Разработка принципов изучения механизма антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств

Перед современной химиотерапией инфекционных заболеваний стоят две острые проблемы: 1) преодоление постоянно растущей устойчивости бактерий к известным антибактериальным средствам, и 2) увеличение числа патогенных микроорганизмов за счет штаммов, относившихся ранее к условно-патогенным /85, 104, 200/. Все это диктует необходимость поиска антибактериальных препаратов с новыми механизмами действия. В связи с этим задача изучения механизма антибактериального действия вновь синтезированных веществ на ранних этапах их исследования выходит на первый план.

Актуальность настоящего исследования вытекает из необходимости постоянного расширения спектра антибактериальных препаратов и стандартизации методов доклинического испытания новых веществ, обладающих антибактериальной активностью.

В последнее время все большее значение придается изучению механизмов действия новых классов химических соединений, обладающих антибактериальной активностью. В настоящее время в России зарегистрировано более 400 антибактериальных препаратов с различными механизмами действия. Особое значение имеет выяснение мишени действия веществ на стадии их доклинического изучения. Для новых классов антибактериальных соединений данные о мишени действия позволяют оценить химиотерапевтические перспективы изученной группы, а также провести направленный синтез высокоактивных соединений.

Выяснение механизма действия нового класса антибактериальных веществ на ранних стадиях изучения позволит также определить место этих соединений на высоко насыщенном фармацевтическом рынке и коммерческие перспективы их распространения, а также избежать расходов на создание препарата, аналогичного по своим свойствам уже используемым.

Для фармакологических препаратов, антибактериальная активность которых является побочным эффектом, расшифровка механизма позволит прогнозировать его значимость. Проведенные исследования структурно-функциональных зависимостей, базирующиеся на данных о механизме действия, создают предпосылки для направленного синтеза веществ, сохраняющих фармакологическую, но лишенных полностью или частично нежелательной антибактериальной активности, или, наоборот, для создания нового антибактериального средства.

Несмотря на очевидное значение изучения механизмов антибактериального действия химических соединений, в последних Методических указаниях по экспериментальному изучению новых антибактериальных препаратов и антибиотиков, изданных Фармкомитетом СССР в 1978 году, рекомендации по проведению определения механизмов действия изучаемых препаратов отсутствуют /23/. В настоящее время методические рекомендации по проведению такого рода исследований представлены только в одном сборнике /24/. В чрезвычайно полезном и^до настоящего времени актуальном, пособии по экспериментальной химиотерапии издания 1971 года предложены два метода изучения механизма антибактериального действия соединений — метод антагонизма /36/, заключающийся в поиске среди естественных метаболитов веществ — антагонистов антибактериальной активности испытуемого соединения, и изучение влияния химиотерапевтических веществ на отдельные ферментные системы /28/. Предлагаемые авторами подходы основаны на достаточно хаотичном испытании метаболитов в качестве антагонистов антибактериального действия соединений или такого же случайного набора ферментативных реакций, которые могут быть изучены экспериментатором. Развитие молекулярной физиологии микроорганизмов и бактериальной генетики открыло в настоящее время более широкие возможности для систематизации исследований механизмов антибактериального действия. Расширение арсенала методологических подходов, а также требования современных рыночных отношений определяют актуальность разработки единых принципов изучения механизмов антибактериального действия.

Целью исследования явилась разработка методологических подходов к оценке механизма антибактериального действия фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.

Задачи исследования:

1) Создание алгоритма тестирования химических соединений с целью определения механизма их антибактериального действия на примере известных антибактериальных препаратов.

2) Сравнительное изучение механизма антибактериального действия 6- фтор и 6-нитро производных 4-хинолон-З-карбоновой кислоты на основе разработанного алгоритма тестирования.

3) Углубленное изучение особенностей механизма антибактериального действия и структурно-функциональные зависимости производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты.

4) Выявление мишени антибактериального действия антидепрессантов — пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пиразинокарбазолов на основе разработанного алгоритма тестирования.

