Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии

Диссертация: Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Найдены новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов с использованием программы Данный подход открывает принципиально новый метод исследования стероидного профиля, позволяющий оценивать изменение не столько концентраций самих принимаемых стероидов, сколько изменение в соотношениях их метаболитов. Более того, данный подход может использоваться в дальнейшем не только для определения приема… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Номенклатура стероидов
    • 1. 2. Биосинтез и метаболизм стероидов
    • 1. 3. Определение стероидов в моче
      • 1. 3. 1. Гидролиз коньюгатов стероидов
      • 1. 3. 2. Методы определения эндогенных стероидов
      • 1. 3. 3. Проблема количественного анализа эндогенных стероидов
    • 1. 4. Стероидный профиль
      • 1. 4. 1. Исследование стероидного профиля
      • 1. 4. 2. Стероидный профиль и основные метаболиты
      • 1. 4. 3. Стероидный профиль и минорные метаболиты
      • 1. 4. 4. Стероидный профиль и генетика
      • 1. 4. 5. Стероидный профиль и разбавление мочи
      • 1. 4. 6. Популяционные нормы концентраций и соотношений эндогенных стероидов в моче
      • 1. 4. 7. Переход от популяционных границ к индивидуальным
  • 2. ОБОРУДОВАНИЕ, ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
    • 2. 1. Оборудование
    • 2. 2. Исходные вещества и материалы
    • 2. 3. Приготовление растворов и буферов
      • 2. 3. 1. Приготовление раствора внутреннего стандарта метилтестостерона
        • 2. 3. 1. 1. Приготовление рабочего раствора метилтестостерона
      • 2. 3. 2. Приготовление буферной смеси
      • 2. 3. 3. Приготовление фосфатного буфера
      • 2. 3. 4. Приготовление карбонатного буфера
      • 2. 3. 5. Приготовление концентрированного раствора для дериватизации
      • 2. 3. 6. Приготовление модельных растворов для оптимизации условий хроматографического разделения
      • 2. 3. 7. Приготовление градуировочных растворов
        • 2. 3. 7. 1. Приготовление растворов 1 группы
        • 2. 3. 7. 2. Приготовление растворов 2 группы
        • 2. 3. 7. 3. Приготовление растворов 3 группы
        • 2. 3. 7. 4. Приготовление растворов 4 группы
        • 2. 3. 7. 5. Приготовление растворов 5 группы
      • 2. 3. 8. Подготовка матриц для проведения градуировки
        • 2. 3. 8. 1. Подготовка матрицы мочи без стероидов, содержащихся в свободной фракции — «свободная моча»
        • 2. 3. 8. 2. Подготовка матрицы мочи, прошедшей через патрон для твердофазной экстракции — «ТФЭ моча»
    • 2. 4. Подготовка пробы мочи для анализа и проведения градуировки
      • 2. 4. 1. Подготовка пробы мочи
      • 2. 4. 2. Подготовка пробы для проведения градуировки
      • 2. 4. 3. Препараты эндогенных стероидов, использованные в работе
    • 2. 5. Прием препаратов эндогенных стероидов
    • 2. 6. Статистические программы и математические модули, используемые в работе
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Разработка способа определения эндогенных стероидов в моче
      • 3. 1. 1. Выбор температурной программы и хроматографической колонки
      • 3. 1. 2. Определение времен удерживания и характеристичных ионов
      • 3. 1. 3. Масс-спектры исследуемых соединений
      • 3. 1. 4. Построение градуировочных зависимостей для количественного определения эндогенных стероидов
        • 3. 1. 4. 1. Выбор матрицы для построения градуировочных кривых
        • 3. 1. 4. 2. Сравнение коэффициентов чувствительности
        • 3. 1. 4. 3. Сравнение отношений эндогенных стероидов
      • 3. 1. 5. Эффективность гидролиза и степень извлечения
      • 3. 1. 6. Метрологическая аттестация разработанного способа анализа
  • 3.
  • Заключения об итогах исследований от лабораторий, аккредитованных В АДА. Межлабораторная сходимость результатов
    • 3. 2. Статистический анализ полученных данных
      • 3. 2. 1. Статистический анализ концентраций эндогенных стероидов
      • 3. 2. 2. Статистический анализ данных соотношений эндогенных стероидов
      • 3. 2. 3. Использование установленных популяционных пределов для определения приема запрещенных препаратов
        • 3. 2. 3. 1. Анализ проб после приема тестостерона
        • 3. 2. 3. 2. Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона
    • 3. 3. Переход от популяционных границ к индивидуальным
      • 3. 3. 1. Использование разработанной программы для определения приема запрещенных препаратов
        • 3. 3. 1. 1. Анализ проб после приема тестостерона
        • 3. 3. 1. 2. Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона
    • 3. 4. Поиск новых значимых соотношений эндогенных стероидов
      • 3. 4. 1. Анализ проб после приема тестостерона
      • 3. 4. 2. Анализ проб после приема дегидроэпиандростерона
      • 3. 4. 3. Установление популяционных границ для новых соотношений

