Сульфгемоглобин и сульфмиоглобин

РЕФЕРАТ

Cульфгемоглобин и сульфмиоглобин

Хромопротеиды (от греч. chroma — краска) состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента. Различают гемопротеины (содержат в качестве простетической группы железо), магнийпорфирины и флавопротеины (содержат производные изоаллоксазина).

Хромопротеиды наделены рядом уникальных биологических функций: они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и диоксида углерода, окислительно-восстановительные реакции, светои цветовосприятие и др. Хромопротеины играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности.

Наверное, самым известным хромопротеидом является гемоглобин. Гемоглобин — белок эритроцитов, красных кровяных клеток, переносящий молекулярный кислород от легких к тканям в организмах позвоночных животных. Гемоглобин можно считать своего рода модельным белком, структура, свойства и функции которого наиболее полно изучены по сравнению с другими белками на протяжении последних 50 лет. Американский физик Хопфилд назвал его атомом водорода современной биохимии, имея в виду, что изучение гемоглобина сыграло в биохимии ту же роль, что и изучение атома водорода в физике. Гемоглобин называют также почетным ферментом, поскольку исследования его структуры в статике и динамике позволили значительно продвинуться в понимании механизмов функционирования ферментов.

1. Гемоглобин

Гемоглобин, Hb (от др. греч. бiмб — кровь и лат. globus — шар) — сложный белок, хромопротеид, дыхательный пигмент крови человека, позвоночных и некоторых беспозвоночных животных, обладающих кровоснабжением. Основной функцией гемоглобина является перенос О₂ из легких к периферическим тканям, а также обратный процесс, перенос СО₂ и протонов от периферических тканей к дыхательным органам для последующего выведения из организма.

1.1 Строение гемоглобина

Молекула гемоглобина состоит из четырех субъединиц: двух б и двух в — и соответственно содержит четыре полипептидные цепочки двух типов. б-Полипептидная цепь заканчивается комбинацией аминокислот валина-лейцина, а в — полипептидная цепь — комбинацией валина-гистидина-лейцина. Каждая б-цепочка содержит 141, а в-цепочка — 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула гемоглобина включает 574 аминокислоты. Полипептидные цепи в гемоглобиновой молекуле размещены не линейно, как это выглядит на первый взгляд из данных (первичная структура). По причине существования интрамолекулярных сил, полипептидные цепи скручиваются в форме типичной для белков б-геликсовой спирали (вторичная структура). Сама б-геликсовая спираль на каждую би в-полипептидную цепь огибается пространственно, образуя сплетения овоидной формы (третичная структура). Все четыре третично изогнутые би в-полипептидные цепи располагаются пространственно в определенном соотношении (четвертичная структура), которые связаны между собой межмолекулярными силами.

Собственно говоря, приведенные выше детали структуры относятся не к гемоглобину, а к его белковой компоненте — глобину. Каждая субъединица гемоглобина содержит одну небелковую (простетическую) группу — гем. Гем представляет собой циклический ферротетрапиррол, представленный в виде Fe (II) протопорфирина IX (Рис. 1.)

Рис. 1. Структура протопорфирина IX и гема Атом железа может образовать шесть координационных связей. Четыре связи направлены к атомам азота пиррольных колец, оставшиеся две связи — перпендикулярно к плоскости порфиринового кольца по обе его стороны. Гемы расположены вблизи поверхности белковой глобулы в специальных карманах, образованных складками полипептидных цепочек глобина (Рис. 2). Присутствие гема в протеине объясняет его красный цвет ^[1].

Рис. 2. Структурная модель гемоглобина человека

(б — (красная) и в — (синяя) полипептидные цепи; зеленым показаны расположения гемов)

Структура гемоглобина стала известна благодаря исследованиям английского биофизика Макса Перутца, за которые в 1962 году он был удостоен Нобелевской премии по химии.

