103 м.к./мл в различном материале, независимо от степени диссоциации возбудителя, а также исключить ложноположительные результаты реакции в присутствии Y. enterocolitica 0:9, Е. coli 0:157 и других микроорганизмов, имеющих общие с бруцеллами антигенные детерминанты.

Наиболее перспективной нуклеотидной последовательностью для конструирования ПЦР-тест-систем в целях детекции бруцелл является ген, кодирующий белок наружной мембраны молекулярной массой 31 кДа. Примером использования выше названной последовательности в качестве ДНК-мишени является ПЦР-тест-система для выявления Brucella spp. («Ген-Бру»), которая была разработана в РосНИПЧИ «Микроб». Тест-система включает амплификацию специфичного фрагмента ДНК размером 175 п.н. двумя парами праймеров (Bru 31- Bru 32, Bru 3 — Bru 4) по типу nested-ПЦР. Универсальный способ выделения ДНК гуанидинтиоционатом, сочетающий нуклеосорбцию на силикагеле, позволяет исследовать разнообразный клинический материал, пищевые продукты и объекты внешней среды.

Было целесообразно определить возможность применения данной тест-системы в ветеринарии. Нами были проведены исследования, которые показали возможность выявления ДНК бруцелл в образцах крови инфицированных животных с высокой чувствительностью — 98%. Данные специальной литературы свидетельствуют, что при анализе на бруцеллез в ПЦР возможно исследовать различный клинический материал: кровь [Гаранина С.Б., 1996; Matar G.M. et al., 1996; Quepo-Ortuino M.I. et al., 1997; Sifuentes-Ricon A.M. et al., 1997], мочу, слюну [Гаранина С.Б. 1996], молоко [Leal-Klevezas et al., 1995], суспензии внутренних органов (печень, селезенка, лимфатические узлы) животных [Шумилов К.В. с соавт., 1996], а также содержимое брюшной полости, желудка, бурс и гигром, плаценту и плодовые оболочки после аборта [Наставление, 2000].

Сравнительный анализ диагностической ценности для ПЦР различных образцов клинического материала от больных бруцеллезом людей (кровь, моча, слюна, сыворотка крови), проведенный Дентовской С. В. [2000], показал, что наибольшей эффективностью обладает кровь (образование специфичного продукта ПЦР наблюдалось в 87,2% случаев). Отмечено, что наличие и количество инфекта в той или иной биологической жидкости или ткани не одинаково и напрямую связано с клинической формой течения бруцеллезной инфекции [Вершилова П.А., 1972, 1974].

Определение диагностической ценности отдельного биологического материала для ПЦР при анализе на бруцеллез является важным и при обследовании животных.

Известно, что у большинства инфицированного поголовья бруцеллез протекает в первично-хронической форме [Юсковец М.К., 1960; Наставление по диагностике бруцеллеза, 2000], нередки случаи стертой и бессимптомной инфекции [Косилов И.А., Дегтяренко Л. В., 1980]. Эти обстоятельства в значительной мере повышают актуальность проблемы выбора биологического материала для ПЦР.

Для изучения этого вопроса нами был проведен сравнительный анализ, определяющий частоту обнаружения специфической ДНК в различных клинических образцах. Спектр анализируемых проб мы ограничили кровью, молоком, цервикальной слизью от инфицированного крупного рогатого скота. При исследовании проб молока с целью повышения эффективности ПЦРанализа впервые у естественно инфицированных животных применили модифицированный метод выделения и очистки ДНК, который заключался в дополнительной обработке ацетоном осадка нуклеосорбента, содержащего нуклеиновую кислоту. Результаты показали очевидное превосходство при исследовании цельной крови (80% положительных результатов) над остальным материалом (молоко — 30%, цервикальная слизь — 5%). Таким образом, данные наших исследований позволяют утверждать, что кровь инфицированного крупного рогатого скота обеспечивает надежное и стабильное обнаружение бруцелл. Именно этот материал является наиболее предпочтительным для ПЦР-анализа на бруцеллез. Отрицательные результаты ПЦР при исследовании молока и цервикальной слизи не позволяют исключить бруцеллезной инфекции.