Определение профиля эндогенных стероидов методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы. Употребление анаболических стероидов распространено в спорте, и по этой причине они внесены в Запрещенный список Всемирного антидопингового агентства (ВАДА). Тестостерон относится к наиболее часто выявляемым эндогенным анаболическим стероидам, но при установлении случаев его употребления возникает ряд проблем. Тестостерон вырабатывается в организме человека в больших количествах, а любые принятые эндогенные стероиды активно метаболизируют с образованием многочисленных продуктов. С точки зрения антидопингового контроля такие препараты являются сложно определяемыми, и большинство современных методов не способно достоверно выявить факт их употребления уже через 36 часов после приема. Исключение составляет метод газовой хроматографии-сжигания-изотопной масс-спектрометрии (ГХ/С/ИМС), но этот анализ не распространен из-за дороговизны и сложности пробоподготовки. Для выявления приема синтетических эндогенных стероидов предложено использовать определение стероидного профиля, то есть количественное определение совокупности концентраций и соотношений стероидов. Впервые использовать стероидный профиль для выявления применения тестостерона было предложено еще около 30 лет назад, однако проблема выявления приема запрещенных эндогенных стероидов не решена и в настоящее время. Для обнаружения применения различных эндогенных стероидов существует несколько критериев, установленных ВАДА, однако наибольшее диагностическое значение имеет только один — соотношение концентраций тестостерона/эпитестостерона (Т/Е). Однако одного данного соотношения недостаточно, поскольку применение запрещенных в спорте прогор-монов может оказывать значительное влияние на спортивную форму, оставаясь при этом «незаметным» для лабораторий допинг-контроля. Данная ситуация показывает, что используемая методика определения приема стероидов тесто-стеронового ряда может быть улучшена за счет мониторинга ряда других перспективных соотношений.

С 2007 года ВАДА ввело понятие «атипического» результата, то есть сейчас любая аккредитованная лаборатория при обнаружении некоторых несоответствий пробы стандартным параметрам обязана сообщить об «атипическом» результате. В таком случае будут изучены и сравнены предыдущие и последующие пробы спортсмена. Чтобы упростить решение этой проблемы, ВАДА предложило составлять индивидуальный стероидный паспорт и собирать данные по концентрациям и соотношениям эндогенных стероидных гормонов для каждого спортсмена, что впоследствии позволит установить индивидуальные нормы, составляющие часть так называемого «Биологического паспорта спортсмена». «Биологический паспорт спортсмена» состоит из трех модулей. Первый — паспорт крови — существует с 2009 года, второй — стероидный — планируется создать в 2012 году, а эндокринный — к 2014 году.

В настоящее время существуют следующие критерии ВАДА: соотношение Т/Е >4, концентрации тестостерона (Т) и эпитестостерона (Е) > 200 нг/мл, концентрации андростерона (А) и этиохоланолона (Этио) > 10 000 нг/мл и концентрация дегидроэпиандростерона (ДГЭА) >100 нг/мл. Проба, в которой наблюдается превышение одного или нескольких данных параметров считается атипической и подвергается дальнейшему анализу методом ГХ/С/ИМС.

Традиционно для определения эндогенных стероидов используется метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), позволяющий разделять большое количество исследуемых соединений за один анализ. Для успешного определения эндогенных стероидов методом ГХ-МС необходимо проведение предварительной дериватизации для перевода исследуемых соединений в соответствующие летучие производные. Данный подход позволяет определять большинство эндогенных стероидов на уровне 10 нг/мл в реальных образцах.

