Экспериментальная ДНК-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека

7. Выводы.

1. На основании результатов выполненного компьютерного анализа показано, что вирионные белки A30L, A36R, B7R, F8L и MIR ВНО отличаются по 1, 3, 4, 2 и 1 потенциальной антигенной детерминанте от их ортологов ВОВ и сделано заключение о необходимости использования генов вируса натуральной оспы для создания ДНК-вакцины против натуральной оспы.

2. Создан набор рекомбинантных плазмид на основе векторной плазмиды pBKRSV, несущей гены A4L, A30L, A36R, B7R, F8L, I5R, MIR и M4R ВНО под контролем промотора из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, и на основе векторной плазмиды pcDNA3.1, несущей гены A30L, A36R, B7R, F8L и MIR ВНО под контролем промотора цитомегаловируса.

3. Показано, что ген F8L ВНО в составе ДНК-вакцины с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса наиболее эффективен при внутрибрюшинном способе иммунизации, а в составе ДНК-вакцины с промотором цитомегаловируса наиболее эффективен при внутрикожном способе иммунизации.

4. Показано, что изменение кодонового состава гена A3 OL ВНО, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, не оказывает влияния на протективную эффективность ДНК-вакцины.

5. Показано, что ДНК-вакцины на основе индивидуальных генов MIR, A30L и F8L ВНО под контролем промотора цитомегаловируса при внутрикожном способе иммунизации вызывают наработку ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивают 25, 33 и 40% защиту мышей от инфицирования вирусом эктромелии в дозе IOLD50, соответственно.

6. Показано, что экспериментальная ДНК-вакцина на основе смеси рекомбинантных плазмид, содержащих гены пяти антигенов ВНО — A3 OL, F8L, MIR поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов и A36R и B7R оболочки внеклеточной формы вируса, вызывает наработку высоких титров ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивает полную защиту мышей от инфицирования вирусом эктромелии в дозе IOLD50.

6.

Заключение

.

Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae вкл ючает такие патогенные для человека виды как вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Массовая вакцинация традиционной вакциной на основе ВОВ защищала людей не только от ВНО, но и от близкородственных BOO и ВОК (Маренникова и Щелкунов, 1998). После 1980 года в результате повсеместного прекращения иммунизации против ВНО, доля населения, чувствительного к ВНО и другим патогенным для человека ортопоксвирусам, постоянно увеличивается. Об этом свидетельствуют участившиеся многочисленные вспышки ортопоксвирусных инфекций среди людей такими вирусами как BOO, ВОК и ВОВ (Stephenson, 2003; Lewis-Jones, 2004; Campe et al, 2009; Ninove et al, 2009). Кроме того, ВНО рассматривают как возможный агент биотеррористических атак, которые могут иметь катастрофические последствия для всего населения Земли (Онищенко и др., 2000; Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002). Отсутствие эффективных противовирусных препаратов и опасность использования классической живой вакцины на основе ВОВ из-за большого числа тяжелых поствакцинальных осложнений, требует незамедлительной разработки современных безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций.

За последние несколько лет были определены иммуногенные и протективные антигены поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов (например, A27L, D8L и L1R) и оболочки внеклеточных форм ВОВ (например, A33R и B5R), вызывающие наработку вируснейтрализующих антител и обеспечивающих защиту против ортопоксвирусной инфекции. Показано, что различные комбинации указанных антигенов в формате белковой субъединичной вакцины и/или ДНК-вакцины обеспечивают защиту мышей против вируса осповакцины (Hooper et al, 2000; Hooper et al., 2003; Fogg et al., 2004; Pulford et al., 2004; Sakhatskyy et al, 2006; Fogg et al., 2007; Xiao et al, 2007; Berhanu et al, 2008) и против вируса эктромелии (Xiao et al, 2007), и защиту нечеловекообразных приматов от вируса оспы обезьян (Hooper et al, 2004; Heraud et al., 2006).

Несмотря на успех в разработке белковых субъединичных вакцин и ДНК-вакцин против ортопоксвирусных инфекций, во всех предыдущих работах источником генетического материала для антигенов являлся вирус осповакцины или вирус оспы обезьян, но не вирус натуральной оспы, против которого и создавалась вакцина. Хотя ортопоксвирусы высококонсервативны по генам, кодирующим протективные антигены, и вакцинация человека вирусом осповакцины приводит к защите от инфекции всех ортопоксвирусов, патогенных для человека, известно, что только люди, переболевшие натуральной оспой, приобретают против нее пожизненный иммунитет (Маренникова и Щелкунов, 1998). Производство белковой субъединичной вакцины или ДНК-вакцины не включает работы с живым вирусом и поэтому снимает вопросы безопасности относительно использования антигенов вируса натуральной оспы.