5) Определение структурно-фунциональных зависимостей антибактериальной активности для соединений ряда карбазола.

Научная новизна исследования.

1. Впервые предложена схема исследования механизма антибактериального действия веществ, отличительной особенностью которой является использование генетически сконструированных и мутантных штаммов как для определения мишени действия веществ, так и для изучения их структурно-функциональных зависимостей.

2. Впервые предложено использование определение влияния веществ на скорость аккумуляции пролина и а-метилглюкопиранозида для оценки их мембранотропного действия на бактериальную клетку. С помощью этого метода выявлено влияние тиазолидиндионов на бактериальные мембраны.

3. Впервые изучена структурно-функциональная зависимость в ряду 6-нитро производных хинолон-3-карбоновой кислоты.

4. Впервые выявлены различия в механизме действия фтори нитропроиз-водных 4-хинолона.

5. Впервые установлена механизм воздействия антидепрессантов пиразидола и тетриндола, относящихся к химическому ряду пиразинокар-базола на бактериальную клетку. Разработаны модели для выявления структурно-функциональных зависимостей соединений ряда пиразинокар-базола и 1-аминотетрагидрокарбазола для грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

6. Впервые выявлены фармакоформные группы, обеспечивающие высокую активность в отношении Mycobacterium tuberculosis в ряду пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола. Наиболее активными оказались соединения: 2,3,За, 4,5,6-гексагидро-8-адамантил-1н-пиразино-[3,2,1 j, к] карбазол (ШКИ-114) и 1-фенилэтиламино-6-циклогексил-1,2,3,4-тетра-гидрокарбазол (Ш-1046).

Научно-практическая значимость исследования.

1. Разработана рациональная схема оценки механизма антибактериальной активности фармакологических веществ на стадии доклинического изучения.

2. Методологические подходы оценки механизмов антибактериального действия учтены в требованиях к доклиническому изучению антибактериальной активности фармакологических веществ, одобренных Фармакологическим комитетом МЗ РФ в качестве официального документа.

3. Предложенная схема, а также отдельные методические подходы, были применены во Всероссийском Научном Центре по безопасности биологически активных веществ и в Институте органического синтеза Уральского отделения РАН для предварительной оценки механизмов антибактериального действия новых групп химических соединений с выраженным антимикробным эффектом. Применение разработанных в диссертационной работе методологических подходов позволило на ранних этапах исследования определить точку приложения антибактериального действия новых групп соединений.

4. Высокая антибактериальная активность и особенности механизма действия соединения РГ-10 (1-циклопропил-6-нитро-7(3-метилпиперазинил)-1,4,дигидро-4-оксохи-нолин-3-карбоновой кислоты) с учетом его низкой токсичности, явились основанием к рекомендации этого соединения для клинических испытаний в качестве антибактериального средства.

5. Впервые выявлены фармакоформные группы в молекуле пиразинокар-базола и аминотетрагидрокарбазола, обеспечивающие антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий.

6. Установление структурно-функциональных зависимостей активности в отношении М. tuberculosis производных пиразинокарбазола и 1-аминотетрагидрокарбазола позволило определить направление синтеза соединений с высокой противотуберкулезной активностью в ряду карбазола.

7. Существование двух сайтов связывания 4-хинолонов с молекулой гиразы, показанное в настоящем исследовании, и выявление структур в молекуле 4-хинолона, определяющих сродство к этим сайтам, открывает принципиальную возможность синтеза нового ряда соединений с антибактериальной активностью — ингибиторов бактериальной ДНК-гиразы,.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложен алгоритм исследования механизма антибактериального действия гетероциклических соединений:. — ~.

• определение концентрационных и временных параметров антибактериального действия на культуру бактерий;

• выявление группы метаболических процессов бактериальной клетки, чувствительных к действию исследуемых веществ;

• определение способности веществ к ингибированию отдельных биохимических реакций или повреждению клеточных структур (ДНК-повреждающее действие, мембранотропный эффект и т. д.).

• анализ структурно-функциональных зависимостей для каждой химической группы соединений.