Альтернативным диагностическим материалом на ряду с выше описанными может служить сыворотка крови. Необходимость использования для ПЦР-анализа сыворотки крови может быть продиктована отсутствием в присланном материале для исследования цельной крови, целесообразностью удаления ингибиторов ПЦР (гем, тотальная ДНК), что возможно при получении сывороток.

Наличие ДНК-бруцелл в образцах сывороток крови можно объяснить «свободной» внеклеточной фазой существования бруцелл [Григорьева Г. И. с соавт., 1998], а также присутствием лейкоцитов (если при получении отсутствовал этап центрифугирования), в цитоплазме которых могут находиться данные микроорганизмы. Тем не менее, при анализе в ПЦР сывороток крови от инфицированных крупного рогатого скота и морских свинок мы наблюдали образование специфичного продукта реакции в 10,9% и 12,5% случаев соответственно. Однако при сравнении с результатами исследования крови, частота выявления ДНК бруцелл в последней была в 7 раз выше, чем при анализе сывороток.

Огромный интерес для ветеринарных специалистов представляют исследования направленные на решение проблемы дифференциации иммунизированных живыми противобруцеллезными вакцинами (из штамма № 82 и др.) животных от естественно инфицированных, так как применяемые в данный момент иммунобиологические методы в большинстве своем не дают такой информации. Ситуация несколько изменилась с внедрением в практику реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС антигеном. Но эффективность этого метода к сожалению оказалась ниже таковой, чем у комплекса РА и РСК.

Учитывая выше изложенное, нами были проведены исследования, определяющие возможность применения тест-системы «Ген-Бру» при обследовании вакцинированного против бруцеллеза поголовья. Установлено, что ДНК бруцелл при анализе в ПЦР крови иммунизированных животных выявляется на всем протяжении времени от первичной вакцинации (в 18,7%) и спустя 2 года после ревакцинации (в 10% случаев). Наибольшая частота положительных результатов ПЦР отмечалась через 25 суток после введения вакцины (1 вакцинация — 42,8%, 2 вакцинация — 55,5%). Полученные в ходе этого исследования данные полностью совпадают с наблюдениями некоторых авторов [Падалица А.Г., 1983; Муллакаев О. Т. с соавт., 2001], которые отмечали возможность длительной персистенции диссоциированных вакцинных штаммов, в том числе и шт. № 82.

Для установления с помощью ПЦР возможных различий между инфекционным и иммунным процессами провели анализ крови и сыворотки крови на наличие ДНК бруцелл от зараженных B. melitensis шт. № 565 и привитых В. abortus шт. № 82 морских свинок. Материал исследовали на 25 сутки, с расчетом на то, что в эти сроки вероятнее всего наступит генерализованная инфекция (в первом случае) и явление бактериемии (в обоих случаях) [Здродовский П.Ф., 1948; Вершилова П. А. с соавт., 1974].

Сопоставление результатов ПЦР-анализа крови и сыворотки крови от двух групп животных показало, что, во-первых, исследование крови было предпочтительным при инфекционном процессе (87,5% положительных проб), а при иммунной перестройке статистически достоверной разницы в вероятности обнаружения ДНК бруцелл в крови и сыворотки крови не установлено (21,4% и 35,7%(соответственно). ВоЛ вторых, частота обнаружения специфической ДНК в крови инфицированных животных оказалась в 4 раза выше, чем у иммунизированных морских свинок. Это может отражать интенсивность процесса взаимоотношений макрои микроорганизма. Наиболее динамично, как правило, развивается процесс инфицирования организма.

Таким образом, уровень распределения ДНК бруцелл вирулентного и вакцинного штаммов в компонентах крови отражает степень завершения фагоцитоза. Как известно, при инфекционном процессе, вызванном бруцеллами, имеет место незавершенный фагоцитоз [Вершилова П.А. с соавт., 1974]. Это означает, что основная масса бруцелл будет находиться в полиморфноядерных лейкоцитах и нейтрофилах, следовательно и наивысшая результативность ПЦР будет наблюдаться при исследовании материала, богатого этими клеточными элементами (в данном случаекрови). При попадании в организм слабовирулентных и вакцинных штаммов бруцелл фагоцитоз обычно завершается лизисом микробных клеток. Поэтому основная масса бруцелл в этом случае будет находиться в свободном состоянии, а в фагоцитах — лишь остаточное количество еще не разрушенных клеток. На первый взгляд это обстоятельство должно обусловливать высокую диагностическую ценность сыворотки крови по, сравнению с цельной кровью. На самом деле результаты наших, исследований показали, сыворотка крови и кровь иммунизированных морских свинок при ПЦР-анализе были равнозначны, поскольку сыворотка является одним из компонентов крови. Именно ее наличие и определило выявление в большинстве случаев ДНК бруцелл в крови.