В недавней работе (Aldaz-Carroll et al, 2007) было обнаружено минимум три ВОВ-нейтрализующих моноклональных антитела, специфичных белку B5R ВОВ, не оказывающих нейтрализующего эффекта на вирус натуральной оспы. Это подтверждает, что гуморальный иммунный ответ, индуцированный антигенами ВОВ, не сможет обеспечить такой высокий уровень защиты против натуральной оспы как индуцированный антигенами ВНО.

Поэтому целью данного исследования было получение и изучение свойств экспериментальной ДНК-вакцины на основе генов ВНО против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека.

Для достижения этой цели на первом этапе работы провели углубленный сравнительный анализ аминокислотных последовательностей протективных антигенов ВНО и их ортологов BOB', ВОК, BOO и ВЭ, выявили различия по потенциальным антигенным детерминантам. При этом для генов A36R, B7R, A4L и I5R ВНО имеются значительные различия по антигенным детерминантам по сравнению с их ортологами ВОВ. Выявленные нами различия по антигенным детерминантам между иммуногенами ВНО и их ортологами других ортопоквирусов говорят о необходимости использования генов ВНО, нежели ВОВ, для разработки эффективной ДНК-вакцины против натуральной оспы. При этом наличие совпадающих антигенных детерминант между белками ВНО и ВЭ и способность ортопоксвирусов обеспечивать перекрестный иммунный ответ, позволило нам исследовать протективную эффективность ДНК-вакцины на моделе мышей и высокопатогенном для них вирусе эктромелии.

На следующем этапе работы мы сконструировали 8 рекомбинантных плазмид, на основе вектора pBKRSV, экспрессирующих под контролем промотора вируса саркомы Рауса различные белки ВНО: три белка сердцевины вириона (A4L, M4R и I5R), три белка поверхностной мембраны IMV (A30L, F8L и M1R) и два белка оболочки EEV (A36R и B7R). В эксперименте по проверке иммуногенности было установлено, что ДНК-вакцина, содержащая ген вируса натуральной оспы F8L, при двукратном внутрибрюшинном введении мышам индуцирует специфический клеточный и гуморальный иммунный ответ против ВОВ.

На эффективность ДНК-вакцины в значительной степени влияют используемый эукариотический промотор для экспрессии антигена и способ иммунизации (Doria-Rose and Haigwood, 2003). Поэтому в рамках продолжения работы по созданию ДНК-вакцины мы провели определение оптимального способа иммунизации в зависимости от использованного промотора для эукариотической экспрессии на примере гена F8L ВНО в плане развития протективного иммунного ответа на модели мышей и высокопатогенного для них вируса эктромелии. Для этого дополнительно была сконструирована рекомбинантная плазмида, на основе вектора pcDNA, экспрессирующая ген F8L ВНО под контролем цитомегаловирусного промотора. Мыши были иммунизированы внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно или подкожно препаратами ДНК-вакцин, эукариотическая экспрессия гена F8L в которых осуществляется под контролем RSV или CMV промоторов. Защитный эффект анализируемых вакцин проверяли в эксперименте инфицированием иммунизированных экспериментальных животных вирусом эктромелии в дозе 10 LD50. Все группы были частично защищены от летальной ортопоксвирусной инфекции, кроме мышей, иммунизированных внутримышечно. При этом ДНК-вакцина с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса была наиболее эффективна при внутрибрюшинном способе иммунизации, а ДНК-вакцина с промотором цитомегаловируса и тем же геном иммунодоминантного белка ВНО наиболее эффективна при внутрикожном способе иммунизации.

IIa повышение эффективности ДНК-вакцины также может оказывать влияние оптимизация кодонового состава генов протективных вирусных антигенов, приводящая к увеличению синтеза вирусного белка в клетках млекопитающих (Haas et al, 1996; Wang et al., 2006). Учитывая то, что весь цикл развития ортопоксвируса проходит в цитоплазматических образованиях, называемых виросомами или вирусными фабриками, а вирусная ДНК имеет более низкий GC состав по сравнению с геномом клеток млекопитающих (Маренникова и Щелкунов, 1998), важно было проверить, можно ли значительно увеличить эффективность разрабатываемой вакцины против натуральной оспы в результате оптимизации кодонового состава оргопоксвирусного гена для его экспрессии в ядре клеток млекопитающих. Поэтому следующей задачей являлось сравнение эффективности ДНК-вакцин на основе природного гена A30L ВНО и искусственного гена A30Lopt с измененным кодоновым составом, оптимизированным для экспрессии в клетках млекопитающих. Для этого были сконструированы рекомбинантные плазмиды, на основе вектора pcDNA, экспрессирующие под контролем CMV промотора природный ген A3 0L ВНО и искусственный гена A30Lopt, предварительно синтезированный методом ПЦР из длинных олигонуклеотидов. В эксперименте на животных было показано, что обе ДНК-вакцины вызывали наработку ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивали частичную защиту от инфицирования летальной дозой вируса оспы мышей. При этом ДНК-вакцина на основе гена А30Ьор (с оптимизированным кодоновым составом не обеспечивала статистически достоверных более высоких титров ВОВ-специфичных и ВОВ-нейтрализующих антител и большую защиту против инфекции, что свидетельствует о нецелесообразности оптимизации кодонового состава остальных генов ВНО, входящих в состав противооспенной поливалентной ДНК-вакцины.