2. Антибактериальный эффект производных тиазолидиндионов является следствием их мембранотропного действия, связанного с их неспецифическим взаимодействием с фосфолипидами мембраны.

3. Антибактериальный эффект производных пиразинокарбазола обусловлен ингибированием репликации бактериальной ДНК вследствие подавления синтеза предшественников ДНК — нуклеотидов.

4. Положения 3 и 8 в молекуле производных пиразинокарбазола особенно важны для их антибактериальной активности. Наилучшую активность в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli обеспечивал циклогексильный заместитель в положении 8 в сочетании с водородом в положении 3. Адамантильный заместитель в положении 8 и пиперидинильный радикал в положении 3 приводили к существенному усилению активности в отношении грамположительных микроорганизмов St. aureus и Mycobacterium.

5. Механизм и мишень действия 6-нитрохинолонов аналогичны таковым для фторхинолонов: нитрохинолоны ингибируют синтез ДНК и вызывают разрывы в этой молекуле в результате ингибирования комплекса гираза — ДНК.

6. Природа заместителей в положениях 1, 7 и 8 определяют сродство молекулы 4-хинолона к, А и В субъединицам ДНК-гиразы, причем введение 7-пиперазинила или 7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанила), на фоне 1-циклопропила, увеличивают сродство молекулы к В субъединице ДНК-гиразы.

7. Природа заместителя в положении 6 (нитроили фтор) не отражалась на сродстве 4-хинолона к, А или В субъединице ДНК-гиразы, однако сказывалась на способности вещества вызывать разрывы в ДНК.

8. Ципрофлоксацин и 6-нитро-7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанил)-4-хинолон-3-карбоновая кислота способны к независимому от белкового синтеза бактерицидными эффектами в результате связывания с одним и тем же сайтом в, А субъединице ДНК-гиразы, тогда как сайт связывания дифторхинолона ломефлоксацина, обеспечивающий аналогичный эффект, отличается от сайта связывания вышеназванных 4-хинолонов.

Апробация работы. Диссертационное исследование выполнено по плану научно-исследовательскиз работ в Центре химии лекарственных средств — Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте им. С. Орджоникидзе в 1989;1992 годах и Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН в 1998 — 1999 годах.

Основные положения диссертации были представлены в виде докладов и стендовых сообщений на 11 и 19 съездах Федерации Европейских биохимических обществ в 1977, 1989 г., Международном генетическом конгрессе в Москве, в 1980 г., 8 и 9 Средиземноморском конгрессе по химиотерапии в 1992 и 1994 годах, 18 Международном конгрессе по химиотерапии в 1993 г., Заседаниях секции туберкулеза Всероссийского микробиологического общества в 1998 и 1999 годах, Конгрессе «Человек и лекарства» в 1998 г., на коллоквиумах и заседаниях Ученых советов ЦХЛС — ВНИХФИ и ЦНИИТ РАМН, в отчетах по темам НИР ЦХЛС ВНИХФИ и ЦНИИТ РАМН.

По материалам диссертации опубликована 30 работ в отечественных и зарубежных научных периодических изданиях.

Структура диссертационной работы. Работа изложена на страницах, содержит 5 разделов, включая «Введение», «Литературный обзор», Экспериментальную часть, состоящую из Общей характеристики материалов и методов, четырех глав Результатов и обсуждения,.

8. ВЫВОДЫ.

1. Алгоритм исследования механизма антибактериального действия веществ включает в себя:

• определение концентрационных и временных параметров антибактериального действия на культуру бактерий;

• выявление группы метаболических процессов бактериальной клетки, чувствительных к действию исследуемых веществ (репликация ДНК, транскрипция, трансляция);

• определение влияния веществ на отдельные ферментативные реакции или группы реакций, а также структур бактериальной клетки (например, ДНК-повреждающее, мембра-нотропное действие),.

• анализ структурно-функциональных зависимостей для каждой химической группы соединений.

2.

