4.2. Анализ экспрессии гена BIRC5 и генов его ингибиторов SMAC и PML.58.
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях человека при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода.58.
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека.66.
4.2. Создание экспрессионных генно-инженерных конструкций, содержащих гены SMAC и PML.69.
4.3. Получение клеточных линий А549, HeLa, Calul и NCI-H358, стабильно экспрессирующих SMAC и PML.72.
4.4. Анализ эффекта экспрессии гена PML в условиях транзиентной трансфекции клеток линий HeLa, А549 и НТ1080 плазмидой pEGFP-N1-PML1 75.
4.5. Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5.78.
4.6 Анализ чувствительности к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358.80.
4.7 Анализ влияния стабильной экспрессии гена SMAC на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, HeLa, Calu-1 и NCI-H358.82.
4.8.
Заключение
84.
5. ВЫВОДЫ .86.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.87.
БЛАГОДАРНОСТИ. 100.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ п.н. — пар нуклеотидов ед. — единица об/мин — оборотов в минуту ПЦР — полимеразная цепная реакция ДНК-аза I — дезоксирибонуклеаза I.
BIR — baculoviruses inhibitor of apoptosis repeat domains, повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза.
BIRC5 — baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin), белок, содержащий повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза PML — promyelocyte leukaemia, ген промиелоцитарной лейкемии.
SMAC/DIABLO — second mitohondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pi, второй митохондриальный активатор каспаз/связывающийся с ингибиторами апоптоза белок с низким значением изоэлектрической точки.
IAP — inhibitors of apoptosis proteins, белки ингибиторы апоптоза.
XIAP — X-linked inhibitor of apoptosis, ассоциированный с X хромосомой ингибитор апоптоза.
RING — Really Interesting New Gene.
RAR-a — receptor a-retinoic acid, рецептор а-ретиноевой кислоты PML-NB — PML nuclear body, PML ядерное тельце CARD — caspase recruitment domain, домен рекрутирующий каспазы RBCC/TRIM — RING-B-Coiled-Coil/TRIpartite Motif.
МНС I — major histocompatibility complex I, главный комплекс гистосовместимости I.
HDAC — гистондеацетилаза.
ОПЛ — острый промиелоцитарный лейкоз.
GAPDH — глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа.
GFP — green fluorescence protein, зелёный флуоресцентный белок.
NF-kB — nuclear factor kappa-B, ядерный фактор к В.
NLS — nuclear localisation signal, сигнал ядерной локализации.
NES — nuclear export signal, сигнал ядерного экспорта.
Taq ДНК-полимераза — термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus.
ДТТ — дитиотриэтол.
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота.
РНК — рибонуклеиновая кислота кДНК — кодирующая ДНК мРНК — матричная РНК рРНК — рибосомная РНК кДа — килоДальтон.
ОТ — обратная транскрипция.
ПААГ — полиакриламидный гель.
ТЕМЕД — тетраэтиленметилендиамин.
X-Gal — 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-Б-галактопиранозид.
ЭДТА — этилендиаминтетраацетат.
SV40 — simian virus 40, обезьяний вирус 40.
BRUCE — BIR Repeat Containing Ubiquitin-conjugating Enzyme, коньюгированный с убиквитином белок, содержащий BIR-домен c-IAP — cellular inhibitor of apoptosis protein 1, клеточный ингибитор апоптоза NAIP — Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein, нейрональный белок, ингибирующий апоптоз.
TNF — tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли.
VEGF — vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов dNTP — дезоксинуклеозидтрифосфаты.
HMPJI — немелкоклеточный рак легкого.
АК — аденокарцинома.
ПРЛ — плоскоклеточный рак легкого.
ПРП — плоскоклеточный рак пищевода.
IgG — иммуноглобулин G.
INF — интерферон.
ISRE — INF-a и —/З-stimulated response element GAS — INF-^-activation site DISC — death-inducing signalling complex PARP — поли-АДФ-рибоза-полимераза.
1.
ВВЕДЕНИЕ
.
Выявление генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, может значительно облегчить раннюю диагностику и создание новых лекарственных противоопухолевых препаратов. Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет ключевую роль в онкогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов и/или как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов. Одним из наиболее интересных с этой точки зрения является сурвивин (BIRC-5), относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза (IAP, Inhibitor of Apoptosis Protein) [1]. Помимо ингибирования апоптоза сурвивин участвует в других клеточных процессах, в частности, в митотическом делении клетки и процессе ангиогенеза.
Ген BIRC5 экспрессируется в процессе эмбрионального развития, но его мРНК и белок не детектируются в конечно дифференцированных нормальных тканях взрослого организма. Тем не менее, его повышенная экспрессия наблюдается в трансформированных клетках и практически во всех типах злокачественных опухолей [1].
Уровень сурвивина в клетках регулируется активностью ряда генов. Одним из природных ингибиторов сурвивина является белок SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC — митохондриальный белок, который выходит в цитозоль во время апоптоза и обеспечивает активацию каспаз за счёт связывания с белками семейства IAP, предотвращая тем самым их ингибирующее действие по отношению к каспазам [2].