Из ранее исследованных нами восьми генов ВНО, мы выбрали наиболее перспективные три гена поверхностной мембраны 1МУ (АЗОЬ, Р8Ь и М1Я) и два гена оболочки ЕЕУ (А3611 и В7К) для создания комбинированной поливалентной ДНК-вакцины. Оценку иммуногенности и протективной эффективности проводили для двух вариантов поливалентной ДНК-вакцины: на основе вектора рВККЭУ при внутрибрюшинном способе иммунизации и на основе вектора рсОИА при внутрикожном способе иммунизации. Указанные комбинации промотора и способа иммунизации были определены нами ранее как наиболее эффективные. В эксперименте на животных было установлено, что оба варианта поливалентной ДНК-вакцины на основе генов АЗОЬ, 178Ь, М111, АЗ611 и В7К. ВНО, наравне с живым вирусом осповакцины, вызывают наработку высоких титров ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивают полную защиту животных против летальной дозы высокопатогенного вируса эктромелии.

1. Лебедев К. А., Понякина И. Д. Иммунограмма в клинической практике. М.: Наука. -1990.

2. Максютов З. А., Максютов А. З. Пакет программ ADEPT: средство разработки новых методов предсказания белковых антигенных детерминант. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2004. — Т. 8. — № 2. — С. 71.

3. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир. — 1984. — С. 480.

4. Маренникова С. С., Щелкунов С. Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. -Москва: КМК Scientific Press Ltd. 1998. — С. 386.

5. Методические рекомендации. Натуральная оспа (клиника, лечение, иммунопрофилактика). — Москва: ФМБА. 2006. — 60 с.

6. Онищенко Г. Г., Сандахчиев Л. С., Нетесов С. В., Щелкунов С. В. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза. // Журн. микробиол. 2000. — Т. 6. — С. 83−85.

7. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. 2000. — 582 с.

8. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Сибирское Университетское Издательство. 2010. — 514 с.

9. Agrawal S., Gupta S., Agrawal A. Vaccinia virus proteins activate human dendritic cells to induce T cell responses in vitro. // Vaccine. 2009. — V. 27. — P. 88−92.

10. Akbari O., Panjwani N., Garcia S., Tascon R., Lowrie D., Stockinger B. DNA vaccination: transfection and activation of dendritic cells as key events for immunity. // J. Exp. Med. -1999.-V. 189.-P. 169−178.

11. Amer M., El-Gharib I., Rashed A., Farag F., Emara M. Human cowpox infection in Sharkia Governorate. // Egypt. Int J Dermatol. 2001. — V. 40. — № 1. — P. 14−17.

12. Anon. Note for guidance on the development of vaccinia virus based vaccines against smallpox. In: C.f.P.M.P.T.E.A.f.t.E.o.M. Products (Ed.), Evaluation of Medicines for Human Use 2002. — P. 1−19.

13. Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. — 1998. V. 244. — № 2. — P. 365−396.

14. Baroudy B.M., Moss B. Sequence homologies of diverse length tandem repetitions near ends of vaccinia virus genome suggest unequal crossing over. // Nucleic Acids Res. — 1982.-V. 10.-P. 5673−5679.

15. Baxby D., Bennett M., Getty B. Human cowpox 1969;93: a review based on 54 cases. // Br. J. Dermatol. 1994. — V. 131. — P. 598−607.

16. Benvenisti L., Rogel A., Kuznetzova L., Bujanover S., Becker Y., Stram Y. Gene gun-mediate DNA vaccination against foot-and-mouth disease virus. // Vaccine. 2001. — V. 19.-P. 3885−3895.

17. Blackford S., Roberts D.L., Thomas P.D. Cowpox infection causing a generalized eruption in a patient with atopic dermatitis. // Br. J. Dermatol. 1993. — V. 129. — P. 628−629.