Введение

нитрогруппы в положение 6 молекулы 4-хинолона вместо фтора не изменяет механизм действия этих соединений. Нитрохино-лоны, так же как и фторхинолоны ингибируют синтез ДНК и вызывают разрывы в этой молекуле в результате ингибирования комплекса гираза ДНК, хотя и отличаются от фторхинолонов в механизмах взаимодействия с мишенью.

3.

Введение

нитрогруппы в положение 6 не влияет на сродство 4-хинолона к, А или В субъединице ДНК-гиразы, по сравнению с 6-фторхинолонами.

4.

Введение

нитрогруппы в положение 6 уменьшает способность вещества вызывать разрывы в ДНК, по сравнению с 6-фторхинолонами.

5.

Введение

пиперазинила или (1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанила) в положение 7 молекулы 4-хинолона, при наличие циклопропильного заместителя в положении 1, увеличивает сродство молекулы 4-хинолона к В субъединице ДНК-гиразы.

6. В молекуле ДНК-гиразы имеется несколько сайтов для связывания молекулы 4-хинолона. Ципрофлоксацин и 6-нитро-7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанил)-4-хинолон-3-карбоновая кислота способны к независимому от белкового синтеза бактерицидному эффекту в результате связывания с одним и тем же сайтом в, А субъединице ДНПС-гиразы. Сайт связывания дифторхинолона ломефлоксацина, обеспечивающий аналогичный эффект, отличается от сайта связывания вышеназванных 4-хинолонов.

7. Антибактериальный эффект производных пиразинокарбазола обусловлен ингибированием репликации бактериальной ДНК вследствие подавления синтеза предшественников ДНК — нуклеотидов. Изучение влияния пиразинокарбазолов на репликацию ДНК и активность дигидрофолатредуктазы может быть использовано как модель для выявления структурно-функциональных зависимостей антибактериальной активности соединений этого ряда.

8. Циклогексильный заместитель в положении 8 в сочетании с водородом в положении 3 обеспечивает высокую активность в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli.

9. Адамантильный заместитель в положении 8 и пиперидинильный радикал в положении 3 молекулы пиразинокарбазола приводит к существенному усилению активности в отношении грамположи-тельных микроорганизмов.

10. Гидрофобные адамантильный радикал положении 8 молекулы пиразинокарбазола и циклогексильный радикал в положении 6.

157 аминотетрагидрокарбазола обусловливают высокую активность в отношении микобактерий туберкулеза in vitro.

11. Производные тиазолидиндионов оказывают мембранотропное действие на чувствительные к ним бактерии Escherichia coli, взаимодействуя с фосфолипидами мембраны.

12. Штамм Escherichia coli Kl 2 EC1000/pJE43 может быть использован для изучения ДНК-повреждающего действия соединений с выраженной антибактериальной активностью.

13. Уровень резистентности репликации ДНК у мутантного по, А субъединице штамма Escherichia coli и способность вещества индуцировать SOS-ответ позволяют прогнозировать активность in vivo соединений из группы производных хинолон-3-карбоновой кислоты.

14. Предложенная схема исследования позволяет на этапе доклинического изучения определить механизмы антибактериального действия соединений различной химической структуры, разработать адекватные модели для изучения структурно-функциональной зависимости антибактериальной активности в новых химических рядах.

7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

С момента открытия первых антимикробных препаратов механизмы их действия подвергались тщательному и всестороннему исследованию. Анализ накопленных данные в сочетании с опытом клинического применения антибактериальных препаратов показывают, что молекулярные механизмы их действия предопределяют такие важные характеристики препаратов как их эффективность и скорость нарастания устойчивости к ним. В последнее время, с развитием компьютерных технологий и направленного конструирования биоактивных молекул, все большее значение приобретает разработка подходов к получению данных о структурно-функциональных зависимостей различных групп химических соединений. В этой связи разработка адекватной модели изучения структурно-функциональных зависимостей на ранних этапах изучения новых химических групп соединений с антибактериальной активностью приобретает все большее значение. Попытка создания унифицированной системы исследования механизмов антибактериального действия на стадии доклинического изучения представлена в настоящем исследовании.