Гемоглобин при нормальном функционировании может находиться в одной из трех форм: феррогемоглобин (обычно называемый дезоксигемоглобином или просто гемоглобином), оксигемоглобин и ферригемоглобин (называемый также метгемоглобином). В феррогемоглобине железо находится в закисной форме Fe (II), одна из двух связей, перпендикулярных к плоскости порфиринового кольца, направлена к атому азота гистидинового остатка, а вторая связь свободна. Кроме этого гистидинового остатка, называемого проксимальным (соседним), по другую сторону порфиринового кольца и на большем расстоянии от него находится другой гистидиновый остаток — дистальный гистидин, не связанный непосредственно с атомом железа. Взаимодействие молекулярного кислорода со свободным гемом приводит к необратимому окислению атома железа гема [Fe (II) > Fe (III); гем > гемин]. В дезоксигемоглобине глобин предохраняет железо гема от окисления.

1.2 Оксигенация

Перенос О₂ из легких к периферическим тканям или оксигенация, т. е. процесс обратимого присоединения кислорода, позволяющий гемоглобину выполнять свою основную функцию переносчика, обеспечивающий возможностью образовать прочные пятую и шестую координационные связи и перенести электрон на кислород не от железа (то есть окислить Fe²⁺), а от имидазольного кольца проксимального гистидина.

Выше было сказано, что одна молекула гемоглобина содержит четыре субъединицы и, следовательно четыре гема, каждый из которых может обратимо присоединить одну молекулу кислорода. Поэтому реакцию оксигенации можно разделить на четыре стадии:

Hb + O₂ > HbO₂ (1.1)

Hb + O₂ > Hb (O₂)₂ (1.2)

Hb + O₂ > Hb (O₂)₃ (1.3)

Hb + O₂ > Hb (O₂)₄ (1.4)

Процесс оксигенации характеризуется так называемой кривой оксигенации, связывающей степень насыщения гемоглобина кислородом (в процентах) с парциальным давлением последнего, (мм рт. ст.). Типичные кривые оксигенации гемоглобина и миоглобина (при условии достижения химического равновесия) приведены на Рис. 3.

Рис. 3. Кривые оксигенации гемоглобина и миоглобина Между гемами одной молекулы гемоглобина существует некоторая связь, благодаря которой присоединение кислорода к одному гему влияет на присоединение кислорода к другому гемму той же молекулы. Это явление получило название гем-гем взаимодействия. Физиологический смысл гем-гем взаимодействия очевиден. Количество кислорода, связывающегося с гемоглобином («процент насыщения»), зависит от концентрации кислорода в среде, непосредственно окружающей молекулу белка (эту концентрацию выражают как — парциальное давление кислорода). Сигмоидная форма кривой диссоциации создает условия максимальной отдачи кислорода при переносе гемоглобина от легких с высоким значением к тканям с низким значением. Для человека значения артериальной и венозной крови в нормальных условиях (T = 37 °C, pH 7,4) равны соответственно 100 и 40 ммHg. При этом (см. Рис. 3) гемоглобин отдает тканям 23% связанного кислорода (степень оксигенации меняется от 98 до 75%).

Следует отметить, что первые молекулы кислорода соединяются в основном с молекулами гемоглобина, еще не содержащими кислорода, и гемы таким образом оксигенируются независимо. Это свидетельствует о том, что гем-гем взаимодействие обусловлено не просто наличием нескольких гемов в молекуле, а тем, что после оксигенации одного гема меняются условия оксигенации других гемов той же молекулы.

Таким образом, для гемоглобина характерен кооперативный эффект связывания (когда при присоединении лиганда к одному из активных центров «фермента» присоединение последующих лингандов к остальным активным центрам облегчается), который характеризуется коэффициентом Хилла (n). Он может принимать следующие значения^[I]:

n > 1 — положительный кооперативный эффект: присоединение одной молекулы лиганда к активному центру фермента увеличивает сродство к лиганду остальных активных центров.

n < 1 — отрицательный кооперативный эффект: присоединение одной молекулы лиганда к активному центру фермента уменьшает сродство к лиганду остальных активных центров.

n = 1 — отсутствие кооперативного эффекта: сродство фермента к лиганду не зависит от уже присоединённых молекул лиганда.