В настоящее время антидопинговые лаборатории определяют не более восьми эндогенных стероидов, причем данные по условиям их определения очень противоречивы — авторы предлагают различные условия для гидролиза, проводят построение градуировочных зависимостей с использованием разных матриц, а чаще всего даже не указывая их. При определении популяционных норм для концентраций эндогенных стероидов не всегда используется нормировка на плотность мочи, что приводит к повышенной вариативности полученных данных. В последнее время в литературе появились данные, что традиционно изучаемый стероидный профиль, состоящий из восьми стероидов и их соотношений, не чувствителен к приему новых прогормонов, поэтому необходимо определять дополнительные эндогенные стероиды, которые впоследствии могут стать новыми маркерами приема запрещенных препаратов.

Цели работы заключались в:

1. разработке способа выявления факта употребления эндогенных стероидов, основанного на определении в моче ряда эндогенных стероидов, а именно андрогенов, эстрогенов и прогестинов;

2. составлении индивидуального стероидного профиля, представляющего совокупность концентраций и соотношений исследуемых стероидов, изучении его стабильности во времени;

3. определении популяционных и индивидуальных границ для соотношений и концентраций эндогенных стероидов;

4. поиске новых наиболее значимых маркеров приема эндогенных стероидов.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• разработать способ анализа мочи на стероидный профиль, заключающийся в ферментативном гидролизе, жидкостно-жидкостной экстракции и дериватизации эндогенных стероидов с последующим определением этих веществ методом ГХ-МС;

• провести сравнение коэффициентов чувствительности градуировочных графиков, полученных при различных условиях, и выбрать оптимальные матрицы для построения градуировочных зависимостей всех исследуемых эндогенных стероидов;

• провести метрологическую аттестацию разработанного способа определения эндогенных стероидов;

• провести анализ образцов, получаемых от В АДА в рамках межлабораторного сравнения результатов, и статистически сравнить полученные данные с другими лабораториями, аккредитованными ВАДА;

• провести анализ статистически значимого количества проб мочи российских спортсменов и получить значения концентраций и соотношений исследуемых стероидов для данной специфической популяции, а затем установить популяционные пределы для основных концентраций и соотношений эндогенных стероидов российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• разработать программный модуль, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать доверительные интервалы для каждого спортсмена с учетом его собственных параметров стероидного профиля, при содействии факультета Вычислительной математики и кибернетики Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова (ВМК МГУ);

• провести апробацию разработанной методики и программного модуля на реальных образцах мочи;

• найти новые значимые маркеры приема эндогенных стероидов с помощью программного пакета 81айзйса;

• установить популяционные пределы для найденных новых маркеров приема эндогенных стероидов и внести данные параметры в разработанную методику.

Научная новизна. Разработана методика определения стероидного профиля мочи, состоящая из количественного определения 43 эндогенных стероидов. Получены масс-спектры электронной ионизации триметилсилильных производных всех исследуемых соединений, причем часть спектров получена впервые. В работе показаны преимущества и недостатки построения градуировочных графиков с использованием различных матриц мочи. Показано, что основным преимуществом использования в качестве матрицы мочи, из которой предварительно удалены неконъюгированные стероиды, является повышение точности определения стероидного профиля.

На основе определения стероидного профиля более 5000 проб мочи спортсменов и описательной статистики установлен вид распределения концентраций и соотношений всех исследуемых стероидов. Показано, что вид популя-ционного распределения соотношения Т/Е сильно отличается в зависимости от пола.

На основании проведенных систематических исследований установлены популяционные пределы для определяемых параметров стероидного профиля. Показано, что популяционные пределы для российских спортсменов заметно различаются в зависимости от пола, вследствие чего данный фактор предложено использовать при анализе. Выявлены аналитические перспективы использования данного подхода для повышения чувствительности определения стероидного профиля.

Разработан программный модуль Вауез1ап Вютагкеге, позволяющий вычислять индивидуальные пределы для разнообразных параметров стероидного профиля, используя теорему Байеса. Использование индивидуальных границ для концентраций или соотношений эндогенных стероидов вместо популяци-онных при определении приема запрещенных препаратов позволяет увеличить время их детектирования в целом в 2 раза.

