Фармакогностическое изучение сухоцвета однолетнего

Актуальность темы

В России в настоящее время разрешено к применению более 250 видов лекарственного растительного сырья (ЛРС), в то время как в ГФ XI издания приведены требования к качеству лишь 83 видов лекарственных растений [6, 15, 41, 42, 85, 141]. Следует также отметить, что для многих видов J1PC продолжают действовать устаревшие государственные стандарты (ГОСТ) и фармакопейные статьи (ФС) [40, 86, 116]. В связи с этим, представляется необходимым фармакогностическое изучение и проведение стандартизации лекарственного сырья, на которое истёк срок действия нормативных документов [10, 72, 126].

Таким образом, стандартизация ЛРС и совершенствование методов контроля его качества является одной из актуальных задач современной фармакогнозии [127, 128, 154].

Одним из лекарственных растений, на которое в настоящий момент отсутствует нормативная документация, является сухоцвет однолетний (Хег-anthemum annum L., сем. Asteraceae), входящий в Государственный реестр лекарственных средств как компонент сбора М. Н. Здренко [40, 96, 163]. Анализ литературных данных свидетельствует о недостаточной изученности химического состава травы сухоцвета однолетнего и вместе с тем о широком применении его в народной медицине [59, 82, 119].

Ранее действовавшая фармакопейная статья на траву сухоцвета однолетнего (ФС — 42−2171−84) регламентировала стандартизацию данного ЛРС лишь по товароведческим показателям (влажность, зольность, экстрактивные вещества), поэтому в настоящий момент не соответствует требованиям, предъявляемым к нормативным документам [И, 154]. В связи с этим, представляется актуальным проведение фармакогностического изучения травы сухоцвета однолетнего и разработка новой ФС.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилось фармакогностическое изучение травы сухоцвета однолетнего и разработка нормативной документации на данное сырьё.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести выявление, качественное и количественное определение основных групп биологически активных веществ (БАВ) травы сухоцвета однолетнего (полифенольных соединений, тритерпеноидов, органических кислот, аминокислот, макрои микроэлементов).

2. Выделить и установить химическую структуру индивидуальных соединений, содержащихся в траве сухоцвета однолетнего.

3. Провести фармакологические исследования экстракта травы сухоцвета однолетнего.

4. Изучить оптимальные условия извлечения флавоноидов из травы сухоцвета однолетнего и разработать методику их количественного определения.

5. Установить диагностические признаки травы сухоцвета однолетнего и. провести ресурсоведческие исследования данного сырья.

6. Провести стандартизацию травы сухоцвета однолетнего, разработать проект ФС «Сухоцвета однолетнего трава» и «Инструкцию по сбору и сушке сухоцвета однолетнего».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.200.112 164). Научная новизна и теоретическая значимость работы Определены условия выделения, разделения и обнаружения в траве сухоцвета однолетнего полифенольных соединений методом ВЭЖХ. С помощью этого метода подтверждено наличие в изучаемом растительном сырье 4х соединений (кверцетин, лютеолин, хлорогеновая и кофейная кислоты) и идентифицированы 7 полифенольных соединений (гиперозид, гесперидин, таннин, галловая, элаговая, коричная и цикориевая кислоты), о содержании которых в данном виде ранее в литературных источниках не упоминалось.

Изучен полисахаридный состав травы сухоцвета однолетнего и установлено, что преобладающей полисахаридной фракцией являются водорастворимые полисахариды (ВРПС). Методом ВЭЖХ изучен моносахаридный состав данного сырья и ВРПС, в результате чего установлено присутствие в траве сухоцвета однолетнего 15 моносахаров, 7 из которых идентифицировано (глюкоза, лактоза, ксилоза, мальтоза, рамноза, арабиноза и сорбитол).

Впервые из травы сухоцвета однолетнего выделены: флавоноиды (гиперозид), тритерпеноиды ф-амирин) и жирные кислоты (пальмитиновая), химические структуры которых установлены методом тонкослойной хроматографии, 'Н-ЯМРи 13С-ЯМР-спектроскопией, масс-спектрометрией.

Найдены оптимальные условия анализа флавоноидов — качественного (методом тонкослойной хроматографии) и количественного (методом дифференциальной УФ-спекрофотометрии) в траве сухоцвета однолетнего.

Выявлены желчегонная, гепатопротекторная, противовоспалительная и ранозаживляющая активности БАВ, содержащихся в траве сухоцвета однолетнего.

Проведено исследование динамики накопления флавоноидов в исследуемом сырье и даны рекомендации по его заготовке.

Практическая значимость результатов исследования.

1. Установлены характерные диагностические признаки травы сухоцвета однолетнего.

2. Определена урожайность травы сухоцвета однолетнего и выявлены основные районы, пригодные для промышленной заготовки сырья на Северном Кавказе.