18. Blasco R., Moss B. Role of cell-associated enveloped vaccinia virus in cell-to-cell spread. // J. Virol. 1992. — V. 66. — P. 4170—4179.

19. Bojak A., Hammer D., Wolf H., Wagner R. Muscle specific versus ubiquitous expression of Gag based HIV-1 DNA vaccines: a comparative analysis. 11 Vaccine. 2002. — V. 20. — P.1975;1979.

20. Bojak A., Wild J., Wolf H., Wagner R. Efficiency of a myogenic DNA vaccine is strictly dependent upon cellular localization of HIV-1 Pr55. // Vaccine. 2002b. — V. 20. — P. 1980;1984.

21. Bray M., Buller M. Looking back at smallpox. // Clin. Infect. Dis. 2004. — V. 38. — P. 882−889.

22. Breman J.G., Henderson D.A. Current concepts: diagnosis and management of smallpox. // N. Engl. J. Med. 2002. — V. 346. — P. 1300−1308.

23. Campe H., Zimmermann P., Glos K., Bayer M., Bergemann H., Dreweck C., Graf P., Weber B.K., Meyer PI., Biittner M., Busch U., Sing A. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, Germany. // Emerg. Infect. Dis. 2009. — V. 15. — P. 777−780.

24. Carletti F., Bordi L., Castilletti C., Di Caro A., Falasca L., Gioia C. Cat-to-human orthopoxvirus transmission northeastern Italy. // Emerg. Infect. Dis. 2009. — V. 15. — P. 499−500.

25. Chapman B.S., Thayer R.M., Vincent K.A., Haigwood N.L. Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells. //Nucleic Acids Res. 1991. — V. 19. — P. 3979−3986.

26. Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate. // J. Virol. 1998. — V. 72. — P. 1577−1585.

27. Committee on Infectious Diseases. American Academy of Pediatrics. Smallpox vaccine. // Pediatrics. 2002. — V. 110. -№ 4. — 841−845.

28. Dai K., Liu Y., Liu M., Xu J., Huang W., Huang X., Liu L., Wan Y., Hao Y., Shao Y. Pathogenicity and immunogenicity of recombinant Tiantan Vaccinia Virus with deleted C12L and A53R genes. // Vaccine. 2008.

29. Damaso C.R., Esposito J.J., Condit R.C., Moussatche N. An emergent poxvirus from humans and cattle in Rio de Janeiro State: Cantagalo virus may derive from Brazilian smallpox vaccine. // Virology. 2000. — V. 277. — № 2. — P. 439−449.

30. Damon I.K., Roth C.E., Chowdhary V. Discovery of monkeypox in Sudan. // N. Engl. J. Med. 2006. — V. 355. — № 9. — P. 962−963.

31. Davis M.G., Huang E.S. Transfer and expression of plasmids containing human cytomegalovirus immediate-early gene 1 promoter-enhancer sequences in eukaryotic and prokaryotic cells. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1988. — V. 10. — P. 6−12.

32. Demkowicz W.E., Maa J.S., Esteban M. Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. // J. Virol. 1992. — V. 66. — P. 386−398.

33. Denes B., Gridley D.S., Fodor N., Takatsy Z., Timiryasova T.M., Fodor I. Attenuation of a vaccine strain of vaccinia virus via inactivation of interferon viroceptor. // J. Gene Med. -2006.-V. 8.-P. 814−823.

34. Doria-Rose N.A., Haigwood N.L. DNA vaccine strategies: candidates for immune modulation and immunization regimens. // Methods. 2003. — V. 31. — P. 207−216.

35. Empig C., Higgins K., Edghill-Smith Y., Silvera P. Attenuated smallpox vaccine LC16m8 protects Cynomolgus monkeys from Lethal IV monkeypox-zaire challenge. Washington: ASM-Biodefence. 2006b.

36. Ennis F.A., Cruz J., Demkowicz W.E., Rothman A.L., McClain D.J. Primary induction of human CD8+ cytotoxic T lymphocytes and interferon-gamma-producing T cells after smallpox vaccination. // J. Infect. Dis. 2002. — V. 185. — № 11. — P. 1657−1659.

37. Ertl P.F., Thomsen L.L. Technical issues in construction of nucleic acid vaccines. // Methods.-2003.-V. 31.-P. 199−206.

38. Feltquate D.M., Heaney S., Webster R.G., Robinson H.L. Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. // J. Immunol. -1997.-V. 158.-P. 2278−2284.

39. Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. // World Health Organization: Geneva. 1988.

40. Fenner F. Risks and benefits of vaccinia vaccine use in the worldwide smallpox eradication campaign. // Res. Virol. 1989. -V. 140. -№ 5. -PP. 465−466, 487−491.