Применение одного из подходов хемометрики, реализованного в программе 81айзйса в сочетании с разработанной программой Вауез1ап Вютагкеге, позволило найти новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов. Использование данного подхода позволило увеличить время детектирования приема запрещенных препаратов в среднем в 3 раза, а в некоторых случаях в 5 раз по сравнению с использованием традиционных маркеров, предложенных ВА-ДА.

Практическая значимость. Предложенная методология позволяет решить проблему определения эндогенных стероидов в моче человека. Изученные матрицы для построения градуировочных зависимостей позволяют выбрать наиболее подходящие условия для проведения градуировки, обеспечивающие наибольшую точность при проведении количественного определения эндогенных стероидов.

Разработанный программный модуль позволяет составлять индивидуальный гормональный паспорт с учетом собственного метаболизма и особенностей стероидного профиля.

Предложенная методика определения стероидного профиля мочи человека в течение более чем трех лет используется в Федеральном государственном унитарном предприятии «Антидопинговый центр» (ФГУП АДЦ). За это время проанализировано более 5000 проб спортсменов.

Также разработанная методика используется при анализе проб добровольцев, участвующих в проекте «Марс 500» во время 105-ти и 520-ти суточной изоляции. Показана зависимость экскреции половых стероидных гормонов от солевой диеты, стресса и других факторов внешнего воздействия.

На защиту выносятся:

• сравнение матриц для построения градуировочных зависимостей и выбор оптимальной;

• метрологически аттестованный способ определения стероидного профиля мочи и внесение методики определения эндогенных стероидов в область аккредитации ФГУП АДЦ;

• установленные референсные пределы для российских спортсменов с учетом пола и плотности мочи;

• программный модуль Вауез1ап Вютагкегэ, позволяющий вычислять индивидуальные границы для параметров стероидного профиля в зависимости от пола, возраста, вида спорта и других параметров;

• методология выявления приема эндогенных стероидов с использованием установленных референсных пределов, а также разработанного программного модуля, и соответствующие им времена определения приема допинговых препаратов;

• новые маркеры приема запрещенных эндогенных стероидов и соответствующие им сроки определения приема допинговых препаратов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на 28-ой рабочей встрече по проблемам антидопингового контроля (7−12 марта 2010 г., Кёльн, Германия), на московском семинаре по аналитической химии (28 октября 2009 г. Москва, Россия), на III Всероссийской конференции «Аналитика России» (27 сентября — 3 октября 2009 г., Краснодар, Россия) и на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (14−18 апреля, 2008 г., Клязьма, Москва, Россия).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ в виде статей и тезисов докладов. Подана заявка № 2 011 109 874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка использованной литературы.

выводы.

1. Разработана методика определения 43 эндогенных стероидов в моче человека методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Получены масс-спектры электронной ионизации для ТМС-производных всех исследуемых соединений, установлены времена удерживания и выбраны характеристичные ионы для дальнейшего определения эндогенных стероидов в режиме регистрации селективных ионов.

2. Проведено сравнение градуировочных коэффициентов для 6-ти исследованных матриц. Показано, что наиболее пригодной матрицей для построения градуировочных зависимостей является моча, с предварительно удаленными неконъгированными стероидами.

3. Предложенная методика определения эндогенных стероидов после проведения метрологической аттестации добавлена в область аккредитации ФГУП АДЦ. Подана заявка № 2 011 109 874 и получено положительное заключение о выдаче патента «Способ определения стероидного профиля при допинговом контроле спортсменов».

4. В течение более трех лет разработанная методология анализа стероидного профиля мочи использовалась во ФГУП АДЦ в работе по Государственным контрактам № 08/ОД-Ю9 от 19.09.2008, № 09ЮД-10 от 19.01.2009, № 9/УС-10 от 24 мая 2010 и № 406 от 30.12.2010. За это время проанализировано 5796 проб, принадлежащих российским спортсменам, и на основе этого установлены популяционные нормы для концентраций и соотношений большинства эндогенных стероидов в популяции российских спортсменов.