С целью разработки схемы исследования механизмов антибактериального действия синтетических гетероциклических соединений различных групп нами были изучены три типа веществ:

• оригинальные соединения, родственные высокоэффективным антибактериальным препаратам фторхинолонам (нитрохинолоны);

• аналоги фармакологических препаратов с психотропной активностьютетриндола и пиразидола (производные пиразинокарбазола), у которых ранее была выявлена антибактериальная активность in vitro;

• соединения с не выявленной антибактериальной активностью производные тиазолидиндиона).

В качестве объекта действия препаратов мы выбрали бактерии Escherichia coli. Наш выбор в первую очередь обуславливался тем, что физиология этих бактерии изучена наиболее полно, доступен широкий спектр мутантов по генам, кодирующим самые разнообразные метаболические процессы. Экстраполяция данных, полученных на одном виде бактерий, к тому же условно-патогенном, может показаться недостаточно корректной. Однако, результаты сравнительного изучения механизмов действия антибактериальных препаратов на Escherichia coli и других видах бактерий, представленные в многочисленных публикациях, доказывают обоснованность подобного подхода. Так, изучение механизмов действия фторхинолонов показало существование одной и той же мишени как у Escherichia coli, так и у всех остальных изученных видов бактерий, как грамположительных, так и грамотрицательных — ДНК-гиразы /103, 168/. В последние годы была обнаружена еще одна мишень действия 4-хинолонов — топоизомераза IV. Она также обнаружена как у Escherichia coli, так и у других изученных бактерий /169/. При этом, если у Escherichia coli эта мишень является вторичной, она рассматривается как первичная мишень действия у грамположительных микроорганизмах /123/. Интересно, что две субъединицы топоизомеразы IV из Escherichia coli имеют высокую степень гомологии с, А и В субъединицами ДНК-гиразы. Участок аминокислотной последовательности гиразы, участвующий в связывании с 4-хинолонами практически идентичен аналогичному участку полипептидной цепи у топоизомеразы IV /37, 131, 132/.

СХЕМА изучения механизма антибактериального действия химических соединений на доклиническом этапе.

Сравнение механизмов действия противотуберкулезных препаратов у микобактерий и Escherichia coli выявили не только общие мишени у этих двух далеко отстоящих друг от друга видов, но и высокую гомологию аминокислотных последовательностей этих мишеней /162/. Даже для препарата изониазид, не действующего на Escherichia coli, обнаружены гены, кодирующие ферментативные системы, обеспечивающие устойчивость бактерий к нему, общие для обоих видов микроорганизмов /162/.

Приведенные выше примеры позволяют считать допустимым использование для определения мишени действия препаратов модель Escherichia coli с дальнейшей экстраполяцией этих данных на другие микроорганизмы. Безусловно, тонкие механизмы взаимодействия антибактериального вещества могут различаться от вида к виду, поэтому результаты анализа структурно-функциональных зависимостей, полученные на одном виде бактерий должны с осторожностью переноситься на другие виды микроорганизмов и подвергаться дополнительной проверке с использованием бактерий различных видов.

На основании проведенных исследований, предложена схема изучения механизмов антибактериального действия химических соединений (см. Схему), базирующаяся на определение временных и концентрационных параметров антибактериального эффекта, определяющих условия дальнейших экспериментов, на основании изучения подавляющего воздействия изученных соединений на рост культуры бактерий.

Наилучшим методом для определения кинетических параметров антибактериального эффекта является определение действия вещества на динамику прироста оптической плотности жидкой культуры. Этот метод оказался достаточно информативным и в случае веществ, вызывающих филаментацию бактериальных клеток: несмотря на то, что оптическая плотность культуры не отражает число жизнеспособных бактерий, такие характеристики как время проявления эффекта и действующие концентрации веществ, определенные по их влиянию на скорость прироста оптической плотности, близки к истинным. Характер кривых прироста оптической плотности культуры в присутствии 4-хинолонов соответствует степени чувствительности бактерий к препаратам этого ряда. Это справедливо для бактерий дикого типа и устойчивых к препаратам по причине нарушения транспорта веществ в клетку и мутационного изменения мишени их действия.