3. Проведена стандартизация травы сухоцвета однолетнего с учётом современных требований, предъявляемых к качеству лекарственного растительного сырья.

4. Обоснована целесообразность применения травы сухоцвета однолетнего в медицинской практике в качестве желчегонного, гепатопротекторного, противовоспалительного и ранозаживляющего средства.

Внедрение результатов исследования Разработанный проект ФС «Сухоцвета однолетнего трава» принят на экспертизу в Институт стандартизации ФГУ «НЦЭСМП» (письмо № 3312 от 22.08.2005) для рассмотрения и утверждения Фармакопейным государственным комитетом. Разработана и отправлена на согласование в ВИЛАР «Инструкция по сбору и сушке сухоцвета однолетнего (Xeranthemum annuum L.)». Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Результаты изучения химического состава травы сухоцвета однолетнего методами ТСХ-анализа, колоночной хроматографии, ВЭЖХ, УФ-, 'НЯМРи 13С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

2. Оптимальные условия качественного и количественного определения флавоноидов в траве сухоцвета однолетнего.

3. Характерные диагностические признаки травы сухоцвета однолетнего.

4. Результаты ресурсоведческих исследований травы сухоцвета однолетнего на территории Северного Кавказа.

5. Результаты изучения фармакологической активности экстракта травы сухоцвета однолетнего.

6. Основные положения стандартизации травы сухоцвета однолетнего. Апробация работы и публикации Основные положения диссертационной работы доложены на 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии (г. Пятигорск, 2003 г.) и на VIII молодёжной конференции ботаников (г.Санкт-Петербург, 2004 г.). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объём и структура диссертации Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц, 45 рисунков и 14 расчётных формул. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 195 источников, в том числе 29 иностранных и приложения.

Фармакологические исследования травы сухоцвета однолетнего проводили под руководством профессора кафедры фармакологии, доктора биол. наук Погорелого В. Е. и ассистента кафедры фармакологии, кандидата фарм. наук Макаровой JI.M., за что выражаем им глубокую благодарность и при-знанательность.

Идентификацию выделенных индивидуальных соединений методами ЯМР-спектроскопии проводили на базе ВИЛАР под руководством зам. директора ГУ «ВИЛАР», доктора фарм. наук Сокольской Т. А. и непосредственной консультации зав. лаборатории фитохимии, кандидата фарм. наук Стихина В. А., а также ведущего научного сотрудника лаборатории фитохимии, кандидата химических наук Савиной A.A. Выражаем им благодарность и признательность.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что основными БАВ травы сухоцвета однолетнего являются оксикоричные кислоты (2,41 — 2,65%) — флавоноиды (1,59 -1,76%) — тритерпеновые соединения (1,41 — 2,21%) и полисахариды (5,05 — 5,78%). Кроме того, данный растительный объект содержит богатый комплекс аминокислот, в том числе и незаменимых (метионин, лизин, треонин, гистидин, аргинин, лейцин, изолейцин, валин, фенила-ланин, триптофан), а также макрои микроэлементы, наибольшее содержание из которых составили К, Са, Бе, 81, А1 и Р.

2. Впервые выделены из травы сухоцвета однолетнего жирные кислотыпальмитиновая, стеариновая, арахиновая, лигноцериновая, церотино-вая и мелиссиновая (из петролейно-эфирной фракции), тритерпеновое соединение — Р-амирин (из петролейно-эфирной и хлороформной фракций) и флавоноиды — гиперозид и метоксипроизводное лютеолина (из этилацетатной и бутанольной фракций), идентификацию которых проводили методами 'Н-ЯМР-, 13С-ЯМРспектроскопии и масс-спектрометрии, а также с помощью ТСХ-анализа.

3. Идентифицированы полифенольные соединения и моносахаридный состав травы сухоцвета однолетнего методом ВЭЖХ. В результате установлено наличие 21 полифенольного соединения, 9 из которых идентифицированы — хлорогеновая, галловая, эллаговая, коричная и цико-риевая кислоты, танин, гесперидин, лютеолин, кверцетин и 15 Сахаров, 7 из которых идентифицированы — глюкоза, лактоза, ксилоза, мальтоза, рамноза, арабиноза и сорбитол.

4. Установлено, что трава сухоцвета однолетнего обладает низкой токсичностью и широким спектром фармакологического действия — желчегонной, гепатопротекторной, противовоспалительной, ранозажив-ляющей и седативной активностью.

5. Разработана методика количественного определения суммы флаво-ноидов в пересчёте на гиперозид с использованием дифференциальной спектрофотометрии и установлена норма их содержания в сырье — не менее 1,5%. На основании разработанной методики установлено, что заготовку травы целесообразно проводить в фазу цветения — начала плодоношения.