5. Разработан программный модуль Вауезгап Вютагкеге, позволяющий в соответствии с теоремой Байеса и на основе полученных популяционных данных рассчитывать индивидуальные нормы концентрации и соотношений каждого исследованного стероида с учетом пола, возраста, вида спорта и других параметров. Использование разработанного программного модуля Bayesian Biomarkers позволило увеличить время определения приема запрещенных препаратов в среднем в 2 раза (на примере тестостерона и ДГЭА) при анализе проб, полученных от трех добровольцев.

6. Проведена апробация разработанной методики определения стероидного профиля для анализа проб мочи добровольцев, участвующих в проектах «Марс 105» и «Марс 500». Выявлены параметры стероидного профиля мочи, испытывающие влияние условий жизнедеятельности в гермообъек-те у здорового человека. Определены параметры индивидуальной вариабельности показателей стероидного профиля и их зависимость от определенных условий эксперимента, таких как смена периодов различного со-лепотребления, автономность жизнедеятельности.

7. После поиска новых значимых маркеров приема запрещенных препаратов с помощью одного из подходов хемометрики, реализованного в программе Statistica, выбраны новые соотношения, для которых построены индивидуальные границы в разработанном модуле Bayesian Biomarkers. Данный подход позволил увеличить время определения приема эндогенных стероидов в среднем в 3 раза по сравнению с использованием индивидуальных границ для традиционных маркеров. При этом время определения приема эндогенных стероидов увеличилось в среднем более чем в 6 раз и составило 50 — 150 часов после приема. Для всех новых маркеров установлены популяционные пределы в зависимости от пола.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В результате проведенного исследования 43 эндогенных стероидов получены их полные масс-спектры, времена удерживания и характеристичные ионы. При построении градуированных зависимостей проведено сравнение нескольких матриц и показаны их достоинства и недостатки. Оптимальной оказалась матрица «свободная моча», из которой предварительно удалены стероиды, содержащиеся в неконъгированном виде. При построении градуировочных зависимостей с помощью этой матрицы наблюдали наименьшее отклонение коэффициентов чувствительности от матрицы сравнения, что в свою очередь привело к наименьшей ошибке. На основе комплексных исследований предложен способ количественного определения эндогенных стероидов в моче человека.

После проведения метрологической аттестации предложенного способа определения эндогенных стероидов, разработанная методика определения эндогенных стероидов была внесена в область аккредитации Федерального государственного унитарного предприятия «Антидопинговый центр». Разработанную методику в течение более трех лет использовали в работе по государственным контрактам № 08/ОД-Ю9 от 19.09.2008, № 09/ОД-Ю от 19.01.2009, № 9/УС-10 от 24 мая 2010 и № 406 от 30.12.2010. За это время проанализировано 5796 проб, принадлежащих российским спортсменам.

На основе полученных данных впервые установлены популяционные интервалы для российских спортсменов, причем вид полученных данных согласуется с литературными данными, а значения максимальных концентраций, установленные для мужской и женской популяции российских спортсменов, заметно отличаются от пределов, установленных ВАДА. Проведенное исследование показывает необходимость тщательного изучения стероидного профиля спортсменов, а также определение более чувствительных к приему эндогенных препаратов популяционных пределов.

Данные, полученные после анализа проб спортсменов, использовали при разработке программного модуля Вауез1ап Вютагкеге. Разработанная программа позволяет устанавливать нормы для каждого спортсмена, исходя из его собственных параметров стероидного профиля, формируя, таким образом, индивидуальный гормональный паспорт спортсмена. Использование данного программного модуля заметно увеличивает чувствительность разработанной методики к определению приема запрещенных препаратов по сравнению с традиционными популяционными границами, установленными ВАДА.