Для гемоглобина человека n ~ 3.

1.3 Транспорт двуокиси углерода

Присоединение кислорода меняет кислотно-основные свойства гемоглобина. Оксигемоглобин является более сильной кислотой, чем дезоксигемоглобин. Поэтому в тканях, где значительная часть гемоглобина теряет кислород и становится более сильным основанием, гемоглобин связывает образующуюся в ходе метаболических внутриклеточных процессов углекислоту. В альвеолах легких дезоксигемоглобин снова превращается в оксигемоглобин, становится более сильной кислотой и способствует отщеплению СО₂. Это слегка упрощенное описание важного процесса транспорта углекислоты эритроцитами. Углекислота, освобождаемая тканями, недостаточно хорошо растворима для эффективного переноса. С помощью фермента карбоангидразы, ускоряющего прямую и обратную реакцию двуокись углерода превращается в хорошо растворимый бикарбонат-анион:

CO₂ + H₂O HCO₃ + H⁺ (1.6)

В капиллярах тканей отщепление кислорода повышает содержание дезоксигемоглобина, связывающего протоны и смещающего, таким образом, равновесие реакции (1.6) вправо. Легко растворимый ион бикарбоната переносится кровью. В альвеолах легких гемоглобин оксигенируется, протоны освобождаются и равновесие смещается влево. Образуется плохо растворимая двуокись углерода СО₂, которая удаляется из водной фазы и выдыхается. Таким образом, гемоглобин работает как буфер с переменным значением рК^[1].

1.4 Дефекты гемоглобина

При взаимодействии молекулярного кислорода с гемоглобином существует небольшая, но конечная вероятность окисления последнего: молекула О₂ не присоединится, но окислит железо: Fe²⁺ + О₂ > Fe³⁺ + О₂— Поэтому при дыхании в эритроцитах непрерывно образуется метгемоглобин. Для его восстановления в эритроците существует специальная ферментативная система, восстанавливающая метгемоглобин и превращающая его в нормальный дезоксигемоглобин. При нарушении этой системы возникает тяжелое заболевание — метгемоглобинемия, при котором гемоглобин перестает быть переносчиком кислорода.

Гены, ответственные за синтез гемоглобина, могут подвергаться мутациям, меняющим структуру и функции белка. Наиболее изучена мутация, приводящая к замене только одной аминокислоты в полипептидных цепочках в-субъединиц гемоглобина. Замена глутамина на валин ведет к тяжелой болезни — серповидноклеточной анемии: эритроциты принимают форму серпа (Рис. 4.) и теряют способность переносить кислород ^[2].

Рис. 4. Электронные микрофотографии нормального (А) и серповидного (Б) эритроцитов При приеме человеком лекарственных средств, содержащие сульфаниламиды, а также при долгом контакте с соединениями серы, возможно, развитие сульфгемоглобинемии, при которой, образованный по разным причинам H₂S взаимодействует с гемом гемоглобина, меняя его структуру и нарушая способность связывания кислород.

Более подробно об этом речь пойдет во второй части работы.

2. Миоглобин

Миоглобин, Mb (от др. греч. myos — кровь и лат. globus — шар) -, хромопротеин, сложный белок поперечнополосатых мышц, содержащий одну молекулу гема и одну полипептидную цепочку, состав и структура которой подобны составу и структуре в-субъединицы гемоглобина (Рис. 5). Как и для гемоглобина, важнейшей функцией миоглобина является обратимое присоединение молекулярного кислорода.