41. Flexner C., Hugin A., Moss B. Prevention of vaccinia virus infection in immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression. //Nature. 1987. — V. 330. — P. 259−262.

42. Frey S.E., Newman F.K., Cruz J., Shelton W.B., Tennant J.M., Polach T., Rothman A.L., Kennedy J.S., Wolff M., Belshe R.B., Ennis F.A. Dose-related effects of smallpox vaccine. // N. Engl. J: Med. 2002. — V. 346. — P. 1275−1280.

43. Galmiche M.C., Goenaga J., Wittek R., Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. // Virology. 1999. — V. 254. -P. 71−80.

44. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. — V. 179. — № 1. — P. 247 266.

45. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application and optimization. // Annu. Rev. Immunol. 2000. — V. 18. — P. 927−974.

46. Gurvich E.B. The age-dependent risk of postvaccination complications in vaccinees with smallpox vaccine. // Vaccine. 1992. — V. 10. — № 2. — P. 96−97.

47. Haas J., Park E.C., Seed B. Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein. // Curr. Biol. 1996. — V. 6. -№ 3. — P. 315−324.

48. Harari A., Bart P.A., Stohr W., Tapia G., Garcia M., Medjitna-Rais E., Burnet S., Cellerai.

49. Harding C.V., Song R. Phagocytic processing of exogenous particulate antigens by macrophages for presentation by class I MHC molecules. // J. Immunol. 1994. — V. 153. -P. 4925−4933.

50. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J.W. Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. // J. Immunol. Methods. 1999. — V. 229. — P. 1−22.

51. Hekker A.C., Bos J.M., Rai N.K., Keja J., Cuboni G., Emmet B., Djalins J. Large-scale use of freeze-dried smallpox vaccine prepared in primary ultures of rabbit kidney cells. Bull World Health Organ. 1976. — V. 54. — P. 279−284.

52. Henderson D.A. The looming threat of bioterrorism. // Science. 1999. — V. 283. — P. 1279−1282.

53. Heraud J.M., Edghill-Smith Y., Ayala V., Kalisz I., Parrino J., Kalyanaraman V.S., Manischewitz J., King L.R., Hryniewicz A., Trindade C.J., Hassett M., Tsai W.P., Venzon.

54. D., Nalca A., Vaccari M., Silvera P., Bray M., Graham B.S., Golding H., Hooper J.W., Franchini G. Subunit recombinant vaccine protects against monkeypox. // J. Immunol. -2006.-V. 177.-P. 2552−2564.

55. Hirayama M. Smallpox vaccination in Japan. In: Fukumi H, editor. The vaccination theory and practice. Tokyo: International Medical Foundation of Japan. 1975. — P. 113−124.

56. Honlinger B., Huemer H.P., Romani N., Czerny C.P., Eisendel K., Hopel R. Generalized cowpox infection probably transmitted from a rat. // Br. J. Dermatol. 2005. — V. 153. — P. 451−453.

57. Hooper J.W., Kamrud K.I., Elgh F., Custer D., Schmaljohn C.S. DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects against seoul virus infection. // Virology. 1999. — V. 255. — P. 269−278.

58. Hooper J.W., Custer D.M., Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L. DNA vaccination with vaccinia virus L1R and A33R genes protects mice against a lethal poxvirus challenge. // Virology. 2000. — V. 266. — P. 329−339.

59. Hooper J.W., Custer D.M., Thompson E. Four-gene-combination DNA vaccine protects mice against a lethal vaccinia virus challenge and elicits appropriate antibody responses in nonhuman primates. // Virology. 2003. — V. 306. — P. 181−195.

60. Hooper J.W., Thompson E., Wilhelmsen C., Zimmerman M., Ichou M.A., Steffen S.E., Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Smallpox DNA vaccine protects nonhuman primates against lethal monkeypox. // J. Virol. 2004. — V. 78. — P. 4433—4443.

61. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. // J. Virol. 1999. — V. 73. — P. 8750−8761.

62. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup DJ. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. // Virology. 1994. — V. 204.-№ 1.-P. 343−356.

63. Iwasaki A., Torres C.A., Ohashi P. S., Robinson H.L., Barber B.II. The dominant role of bone marrow-derived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites. // J. Immunol. 1997. — V. 159. — P. 11−14.

64. Iwasaki A., Stiernholm B.J., Chan A.K., Berinstein N.L., Barber B.H. Enhanced CTL responses mediated by plasmid DNA immunogens encoding costimulatory molecules and cytokines. // J. Immunol. 1997b. — V. 158. — P. 4591−4601.