Найдены новые значимые маркеры приема запрещенных препаратов с использованием программы Данный подход открывает принципиально новый метод исследования стероидного профиля, позволяющий оценивать изменение не столько концентраций самих принимаемых стероидов, сколько изменение в соотношениях их метаболитов. Более того, данный подход может использоваться в дальнейшем не только для определения приема запрещенных препаратов, но и для поиска значимых маркеров при определении различных заболеваний, приводящих к изменениям в стероидных гормонах, а также для определения норм и патологий при анализе мочи беременных женщин.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Наглядная биохимия. Я. Кольман, К. Г. Рем, Москва, «Мир», 2000 г.
  2. C.D. Kochakian. Metabolites of testosterone: significance in the vital economy. // Steroids. 1990. 55. 3. P. 92−97.
  3. P.F. Hall. Cytochromes P-450 in steroidogenesis: are these enzymes more specific than those of drug metabolism? // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1989. 16. 6. P. 439−453.
  4. D.J. Waxman. Interactions of hepatic cytochromes P-450 with steroid hormones: Regioselectivity and stereospecificity of steroid metabolism and hormonal regulation of rat P-450 enzyme expression. // Biochem. Pharmacol. 1988. 37. 1. P. 71−84.
  5. R. L. Gomes, W. Meredith, С. E. Snape, M. A. Sephton. Analysis of conjugated steroid androgens: deconjugation, derivatisation and associated issues. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2009. 49. 5. P. 1133−40.
  6. C. Ayotte, D. Goudreault, A. Charlebois. Testing for natural and synthetic anabolic agents in human urine. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 1996. 687. 1. P. 3−25.
  7. W. Schanzer, M. Donike. Metabolism of anabolic steroids in man: synthesis and use of reference substances for identification of anabolic steroid metabolites. //Anal. Chim. Acta. 1993. 275. 1−2. P. 23−48.
  8. G. Opfermann, W. Schanzer. Trimethylsilylation Aspects for Derivatisation. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch StrauB: Koln. 1997. P. 247−252.
  9. S.G. Webster. Catalysed derivatization of trimethylsilyl ethers of ecdysterone: A preliminary study. //J. Chromatogr. 1985. 333. 1. P. 186−190.
  10. R. Masse, H. Bi, P. Du. Studies on anabolic steroids. VII. Analysis of urinary metabolites of formebolone in man by gas chromatography—mass spectrometry. // Anal. Chim. Acta. 1991. 247. 2. P. 211−221.
  11. W. Schanzer, M. Donike. Metabolism of boldenone in man: Gas chromato-graphic/mass spectrometric identification of urinary excreted metabolites and determination of excretion rates. // Biol. Mass. Spectrom. 1992. 21. 1. P. 3−16.
  12. K. Linnet. Effect of urine matrix on the testosterone/epitestosterone calibration curve. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strau?: Koln. 1992. P. 125.
  13. E.C. Horning, M.G. Horning. Metabolic profiles: gas-phase methods for analysis of metabolites. // Clin. Chem. 1971. 17. P. 802−809.
  14. C.H.L. Shackleton. Profiling steroid hormones and urinary steroids. // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. 1986. 379. P. 91−156.
  15. M. Donike, J. Zimmermann, K.R. Barwald. Routinebestimmung von Anabolica in Ham. // Dtsch Z Sportmed 1984. 35. P. 14−24.
  16. M. Donike. Steroid Profiling in Cologne. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strau?: Koln. 1993. P. 47−68.
  17. M. Donike, K.R. Barwald, K. Klostermann, W. Schanzer, J. Zimmermann. Nachweis von exogenem testosteron. // Testosterone in sport: leistung und gesundheit. H.H. Hollmann, W. Leisen, H. Rost. Deutsche Artze-Verlag Koln, Germany. 1983. P. 293−300.
  18. J. Zimmermann Untersuchung zum Nachweis von exogenen Gaben von Testosteron Doctoral thesis., // Koln: Institute for Biochemistry, German University for Sports Sciences: 1986. P. 249.
  19. H. Geyer. Die Gas-chromatographisch/massenspektrometrische Bestimmung von Steroidprofilen im Urin von Athleten. // Thesis. Deutsche Sporthochschule Koln. 1986.