Рис. 5. Структурная модель миоглобина человека В условиях кислородного голодания (например, при сильной физической нагрузке) кислород высвобождается из комплекса с миоглобином и поступает в митохондрии мышечных клеток, где осуществляется синтез АТР.

Для миоглобина кривая оксигенации (Рис. 3) является гиперболой, как и должно быть в случае одностадийной химической реакции при условии достижения химического равновесия:

Mb + O₂ > MbO₂ (2.1)

При отсутствии гем-гем взаимодействия для одногемового миоглобина (Рис. 3) величина в ткани, окружающей легочные капилляры, составляет 100 мм рт. ст., поэтому миоглобин в легких мог бы весьма эффективно насыщаться кислородом. В венозной крови равно 40 мм рт. ст., а в активно работающей мышце — около 20 мм рт. ст. Но даже при парциальном давлении 20 мм рт. ст. степень насыщения миоглобина кислородом будет весьма значительной, и поэтому миоглобин не может служить средством его доставки от легких к периферическим тканям. Однако при кислородном голодании, которым сопровождается тяжелая физическая работа, в мышечной ткани может понизиться и до 5 мм рт. ст.; при столь низком давлении миоглобин легко отдает связанный кислород, обеспечивая тем самым окислительный синтез АТР в митохондриях мышечных клеток ^{[1, 2]}.

3. Сероводород и гемпротеины

Сероводород (H₂S) является хорошо известным ядовитым газом, цитотоксические эффекты которого изучались в течение долгого времени. В физиологических условиях ~ 30% H₂S находится в недиссоциированном состоянии, а ~ 70% диссоциирует на гидросульфид ион (см. 3.1). Механизм его токсичности основан на мощном торможении митохондриальной цитохром С-оксидазы.

H₂S — H⁺ + HS-, pK_a = 6,8 (3.1)

H₂S растворим в воде и может проникать в клетки всех типов путем простой диффузии. Именно это свойство, которое делает H2S широкого спектра токсикантов. Интересно, что открытие того, что человеческое тело естественно производит H₂S резко изменил репутацию этого газа из токсичных загрязнителей в биологически важные молекулы. H₂S в настоящее время считается важным физиологическим посредником с широким разнообразием функций, включая регулирование нейронной активности и мышечной релаксации, оказывает сосудорасширяющее действие.

Важнейшими, с точки зрения физиологии, считаются реакции сероводорода с простетическими группами гемопротеинов (гемоглобинов, миоглобина, цитохромов и др.).

Схема 1.

H₂S взаимодействует с гемом, преимущественно координируясь на трехвалентное железо (Fe^III), образуя стабильный Fe^III-SH2 комплекс Возможно образование и Fe^II-SH₂ комплекса, который является промежуточным соединением, быстро переходящее в двухвалентного железа (Fe^II) (см. Схема 1.). H₂S также может реагировать с оксигенированным гемом (Fe^II-O₂), с образованием Fe^III-SH₂, вероятнее всего нуклеофильным замещением связанного супероксида. Реакция H₂S с гемом также может изменить его структуру, с образованием сульфгем-комплексов ^{[3, 4, 5]}.

4. Сульфгемоглобин и сульфмиоглобин

Сульф-гемпротеиды — группа гемпротеидов, в которых в качестве простетической группы выступает сульфгем, полученный в результате аналогичных реакций протогема с H₂S ^[6]. Данное взаимодействие приводит к конверсии гемоглобинов в белок ярко-зеленого цвета с характерными полосами поглощения в оптических спектрах 618 — 620 нм (Рис. 5).

Рис. 5. ЭСП сульфгемоглобина Представителями данной группы являются сульфгемоглобин и сульфмиоглобин — неактивные формы дыхательных белков зеленого цвета. Впервые были обнаружены в 1863 году Хоуп-Сейлером, который наблюдал образование зеленого пигмента при воздействии на белки H₂S в присутствии кислорода^[7].