65. Jacobs B.L., Langland J.O., Kibler K.V., Denzler K.L., White S.D., Ilolechek S.A., Wong S., Huynh T., Baskin C.R. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res.-2009.-V. 84. P. 1−13.

66. Kemper A.R., Davis M.M., Freed G.L. Expected adverse events in a mass smallpox vaccination campaign. // Eff. Clin. Pract. 2002. — V. 5. — № 2. — P. 84−90.

67. Kenner J., Cameron F., Empig C., Jobes D.V., Gurwith M. LC16m8: an attenuated smallpox vaccine. // Vaccine. 2006. — V. 24. — P. 7009−7022.

68. Klinman D.M., Yi A.K., Beaucage S.L., Conover J., Krieg A.M. CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. — V. 93. — P. 2879−2883.

69. Kodihalli S., Haynes J.R., Robinson H.L., Webster R.G. Cross-protection among lethal H5N2 influenza viruses induced by DNA vaccine to the hemagglutinin. // J. Virol. 1997. -V. 71.-P. 3391−3396.

70. Kondo T., McGregor M., Chu Q., Chen D., Horimoto T., Kawaoka Y. A protective effect of epidermal powder immunization in a mouse model of equine herpesvirus-1 infection. // Virology. 2004. — V. 318. — P. 414−419.

71. Kovacs G.R., Moss B. The vaccinia virus H5R gene encodes late gene transcription factor 4: purification, cloning, and overexpression. // J. Virol. 1996. — V. 70. — P. 6796−6802.

72. Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in position +5 and +6. // EMBO J. 1997. — V. 16. — P. 2482−2492.

73. Kretzschmar M., Wallinga J., Teunis P., Xing S., Mikolajczyk R. Frequency of adverse events after vaccination with different vaccinia strains. // PLoS Med. 2006. — V. 3. — № 8.-P. 272.

74. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // Nature. 1995. — V. 374. — P. 546−549.

75. Kushner P.J., Baxter J.D., Duncan K.G., Lopez G.N., Schaufele F., Uht R.M., Webb P., West B.L. Eukaryotic regulatory elements lurking in plasmid DNA: the activator protein-1 site in pUC. // Mol. Endocrinol. 1994. — V. 8. — P. 405¹⁰⁷.

76. Kutzler M.A., Weiner D.B. DNA vaccines: ready for prime time? // Nature Reviews Genetics. 2008. — V. 9. — P. 776−788.

77. Lai C.F., Gong S.C., Esteban M. The purified 14-kilodalton envelope protein of vaccinia virus produced in Escherichia coli induces virus immunity in animals. // J. Virol. — 1991. -V. 65.-P. 5631−5635.

78. Lane J.M., Ruben F.L., Neff J.M., Millar J.D. Complications of smallpox vaccination, 1968: results often statewide surveys. // J. Infect. Dis. 1970. — V. 122. — P. 303−309.

79. Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.C., Smith K.A., Cormier N. Cohen L.K., Roberts B.E., Payne L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // J. Virol. 1992. — V. 66. -№ 5. — P. 2617−2630.

80. Legrand F.A., Verardi P. IL, Jones L.A., Chan K.S., Peng Y., Yilma T.D. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. // J. Virol. 2004. — V. 78. — № 6. — P. 2770−2779.

81. Levine R.S., Peterson A.T., Yorita K.L., Carroll D., Damon I.K., Reynolds M.G. Ecological niche and geographic distribution of human monkeypox in Africa. // PLoS One. — 2007. — V. 2. № 1. — P. 176.

82. Lewis-Jones S. Zoonotic poxvirus infections in humans. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. -V. 17.-P. 81−89.

83. Lipford G.B., Bauer M., Blank C., Reiter R., Wagner H., Heeg K. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. // Eur. J. Immunol. 1997. — V. 27. — P. 2340−2344.

84. Lorenzen N. and LaPatra S.E. DNA vaccines for aquacultured fish. // Rev. Sci. Tech. -2005.-V. 24.-P. 201−213.

85. Maksyutov A.Z., Zagrebelnaya E.S. ADEPT: a computer program for prediction of protein antigenic determinants. // Comput. Appl. Biosci. 1993. — V. 9. — № 3. — P. 291−297.

86. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975. // Virology. 1994. — V. 201. -№ 2. — P. 215−240.

87. A.V. Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNAvaccines boosted1 by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans. //Nat. Med. 2003. — V. 9. — P. 729−735.