Другим известным природным ингибитором сурвивина является белок PML (Promyelocytic Leukemia) [3]. PML — многофункциональный белок, представленный двенадцатью изоформами и участвующий в процессах регуляции транскрипции и трансляции, удлинении теломер, репарации ДНК, а также регуляции клеточной смерти. Потеря гетерозиготности по гену PML или мутации в этом гене присутствуют при многих типах рака различной гистологии, что часто ассоциировано с прогрессией опухоли и неблагоприятным прогнозом [4]. Один из механизмов включения апоптоза с участием PML связан с подавлением активности промотора гена BIRC5. Такая функциональная активность показана только для изоформы PML6, относительно подобной активности других изоформ данные отсутствуют [3].
Таким образом, на основании литературных данных можно сделать вывод о том, что белки PML и SMAC могут быть использованы в противоопухолевой терапии для ингибирования сурвивина, ключевого белка в регуляции апоптоза. Однако, несмотря на значительное количество работ, посвященных исследованию функций этих генов, ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, данные по экспрессии генов SMAC и PML при опухолеобразовании противоречивы, а возможность корреляции повышенной экспрессии BIRC5 в опухолевой ткани с экспрессией генов его ингибиторов SMAC и PML вообще не исследовали. Терапевтический противопухолевый эффект белка SMAC, в том числе его влияние на активность белка сурвивина, в большинстве работ наблюдали при непосредственной обработке клеток препаратом белка [5−7], и лишь в нескольких работах проводили исследование возможности использования генно-инженерных экспрессионных терапевтических конструкций, содержащих кДНК SMAC [8, 9]. Способность подавлять активность промотора BIRC5 и уменьшать количество эндогенного сурвивина в опухолевых клетках была изучена лишь в двух работах и показана только для одной изоформы PML, PML6 [3, 10].
Настоящая работа состоит из двух частей. В первой части проведено исследование экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях пациентов с диагнозами пемелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода, а также в опухолевых клеточных линиях человека. Было определено, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML. Во второй части изучали влияние стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 (наиболее представленной изоформы PML в клетке) на клетки опухолевых клеточных культур человека. Было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358. Транзиентная и стабильная экспрессия последовательности кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PML1, в опухолевых клетках человека вызывает выраженный апоптотический эффект. Цель работы.
Целью данной работы было выявление корреляций между экспрессией сурвивина и его ингибиторов на уровне РНК и белка в нормальных и опухолевых тканях пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода и оценка терапевтического потенциала природных ингибиторов сурвивина SMAC и PML в генной терапии злокачественных опухолей.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Онкологические заболевания являются одной из важнейших причин смертности в мире и их число с каждым годом растет. Нарушение процесса программируемой клеточной гибели, или апоптоза, играет ключевую роль в прогрессии злокачественных опухолей. Процесс апоптоза контролируется большим числом индукторов и ингибиторов [11]. Семейство белков-ингибиторов апоптоза IAPs (Inhibitors of apoptosis proteins) включает в себя белки различного происхождения, способные ингибировать процесс апоптоза путём снижения активности каспаз [12]. Сурвивин (BIRC5) — уникальный белок семейства IAP, который участвует в трёх клеточных процессах (ангиогенез, клеточное деление и процесс апоптоза) и экспрессируется на повышенном уровне практически при всех типах рака [1]. SMAC и PML — природные ингибиторы сурвивина [2, 3], которые могут быть использованы для подавления сурвивина в опухолевых клетках.
5. ВЫВОДЫ.
1. При немелкоклеточном раке легкого человека экспрессия гена BIRC5 повышена в опухолевых тканях по сравнению с прилегающими к опухолям тканями и в здоровых легких не детектируется.
2. При плоскоклеточном раке пищевода человека повышенная экспрессия BIRC5 в большинстве случаев наблюдается как в опухолевых, так и в прилегающих к опухоли тканях, но не в нормальных тканях пищевода.
3. Полученные результаты в сочетании с литературными данными позволяют рассматривать экспрессию гена BIRC5 как диагностический маркер при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода человека.
4. Продемонстрировано, что экспрессия генов природных ингибиторов сурвивина, SMAC и PML, одинакова в нормальных и опухолевых тканях легкого и пищевода. Увеличение экспрессии гена BIRC5 при опухолеобразовании в легком и пищеводе не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML.
5. Стабильная гетерологичная экспрессия SMAC приводит к компенсаторному увеличению количества эндогенного сурвивина и не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358 к противоопухолевому препарату цисплатину.
6. Показано, что С-концевой фрагмент белка PML1 обладает проапоптотической активностью. Интенсивность индукции апоптоза в клеточных линиях в условиях транзиентной трансфекции зависит от статуса р53 и минимальна в клетках с функционально дефектным белком р53. С-концевой фрагмент белка PML1, в отличие от С-копцевого фрагмента PML6, не влияет на активность опухолеспецифического промотора гена BIRC5 человека. Таким образом, С-концевой фрагмент PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении опухолей с функционально активным белком р53.
4.8.
Заключение
.
Полученные в данной работе результаты позволяют утверждать, что ген BIRC5 является надежным маркером при опухолеобразовании у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и плоско клеточным раком пищевода, в то время как гены SMAC и PML не могут быть использованы в качестве диагностических маркеров опухолеобразования. PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении злокачественных опухолей с функционально активным р53, и, в отличие от PML6, его проапототическое действие не связано с подавлением активности промотора гена BIRC5. SMAC не является перспективным агентом в противоопухолевой терапии, по крайней мере для опухолей легкого, поскольку его повышенная экспрессия в раковых клеточных культурах легочного происхождения приводит к компенсаторному увеличению содержания эндогенного сурвивина, который является ингибитором апоптоза.