Выше было указано, что за цвет хромопротеидов отвечает их простетическая группа, роль которой в гемоглобине играет гем. Поэтому ответ о наличие ярко-зеленой окраски cульф-гемпротеидов следует искать в структуре сульфгема.

4.1 Сульфгем. Строение

Несмотря на то, что образование сульф-гемпротеидов было обнаружено еще в 1863 году, долгое время точная структура их простетической группы (сульфгема) была неизвестна. Однако было известно, что изменение цвета вызывает наличие дополнительного атома S в структуре гема. С течением времени были предложены различные его модификации (Рис. 6).

Структура Fe-S (Рис. 6, 1) была исключена, так как наличие серы в качестве лиганда не приводит к изменению спектра в видимой области. Так же стал известен тот факт, что сульфгем способен связывать ряд экзогенных лигандов (цианиы, гидроксид, оксид углерода), но при этом все же сохранили характерный зеленый цвет. Изменение цвета гема дает понять, что было нарушено сопряжение системы внутреннего ядра р электронов порфиринового макроцикла. Поэтому также была исключена модификация только заместителей (Рис. 6, 2), которые являются аналогом тиоловых гематопорфиринов. Нахождение атома S в позиции мезо (Рис. 6, 3, либо таутомер 4), также маловероятно, поскольку оксо — (oxophlorins) или тиафлорины (thiaphlorins) с серой не имеют схожих видимых спектров к сульфгему. Позднее было установлено, что видимый спектр сульфгема наиболее похож на феррохлорин. Феррохлорин — ферропорфирин, в котором один из пирролов является пирролином (частично насыщенный по двойной связи пиррол). Такое сопряжение макро-кольца было доказано ЯМР-исследованиями, которые так же показали, что один атомом S ковалентно связывается с гемом, образуя сульфгем (Berzofsky и соавт., 1972а). Отсутствие включения трития, казалось, исключает структруру 5. Основным камнем преткновения в характеристике сульфгема стала его крайняя нестабильность, при отщеплении от белка. Несмотря на это, сульф-гемпротеиды являются достаточно стабильными белками, извлеченный сульфгем быстро разлагается до протопорфирина IX. Структура (Рис. 6, 6) эписульфида оказалась наилучшей из всех рассмотренных гипотез для объяснения структуры сульфгема, так как оказалось, что это хлорин содержащий один атом S, предположительно в достаточно напряженной части, которая внешние по отношению к белку может вернуться к исходному порфирина^[8].

Рис. 6. Предполагаемые модификации сульфгема Ключевым прорывом стало открытие, что сульфгем, существует различных формах. Это было впервые обнаружено ЯМР-исследованиями сульфмиоглобина (Timkovich и Вавра, 1985). Предполагается, что первым продуктом модификации гема является кинетически предпочтительный вид 1 (Рис. 7), который постепенно переходит в термодинамически более стабильную форму с течением времени (Рис. 7, 2). Третья форма 3 образуется путем циклизации в кольце пиррола В 4-винил группы с одним атомом S с образованием 5-ти членного цикла — 2,5 — дигидротиофена. Следует отметить, что в образовании сульфгема важную роль играет гистидиновый остаток активного центра гемоглобина — дистальный гистидин, не связанный непосредственно с атомом железа (Рис. 7) ^{[3], [9]}.

Рис. 7. Активный центр миоглобина, связанный с кислородом (слева) и сульфмиоглобин (справа) Таким образом, можно сделать вывод о неоднородности строения сульфгема.

Рис. 8. Структура сульфгема Отметим, что ни гемоглобин, ни миоглобин не могут быть вновь получены из сульф-форм естественными механизмами в эритроцитах ^[3].

4.2 Связывание с кислородом

Включение атома серы в макро-кольцо гема и образование хлорина способствует перераспределению электронной плотности от двухвалентного железа к периферии кольца хлорина, что снижает сульфгема к молекуле кислорода. Коэффициент Хилла для сульфгемоглобина равен 1.