6. Выявлены диагностические признаки травы сухоцвета однолетнего: характерные волоски на эпидерме листа и стебля, устьица аномоцитно-го типа, включения оксалата кальция игольчатой и призматической формы, эфирномасличные желёзки по типу сложноцветных на нижней эпидерме листа, а также совмещение пучкового типа проводящей системы в верхней части и непучкового типа — в нижней части стебля.

7. Определена урожайность травы сухоцвета однолетнего (350−400 г/м), объём возможных ежегодных заготовок (более 10 т), основные районы на Северном Кавказе, пригодные для её промышленной заготовки. На основании ресурсоведческих исследований разработана «Инструкция по сбору и сушке сухоцвета однолетнего».

8. Проведена стандартизация травы сухоцвета однолетнего, отвечающая современным требованиям, предъявляемым к качеству лекарственного растительного сырья, и разработан проект ФС «Сухоцвета однолетнего трава».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ.

1. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что среди представителей рода ХегапШешиш Ь. применение не только в народной, но и официнальной медицине нашёл лишь сухоцвет однолетний.

2. Углубленного фитохимического анализа сухоцвета однолетнего не проводилось, но имеются данные, что его химический состав представлен преимущественно полифенольными соединениями и тритерпеноидами.

3. ФС 42−2171−84 на траву сухоцвета однолетнего регламентирует качество сырья лишь по товароведческим показателям, что на сегодняшний день не отвечает требованиям, предъявляемым к качеству лекарственного растительного сырья.

4. Сухоцвет однолетний повсеместно распространён на территории России, в том числе на Северном Кавказе, образуя обширные заросли. Однако в литературе отсутствуют данные о запасах и возможных объёмах ежегодных заготовок сырья.

5. Анализ литературных данных по выделению и анализу флавоноидных соединений показал, что наиболее перспективными методами качественного и количественного анализа являются ТСХ-анализ и ВЭЖХ, при идентификации выделенных соединений используют метод УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

6. Изучение гепатопротекторов на отечественном фармацевтическом рынке России показало, что фармакологическая активность растительных препаратов обусловлена содержанием в них полифенольных соединений. На 90% номенклатура гепатопротекторов представлена зарубежными лекарственными препаратами, что влечёт за собой достаточно высокую их стоимость.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования является лекарственное растительное сырье — трава сухоцвета однолетнего, собранная в июле-августе 2001;2004 гг. в фазу цветения — начала плодоношения, произрастающего на территории Северного Кавказа. Для сравнительной характеристики подлинности и стандартизации сырья, образцы травы сухоцвета однолетнего были заготовлены в различных районах Северного Кавказа (Ставропольский край, с. СтепноеКраснодарский край, г. КрымскРостовская область, г. ЦимлянскКабардино-Балкарская Республика, г. Прохладный).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Химические реакции Присутствие основных групп биологически активных веществ (БАВ) в изучаемом растении устанавливали с помощью общепринятых качественных реакций в водном извлечении из сырья (1:10) [41, 42, 49, 96].

Хроматографические методы Хроматографические методы анализа использовались для определения качественного состава (БХ, ТСХ, ВЭЖХ), количественного определения БАВ (ВЭЖХ) и оценки чистоты выделенных веществ (ТСХ).

Методы бумажной и тонкослойной хроматографии Методика обнаружения для всех объектов исследования заключалась в следующем: на линию старта хроматографической пластинки «Силуфол-254» размером 15×15 или хроматографической бумаги наносили с помощью микрошприца по 10 мкл или 50 мкл соответственно спиртоводного извлечения из растительного сырья. Параллельно наносили по 5 мкл растворов государственных или рабочих стандартных образцов [8]. Хроматографические камеры предварительно насыщали парами растворителей в течение 40 — 60 мин в случае ТСХ и в течение 12 — 16 часов в случае бумажной хроматографии. Хроматографирование осуществляли восходящим способом в герметично закрытой камере, содержащей соответствующую систему растворителей.

Анализ проводили, когда фронт растворителя достигал 13 см для ТСХ или 25 см для БХ [89]. После хроматографирования пластинки высушивали на воздухе в вытяжном шкафу, просматривали в видимом и УФ-свете (А,=254 и А,=366 нм). Далее хроматограммы обрабатывали определённым реагентом с помощью пульверизатора [162].

Для анализа флавоноидов и фенолкарбоновых кислот использовались следующие системы растворителей: БУВ (4:1:2) — этилацетат-муравьиная кислота-вода (10:2:3) — 2% уксусная кислота- 15% уксусная кислотахлороформ-метанол (8:2) и хлороформ-метанол-вода (61:32:7) [75, 76, 151].