На втором этапе определяются группы биохимических процессов бактериальной клетки, подверженных воздействию изучаемых соединений, в соответствии с временными и концентрационными характеристиками, определенными на первом этапе. В качестве процессов, воздействия на которые целесообразно изучать в первую очередь, выделены процессы репликации ДНК, транскрипции и трансляции.

Изучение влияния веществ изучаемых химических групп на белковый спектр чувствительных к ним бактерий не выявил достоверных изменений в бактериальной клетке, которые могли бы быть охарактеризованы как первичная реакция клетки на антибактериальное воздействие. По-видимому, этот метод недостаточно чувствителен для выявления первичных нарушений в бактериальной клетке, вызванных испытуемыми веществами.

В случае влияния веществ на репликацию ДНК, целесообразно проверить способность этих соединений к ДНК-повреждающему эффекту. Для изучения способности веществ повреждать первичную структуру ДНК предложен генетически сконструированный штамм. Возможность использования штамма ЕС1000/рШ43 для определения ДНК-повреждающего действия веществ с антибактериальной активностью впервые доказана на примере нескольких групп лекарственных препаратов с известными механизмами действия. Сравнение динамики антибактериального эффекта вещества с его способностью вызывать разрывы в ДНК также позволяет определить мишень действия соединения. Изучение воздействия соединений на первичную структуру ДНК важно не только с точки зрения определения механизма их антибактериального действия, но и для прогноза их возможной генотоксичности. Для характеристики способности вещества вызывать разрывы в ДНК, выявляемой по его способности индуцировать ЗОБ-ответ нами предложен коэффициент индукции — соотношение уровня Р-галактозидазы до начала действия вещества и через 20 минут его воздействия.

Способность лекарственного препарата повреждать ДНК бактерий может рассматриваться как свидетельство его потенциальной генотоксичности в отношении организма человека и канцерогенности. Поэтому бактериальные тест — системы широко используются для выявления ДНК-повреждающих веществ.

В настоящее время не существует ни одной тест-системы, однозначно определяющей генотоксичность вещества. Соединение, оказавшееся генотоксичным в клетках одного вида, может не проявить подобное свойство в клетках другого, даже близкородственного вида. Только положительный результат нескольких конвенционных тестов позволяет говорить о потенциальной генотоксичности вещества. Причины такого несоответствия лежат в особенностях механизмов протекания мутационного процесса в различных организмах. В связи с этим, результаты применяемого нами БОЗ-хромотеста рассматриваются нами только как свидетельство связанного с ДНК механизма действия соединений, а не как свидетельство их генотоксичности для человека. Тем не менее, несмотря на невозможность однозначной интерпретации положительного результата 808-хромотеста, соединения, вызывающие индукцию 808-ответа должны с особой тщательностью проверяться на возможную генотоксичность для человека.

Одной из вероятных мишеней антибактериального действия веществ является бактериальная цитоплазматическая мембрана. Изменение уровня энергизации мембраны может быть принято в качестве показателя действие веществ на цитоплазматическую мембрану. Для выявления мембранотропного воздействия веществ на бактериальную клетку разработан метод, основанный на определении уровня трансмембранного потенциала ионов водорода Ацн+ по скорости аккумуляции радиоактивно меченного пролина и а-метилглюкопиранозида. Одновременное изучения влияния веществ на два независимых друг от друга, но зависимых от уровня энергизации бактериальной мембраны процесса, позволяют исключить иное, например, сульфгидрильное, действие изучаемых соединений.

Выявление процессов биосинтеза, чувствительных к действию испытуемых веществ позволило на ранних этапах исследования определить возможные этапы бактериального метаболизма, определяющие антибактериальный эффект соединений групп пиразинокарбазолов и нитрохинолонов. Полученные в предварительных исследованиях данные позволили разработать модели для проведения структурно-функционального анализа для этих групп соединений.