Последующие исследования показали, что на самом деле, сульфгем-протеины способны связывать обратимо кислород, но с более низкой аффинностью, чем немодифицированные белки. Отметим, что связывание кислорода в сульфмиоглобином в 2500 раз, а случае сульфгемоглобина в 135 раз меньше, по сравнению с нативными гем-протеидами^{[3], [10]}.

гемоглобин оксигенация сульфагем

4.3 Сульфгемоглобинемия

Выше уже говорилось о таком заболевании, как сульфгемоглобинемия, при которой, образованный по разным причинам H₂S взаимодействует с гемом гемоглобинов, меняя его структуру. Подобная конверсия приводит к нарушению способности гемоглобина связывать кислород.

Сульфгемоглобанемия достаточно редкое заболевание, симптомы которого выражаются в голубоватом или зеленом оттенках цвета крови, кожи и слизистых оболочек. Причиной возникновения данного состояния, как правило, является прием лекарственных средств, содержащих сульфаниламиды и сульфасалазин (например, суматриптана). Другой возможной причиной является постоянные контакты с соединениями серы связанные с профессиональной деятельностью^[II].

Известны тяжелые случаи сульфгемоглобанемии. Так летом 2008 года в больницу Святого Павла канадского города Ванкувер поступил 42-летний мужчина, с тяжелым случаем синдромом сдавливания нижних конечностей. Пациент был направлен в операционную, где перед началом операции у него был взят анализ крови. Какого же было удивление врачей, когда они обнаружили, что кровь пациента имела зеленый цвет. Образец крови был направлен в лабораторию, где было установлено, что причиной зеленой крови является сульфгемоглобанемия, вызванная передозировкой суматриптана.

Список использованной литературы и информации

1. Блюменфельд, Л. А. Гемоглобин // Соросовский образовательный журнал. — 1998. — № 4 — C. 33−38.

2. Марри, Р. К. Биохимия человека: в 2-х томах / Роберт К. Марри, Дерил К. Граннер, Питер А. Мейес, Виктор В. Родуэлл; под общ. ред. Л. М. Гинодмана; Т. 1. Пер. с англ.: — М.: Мир, 1993. — 384 с., ил. — C. 52 — 61.

ISBN 5−03−1 774−7

3. Pietri, R. Hydrogen Sulfide and hemeproteins: knowledge and mysteries / R. Pietri, E. Roman-Morales, J. Lуpez-Garriga // Forum review. — 2010. — P. 1−47.

4. Szabу, C. Hydrogen sulphide and its therapeutic potential / C. Szabу // Nature reviews. — 2007. — Vol. 6. — Р. 917 — 935.

5. Kabil, O. Redox Biochemistry of Hydrogen Sulfide / O. Kabil, R. Banerjee // J. Biol. Chem. — 2010. — Vol. 285. — № 29. — P. 21 903;21907.

6. Berzofsky, J.A. Sulfheme Proteins. Part I. Optical and magnetic properties of sulfmyoglobin and its derivatives / J.A. Berzofsky, J. Peisach, W.E. Blumberg // J. Bio. Chem. — 1971. — Vol. 246 — № 10 — P. 3367−3377.

7. Sykes A.G. Advances in inorganic chemistry / A.G. Sykes, Volume 51. — Academic Press. San Diego, California, 2001. — P 37−39. — ISBN 0−12−236 571−6

8. Bondoc, L.L. Structure of a Stable Form of Sulfheme / L.L. Bondoc, Mei-Hing Chau, Mary Ann Price, R. Timkovich // Biochemistry — 1986. — Vol. 25 — P. 8458−8466.

9. Chatrield, M.J. Proton NMR Characterization of Isomeric Sulfmyoglobins: Praparation, Interconvertion, Reactivity Patterns and Structural Features / M.J. Chatrield, G.N. La Mar, R.J. Kauten // Biochemistry — 1987. — Vol. 26 — № 22 — P. 6939−6949.