88. Michaeli D. Smallpox: a possible comeback. // Isr. Med: Assoc. J. 2002. — V. 4. — № 7. -P. 487−488.

89. Monath T.P., Caldwell J.R., Mundt W., Fusco J., Johnson C.S., Buller M., Liu J., Gardner.

90. Moore R.A., Nicholls P.K., Santos E.B., Gough G.W., Stanley M.A. Absence of canine oral papillomavirus DNA following prophylactic LI particle-mediated immunotherapeutic delivery vaccination. // J. Gen. Virol. 2002. — V. 83. — P. 2299−2301.

91. Mossman K., Upton C., Buller R. M-, McFadden G. Species specificity of ectromelia virus and vaccinia virus interferon-gamma binding proteins. // Virology. — 1995. V. 208. — № 2.-P. 762−769.

92. Murphy F.A., Osburn B.I. Adventitious agents and smallpox vaccine in strategic national stockpile. //Emerg. Infect. Dis.-2005.-V. 11.-P. 1086−1089.

93. Ninove L., Domart Y., Vervel C., Voinot C., Salez N., Raoult D., Meyer H., Capek I., Zandotti C., Charrel R.N. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. // Emerg. Infect. Dis.-2009. V. 15.-P. 781−784.

94. Otero M., Calarota S.A., Dai A., De Groot A.S., Boyer J.D., Weiner D.B. Efficacy of novel plasmid DNA encoding vaccinia antigens in improving current smallpox vaccination strategy. // Vaccine. 2006. — V. 24. — P. 4461−4470.

95. Pan C.H., Chen H.W., Huang H.W., Tao M.H. Protective mechanisms induced by a Japanese encephalitis virus DNA vaccine: requirement for antibody but not CD8(+) cytotoxic T-cell responses. //J. Virol. -2001. -V. 75. P. 11 457- 11 463.

96. Parker S., Nuara A., Buller R.M., Schultz D.A. Human monkeypox: an emerging zoonotic disease. // Future Microbiol. 2007. — V. 2. — P. 17−34.

97. Pelkonen P.M., Tarvainen K., Hynninen A., Kallio E.R.K., Henttonen H., Palva A., Vaheri A., Vapalahti O. Cowpox with severe generalized eruption, Finland. // Emerg. Infect. Dis. -2003. V. 9.-P. 1458−1461.

98. Peterson D.O., Beifuss K.K., Morley K.L. Context-Dependent Gene expression: cis-acting negative effects of specific prokaryotic plasmid sequences on eukaryotic genes. // Molec. Cell Biol. 1987. — V. 7. — P. 1563−1567.

99. Poland G.A., Grabenstein J.D., NefT J.M. The US smallpox vaccination program: a review of a large modern era smallpox vaccination implementation program. // Vaccine. 2005. -V. 23.-№ 2078;2081.

100. Powell K. DNA vaccines back in the saddle again? // Nat. Biotechnol. — 2004. — V. 22. -P. 799−801.

101. Price B.M., Liner A.L., Park S., Leppla S.H., Mateczun A., Galloway D.R. Protection against anthrax lethal toxin challenge by genetic immunization with a plasmid encoding the lethal factor protein. // Infect. Immun. 2001. — V. 69. — P. 4509- 4515.

102. Piitz M.M., Midgley C.M., Law M., Smith G.L. Quantification of antibody responses against multiple antigens of the two infectious forms of vaccinia virus provides a benchmark for smallpox vaccination. // Nat. Med. 2006. — V. 12. — P. 1310−1315.

103. Putnak R., Fuller J., VanderZanden L., Innis B.L., Vaughn D.W. Vaccination of rhesus macaques against dengue-2 virus with a plasmid DNA vaccine encoding the viral premembrane and envelope genes. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003. — V. 68. — P. 469 476.

104. Rao A.R. Smallpox. Bombay: The Kothari Book Depot. 1972. — 220 p.

105. Ravanello M.P., Hruby D.E. Characterization of the vaccinia virus L1R myristylprotein as a component of the intracellular virion envelope. // J. Gen. Virol. 1994. — V. 75. — P. 1479−1483.

106. Rodriguez J.F., Paez E., Esteban M. A 14,000-Mr envelope protein of vaccinia virus is involved in cell fusion and forms covalently linked trimers. // J. Virol. 1987. — V. 61. -P. 395−404.

107. Rosenthal S.R., Merchlinsky M., Kleppinger C., Goldenthal K.L. Developing new smallpox vaccines. // Emerg. Infect. Dis. 2001. — V. 7. — P. 920−926.

108. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights. -Connecticut — 2000.

109. Sakhatskyy P., Wang S., Chou T.H., Lu S. Immunogenicity and protection efficacy of monovalent and polyvalent poxvirus vaccines that include the D8 antigen. // Virology. — 2006.-V. 355.-P. 164−174.