Проведенные исследования показали, что антибактериальное действие нитрохинолонов, подобно фторхинолонам связано с, А субъединицей ДНК-гиразы. Подобно фторхинолонам, антибактериальное действие соединений этого ряда сопровождается появлением разрывов в ДНК, проявляющееся индукцией SOSответа.

Однако, по сравнению с фторхинолонами, способность нитрохинолонов индуцировать SOS-ответ снижена, что может быть объяснено иным, чем у фторхинолонов, механизмом ингибирования комплекса ДНК-гираза-ДНК.

Анализ структурно-функциональных зависимостей 4-хинолонов подтвердил известное из литературы преимущество фтора перед нитрогрупппой в положении 6 и пиперазинила в положении 7. Сравнение способности 4-хинолонов с различными заместителями в положениях 5 и 6 позволяют предположить существование оптимальных соотношений стерических размеров группзаместителей в этих положениях. Кроме 7-пиперазинила, введение 1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанила в положение 7 также приводит к существенному увеличению активности вещества в отношении бактериальной репликации ДНК.

Для оценки сродства 4-хинолонов различной структуры мы ввели индекс резистентности — соотношение ИД5о для штамма с нормальной гиразой и мутантной по, А или В субъединице. Индекс резистентности отражает изменение сродства молекулы 4-хинолона к участку аминокислотной последовательности, измененной в результате мутации. Уменьшение сродства вещества к полипептидной молекуле приводит к увеличению значения ИД50 репликации ДНК для мутантного штамма. На основании величины индексов резистентности все изученные 4-хинолоны были разделены на три группы. 4-хинолоны первой группы имели два сайта связывания с молекулой гиразы — в, А и В субъединице. 4-хинолоны второй и третьей группы имели значительно меньшее сродство к В субъединице.

Меньшее сродство к В субъединице не отражало абсолютную способность 4-хинолонов ингибировать синтез ДНК, но коррелировала с их антибактериальной активностью in vivo. Это наблюдение позволяет использовать более дешевый тест на антибактериальную активность in vitro с использованием хотя бы одного штамма, мутантного по ДНК-гиразе, для более точного выявления соединений этого ряда, для которых низка вероятность проявления антибактериальной активности in vivo.

Природа заместителя в положении 6 (нитроили фтор) не отражалась на сродстве 4-хинолона к, А или В субъединице ДНК-гиразы, однако, как отмечалось выше, сказывалось на способности вещества вызывать разрывы в ДНК. По-видимому, заместитель в положении 6 участвует в образовании связи 4-хинолона с одноцепочечной петлей ДНК в комплексе гираза-ДНК.

Способность 4-хинолона оказывать бактерицидное действие в условиях ингибирования белкового синтеза увеличивает общую бактерицидную активность (бактерицидный механизм В) и присуща наиболее активным фторхинолонам ципрофлоксацину и офлоксацину /51/. Наши исследования показали, что природа заместителя в 1, 6, 7 или 8 положениях 4-хинолона определяет его способность к бактерицидному действию по механизму В. замена фтора в положении 6 на нитрогруппу на фоне 1-циклопрпила и 7-пиперазинила приводит к утрате 4-хинолоном способности к бактерицидному действию по механизму В. Однако 6-нитрохинолон с 1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанилом в положении 7, также как и ципрофлоксацин, способен к независимому от белкового синтеза антибактериальному действию.

Введение

фтора в положение 8 (ломефлоксацин) молекулы фторхинолона с этильным заместителем в положении 1 также приводила к появлению способности к бактерицидному действию по механизму В.

Изучение антибактериального действия 4-хинолонов в присутствии ингибитора белкового синтеза на бактерии, мутантные по ДНК-гиразе, показало, что сайт связывания в, А субъединице ДНКгиразы для ципрофлоксацина и нитрохинолона РГ-20 (ЛИБ-174)) с 7-(1,4-диазо-(4,3,0)-бицикло-нонанилом), приводящего к независимому от белкового синтеза бактерицидному эффекту этих соединений, отличается от такового для дифторхинолона ломефлоксацина.