Анализ тритерпеновых соединений проводили в системах хлороформ и хлороформ-метанол (8:2), в качестве проявителя использовали 10% растворы фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислот [73, 125, 158, 173].

Хроматографическое разделение органических кислот проводили в системе 95% этиловый спирт — концентрированный раствор аммиака (16:4,5), в качестве проявителя использовали раствор бромкрезолового зеленого [75, 89, 138].

Метод колоночной хроматографии Метод адсорбционной колоночной хроматографии использовался нами для изучения и препаративного выделения фенольных и тритерпеновых соединений в индивидуальном виде из травы сухоцвета однолетнего.

При изучении фенольных соединений в качестве сорбента нами были использованы: силикагель марки L 40/100 (Чехия) и полиамид марки «Woelm» (Германия). В качестве элюентных систем использовали: хлороформ, хлороформ-метанол и этанол-вода. Эффективного разделения и очистки веществ добивались путем подбора сорбента и соответствующей концентрации систем растворителей [54, 132, 162].

Для изучения тритерпеновых соединений травы сухоцвета однолетнего методом колоночной хроматографии в качестве сорбента использовали: силикагель L 40/100 (Чехия) и оксид алюминия II степени активности. Элюиро-вание тритерпеновых соединений проводили смесью петролейный эфир-хлороформ в различных соотношениях [107, 148, 158].

Метод ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография использовалась для анализа фенольных соединений и моносахаридного состава изучаемого JIPC.

Исследования по изучению фенольных соединений проводились на кафедре токсикологии ПятГФА на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-5» (стальная колонка 120×2ммсорбент — Сепарон Ci8) в об-ращенно-фазовом варианте ВЭЖХ и на базе ВИЛАР (г. Москва) на хроматографе фирмы «Gilston» с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для «Windows». В качестве подвижной фазы использовали смесь «ацетонитрил-вода-уксусная кислота» в различных соотношениях. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длине волны А,=260нм. Качественный анализ проводили посредством регистрации времен удерживания веществ. Количественный анализ фенольных соединений осуществляли методом внутреннего стандарта с использование государственных стандартных образцов флавоноидов [8, 89, 144, 170, 172].

Методом ВЭЖХ проводили идентификацию и количественное определение в траве сухоцвета однолетнего свободных Сахаров и Сахаров после гидролиза [30, 55, 92, 168, 171, 191]. В работе использовался жидкостной хроматограф фирмы «Gilston» с рефрактометрическим детектором. В качестве неподвижной фазы была использовалась металлическая колонка размером 6,5×300 мм Altech OA-1000 Organic Acids, в качестве подвижной фазы — 0,005 моль/л раствор серной кислоты. Скорость подачи элюента составляла 0,4 мл/мин, время элюирования 19 мин, длина волны a,=190hm.

Спектральные методы Метод УФ-спектрофотометрии Метод прямой и дифференциальной УФ-спектрофотометрии использовался нами для изучения качественного состава и количественный содержания флавоноидов и фенолкарбоновых кислот [140]. Также методом прямой спектрофотометрии было определено количественное содержание сапонинов [64, 112, 158] и антоцианов [98]. Спектрофотометрические исследования проводились на спектрофотометрах СФ-46 и СФ-56 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм.

ЯМР-спектроскопия Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопии) использовался нами для установления структуры выделенных соединений методом колоночной хроматографии.

Исследования проводились на базе ВИЛАР с помощью спектрометра Gemini 200 Varian USA (США). Рабочая частота прибора составляла 2000 мГц. В качестве растворителей использовали:

S CDC13 (дейтерированный хлороформ);

S Acetone (ацетон);

S C6D6 (дейтерированный бензол).

При изучении выделенных соединений использовали ЯМР-спекроскопию ('Н-ЯМРспектр и С-ЯМР-спектр) [45, 84]. Данными методами были установлены химические структуры фенольных соединений, три-терпеноидов и жирных кислот, выделенных из травы сухоцвета однолетнего.

Масс-спектрометр ин Масс-спектрометрия использовалась нами для идентификации тритер-пеноидов, флавоноидов и жирных кислот [69, 159]. Исследования проводились на базе ВНИХФИ г. Москвы с использованием масс-спектрометра SSQ-710 фирмы Finnigan-MAT (USA).

Титриметрические методы Содержание окисляемых веществ определяли методом перманганато-метрического титрования (ГФ XI, вып.1, стр.286−287), а содержание аскорбиновой и свободных органических кислот — алкалиметрией (ГФ XI, вып.2, ст. 38 «Плоды шиповника») [41, 42].

Гравиметрические методы Изучение полисахаридного состава травы сухоцвета однолетнего проводили гравиметрическими методами: по методике ГФ XI издания на траву подорожника большого (вып. 2, стр.264) и методом Н. К. Кочеткова [42, 81].