110. Sanderson C.M., Frischknecht F., Way M., Hollinshead M., Smith G.L. Roles of vaccinia virus EEV-specific proteins in intracellular actin tail formation and low pH-induced cell-cell fusion. // J. Gen. Virol. 1998. — V. 79. — P. 1415−1425.

111. Sato Y., Roman M., Tighe H., Lee D., Corr M., Nguyen M.D., Silverman G.J., Lotz M., Carson D.A., Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. // Science. 1996. — V. 273. — P. 352−354.

112. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 1993. — V. 327. -№ 3. — P. 321−324.

113. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. New York: Springer. 2005. — 425 p.

114. Shchelkunov S.N. How long ago did smallpox virus emerge? // Arch. Virol. 2009. — V. 154. -№ 12. — P. 1865−1871.

115. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism. // J. Infect. -2001.-V. 43.-P. 104−110.

116. Stephenson J. Monkeypox outbreak a reminder of emerging infections vulnerabilities. // J. Am. Med. Assoc. 2003. — V. 290. — P. 23−24.

117. Stewart K.J., Telfer S., Bown K.J., White M.I. Cowpox infection: not yet consigned to history. // Br. J. Plast. Surg. 2000. — V. 53. -№ 4. — P. 348−350.

118. Stickl H.A. Smallpox vaccination and its consequences: first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine «MVA». // Prev. Med. 1974. -V. 3. -№ 1. — P. 97−101.

119. Takeshita S., Takeshita F., Haddad D.E., Ishii K.J., Klinman D.M. CpG oligodeoxynucleotides induce murine macrophages to up-regulate chemokine mRNA expression. // Cell. Immunol. 2000. — V. 206. — 101−106.

120. Tang D.C., De Vit M., Johnston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. // Nature. 1992. — V. 365. — P. 152−154.

121. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Research. 1997. — V. 24. — P. 4876−4882.

122. Torres C.A., Iwasaki A., Barber B.H., Robinson H.L. Differential dependence on target site tissue for gene gun and intramuscular DNA immunizations. // J. Immunol. 1997. — V. 158.-P. 4529−4532.

123. Trindade G.S., Guedes M.I., Drumond B.P., Mota B.E.F., Abrahao J.S., Lobato Z.I.P. Zoonotic vaccinia virus: clinical and immunological characteristics in a naturally infected patient. // Clin. Infect. Diseases. 2009. — V. 48. — P. 37−40.

124. Tryland M., Myrmel H., Holtet L., Ilaukenes G., Traavik T. Clinical cowpox cases in Norway. // Scand. J. Infect. Dis. 1998. -V. 30. — P. 301−303.

125. Ulmer J.B., Wahren B., Liu M.A. G ene-based vaccines: recent technical and clinical advances. // Trends Mol. Med. 2006. -V. 12. -№ 5. — P. 216−222.

126. Vijaysri S., Jentarra G., Heck M.C., Mercer A.A., Mclnnes C.J., Jacobs B.L. Vaccinia viruses with mutations in the E3L gene as potential replicationcompetent, attenuated vaccines: intra-nasal vaccination. // Vaccine. 2008. — V. 26. — № 5. — 664−676.

127. Webster R.G., Fynan E.F., Santoro J.C., Robinson H. Protection of ferrets against influenza challenge with a DNA vaccine to the haemagglutinin. // Vaccine. 1994. — V. 12.-P. 1495−1498.

128. Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson C.P. Plasmid DNA Vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. // Biotechnol. Adv. 2009. — V. 27. — № 4. — P. 353−370.

129. Wolffe E.J., Isaacs S.N., Moss B. Deletion of the vaccinia virus B5R gene encoding a 42-kilodalton membrane glycoprotein inhibits extracellular virus envelope formation and dissemination. // J. Virol. 1993. — V. 67. — P. 4732^1741.

130. Wolffe E.J., Vijaya S., Moss B. A myristylated membrane protein encoded by the vaccinia virus L1R open reading frame is the target of potent neutralizing monoclonal antibodies. // Virology. 1995. — V. 211. — № 1. — P. 53−63.

131. Wyatt L.S., Earl P.L., Eller L.A., Moss B. Highly attenuated smallpox vaccine protects mice with and without immune deficiencies against pathogenic vaccinia virus challenge. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. — V. 101. — P. 4590−4595.

132. Zhu W., Fang Q., Zhuang K., Wang H., Yu W., Zhou J., Liu L., Tien P., Zhang L., Chen Z. The attenuation of vaccinia Tian Tan strain by the removal of the viral M1L-K2L genes. // J. Virol. Methods. 2007. — V. 144. — P. 17−26.