На основании полученных данных нам удалось разделить функции различных заместителей 4-хинолона в связывании с мишенью действия гираза-ДНК. Заместитель в положении 6 участвует в создании разрывов в ДНК и тем самым в значительной степени определяет его бактерицидность. Заместитель в положении 7 участвует в связывании молекулы 4-хинолона с ДНК-гиразой, не связываясь с самой ДНК и влияя на возникновение разрывов с этой молекуле только косвенно.

Комплекс проведенных исследований позволил определить мишень действия пиразинокарбазолов как синтез нуклеотидовпредшественников бактериальной ДНК, по-видимому, вследствие ингибирования дигидрофолатредуктазы. Ингибирование репликации ДНК у Е. coli и активности ДФР из St. aureus были выбраны как модели для изучения структурно-функциональных зависимостей соединений этой группы.

Дальнейшее изучение структурно-функциональных зависимостей в ряду пиразинокарбазолов выявили, что положения 3 и 8 особенно важны для их антибактериальной активности. Наилучшую активность как в отношении грамотрицательных, так и в отношении грамположи-тельных бактерий проявило соединение с циклогексильным заместителем в положении 8. Адамантильный заместитель в положении 8 приводил к существенному усилению активности в отношении грамположительных микроорганизмов St. aureus и Mycobacterium. Пиперидинильный радикал в положении 3 обеспечивал более высокую антибактериальной активности в отношении грамположительных бактерий, тогда как отсутствие заместителя в положении 3 приводила к наиболее высокой активности в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli.

Применение предложенной схемы к препаратам из группы тиазо-лидидиона было осложнено отсутствием активности веществ этого ряда в отношении бактерий. Тем не менее, наличие у ЛИБ-4 и ЛИБ-22 антимикотического действия давало основание для углубленного изучения этих соединений. Мы надеялись разработать модель для изучения биологической активности тиазолидиндионов in vitro.

В случае соединений, относящихся к принципиально новым химическим группам, не проявившем антибактериальный эффект в отношении бактерий дикого типа, целесообразно изучить их действие на бактерии с поврежденной клеточной стенкой. Эти эксперименты позволяют сделать заключение о роли клеточной стенки в защите бактерий от антибактериального действия изучаемых соединений. В случае ЛИБ-4 и ЛИБ-22 штаммы бактерий Escherichia coli с поврежденной клеточной стенкой оказлись чувствительными к соединениям этой группы. Однако нам не удалось выявить существенного влияния тиазолидиндионов на процессы синтеза ДНК и белка и в чувствительных бактериях.

Неудача в определении возможного механизма действия тиазо-лидиндионов на этом этапе, тем не менее позволила значительно сузить поиск возможных мишеней действия этих соединений в дальнейшем. С помощью разработанного способа определения действия на уровень трансмембранного потенциала выявлено влияние тиазолидиндионов на мембраны. Дальнейшее изучение действия соединений этого ряда на активность фосфолипаз С и Б на модели искусственными липосомами позволило связать антибактериальный эффект тиазолидиндионов с неспецифическим связыванием с липидами мембран.

Проведенные исследования легли в основу разработки алгоритма исследования механизмов антибактериальной активности гетероциклических соединений различных химических групп, позволили получить оригинальные данные о механизмах антибактериального действия химических соединений, относящихся к трем различным группам гетероциклических соединений: определены мишени антибактериального действия тиазолидиндионов, пиразинокарбазолов и 6-нитрохинолонов.

Установленные структурно-функциональные зависимости в ряду пиразинокарбазолов могут быть использованы для направленного синтеза как новых антибактериальных препаратов, так и психотропных препаратов, лишенных антибактериальной активности.

Данные о структурно-функциональных зависимостях в ряду 4-хинолонов позволяют существенно расширить знания о механизмах их действия. Существование двух сайтов связывания 4-хинолонов с молекулой гиразы, показанное в настоящем исследовании, и выявление структур в молекуле 4-хинолона, определяющих сродство к этим сайтам, открывает принципиальную возможность синтеза нового ряда соедине.