Это еще раз доказывает факт «универсальности» образцов крови как диагностического материала. Уровень распределения ДНК бруцелл, выявляемый в ПЦР, косвенно свидетельствует о завершении фагоцитоза, а определение частоты выявления специфического фрагмента в реакции при исследовании крови показывает интенсивность инфекционного процесса.

Полученные таким образом данные могут быть использованы при интерпретации результатов ПЦР-анализа и разработке схемы дифференциации поствакцинального процесса от инфекции.

Для определения диагностической точности ПЦР в общей схеме лабораторной диагностики бруцеллеза животных было актуальным сравнить эффективность тест-системы «Ген-Бру» и традиционных методов иммуноанализа (РА, РСК). С этой целью мы провели исследования 110 сывороток крови, полученных от не иммунизированного противобру-целлезными вакцинами крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Наибольшее количество животных больных бруцеллезом выявлено в ПЦР — 12 (10,9%). Данные РА и РСК полностью совпадали с результатами в ПЦР, в то время, как применение ПЦР позволило обнаружить дополнительно 6 (50%) инфицированных животных.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ диагностической точности методов позволяет сделать вывод о том, что ПНР-анализ является эффективным методом лабораторной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота. Применение ПЦР позволяет выявлять в 2 раза больше больных бруцеллезом животных, чем комплекс РА и РСК. При использовании в ПЦР-анализе тест-системы «Ген-Бру» (РосНИПЧИ «Микроб») вместе с аналогичной «Ампли-Сенс-100» (ЦНИИЭ) продемонстрирована высокая специфичность (100%) и одинаковая чувствительность обоих тест-систем, которая при исследовании чистой культуры В. abortus шт. № 19 составила 1×102 м.к./мл, а при анализе образцов крови больных бруцеллезом животных значения этого показателя достоверно не различались и составляли в «Ген-Бру» — 80,0%, в «АмплиСенс-100» — 85,0%.

Данные обстоятельства указывают на возможность комплексного применения обоих тест-систем для повышения вероятности обнаружения бруцелл при расшифровке сложных случаев в ПЦР-диагностике, вызванных возможной делецией или точковой мутацией в нуклеотидной последо-вательности ДНК-мишени.

Конец XX столетия ознаменовался стремительными темпами научно-технического прогресса во многих областях естествознания и в том числе в биологии. Одним из следствий этого явились разработка и внедрение в клиническую практику молекулярно-биологических методов исследования. Технология амплификации нуклеиновых кислот и, в первую очередь, ПЦР позволили поднять на качественно новый уровень диагностику многих инфекционных заболеваний.

Применение ПЦР-анализа для выявления бруцелл позволило разрешить такие проблемы, как обнаружение измененных форм возбудителя (SR-, R-, L-клеток), исключение перекрестных реакций с другими микроорганизмами, повышение чувствительности анализа до 1×102−1×103 м.к./мл и сокращение его сроков до 8 часов. Это значительно расширило возможности ветеринарных специалистов в выявлении всех больных бруцеллезом животных, что является залогом для оздоровления неблагополучных стад и успешной ликвидации очагов инфекции.

Исследования, проведенные в данной научной работе, позволили получить новые сведения о схеме ПЦР-анализа на бруцеллез при обследовании животноводческих хозяйств с различным эпизоотологическим статусом, изучить динамику циркуляции специфической ДНК при иммунном процессе, определить диагностическую ценность различного биологического материала, грамотно и рационально использовать преимущества генной диагностики перед другими методами.

В настоящее время перед генодиагностикой стоят важные задачи по ДНК-типированию бруцелл и дифференциации вирулентных и вакцинных штаммов. Решение перечисленных проблем — дело будущих исследований.