  20. D.H. Catlin, B.D. Ahrens, Y. Kucherova. Detection of norbolethone, an anabolic steroid never markted, in athletes' urine. // Rapid Communications in Mass Spectrometry 2002. 16. 13. P. 1273.
  21. D.H. Catlin, M.H. Sekera, B.D. Ahrens, B. Starcevic, Y.C. Chang, C.K. Hat-ton. Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004. 18. 12. P. 1245.
  22. M.H. Sekera, B.D. Ahrens, Y.C. Chang, B. Starcevic, C. Georgakopoulos, D.H. Catlin. Another designer steroid: discovery, synthesis, and detection of madol in urine. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. 19. 6. P. 781.
  23. G.D. Tharp. The role of glucocorticoids in exercise. // Med. Sei. Sports. 1975. 7. l.P. 6.
  24. U. Mareck, H. Geyer, U. Flenker, T. Piper, M. Thevis, W. Schanzer. Detection of dehydroepiandrosterone misuse by means of gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry. // Eur. J. Mass Spectrom. 2007. 13.6. P. 419.
  25. P. Vestergaard. The analysis of urinary hormonal steroids. // Lipids. 1980. 15. 9. P. 710−18.
  26. N.A. Schmidt, H.J. Borburgh, T.J. Penders, C.W. Weytkamp. Steroid Profiling-An update. // Clin. Chem. 1985. 31. 4. P. 637−639.
  27. O. Nozaki. Steroid analysis for medical diagnosis. // J. Chromatogr. A. 2001. 935. 1−2. P. 267−278.
  28. M. Donike. Steroid profiling in Cologne. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strau?: Koln. 1993. P. 47−68.
  29. S. Rauth. Referenzbereiche von urinaren Steroidkonzentrationen und Steroidquotienten. // PhD Thesis. Sporthochschule. Institut fur Biochemie. Cologne. 1994.
  30. M. Saugy, C. Cardis, N. Robinson, C. Schweizer. Test methods: anabolics. // BestPract. Res. Clin. Endocrinol. 2000. 14. 1. P. 111−133.
  31. C. Ayotte. Steroid Profiling in Anti-Doping Controls. // 5th Annual US ADA Symposium on Anti-Doping Science. Intra-Individual Reference Ranges. L.D. Bowers, R.L. Hilderbrand, C.C. Zardo, C. O’Connell. Lausanne. 2006. P. 1528.
  32. M. Donike. Steroid profile in weightlifting 1989/1990. An overview and a preliminary evaluation of the results. // Steroid profile in weightlifting 1989/1990.
  33. T.Z. Bosy, K.A. Moore, A. Poklis. The effect of oral dehydroepiandrosterone (DHEA) on the urine testosterone/epitestosterone (T/E) ratio in human male volunteers. // J. Anal. Toxicol. 1998. 22. 6. P. 455−459.
  34. L.D. Bowers. Oral dehydroepiandrosterone supplementation can increase the testosterone/epitestosterone ratio. // Clin. Chem. Lab. Med. 1999. 45. 2. P. 295 297.
  35. V.P. Uralets, P.A. Gillette. Over-the-counter anabolic steroids 5-androsten-3,17-dione- 5-androsten-3b, 17b-diol- dehydroepiandrosterone and 19-or-5androsten-3,17-dione: excretion studies in men. // J. Anal. Tox. 2000. 24. 3. P. 188−193.
  36. V.P. Uralets, P.A. Gillette. Over-the-Counter Anabolic Steroids 4-Androsten-3,17-dione- 4-Androsten-3b, 17b-diol- and 19-nor-4-Androsten-3,17-dione: Excretion Studies in Men. // J. Anal. Tox. 1999. 23. 5. P. 357−366.
  37. U. Mareck, H. Geyer, U. Flenker, T. Piper, M. Thevis, W. Schanzer. Detection of dehydroepiandrosterone misuse by means of gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry. // Eur. J. Mass Spectrom. 2007. 13. 6. P. 419−426.
  38. C. Saudan, N. Baume, N. Robinson, L. Avois, P. Mangin, M. Saugy. Testosterone and doping control. // Br. J. Sports Med. 2006. 40. 1. P. 21−24.
  39. D.H. Catlin, B.Z. Leder, B.D. Ahrens, C.K. Hatton, J.S. Finkelstein. Effects of androstenedione administration on epitestosterone metabolism in men. // Steroids. 2002. 67. 7. P. 559−564.
  40. D. van de Kerkhof. Steroid Profiling in Doping Analysis. // PhD Thesis. Utrecht University. Faculty of Pharmacy. Utrecht. 2001.
  41. J.-F. Levesque, C. Ayotte. Criteria for the detection of androstenedione oral administration. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strau?. Koln. 1999. P. 169−179.
  42. P. Van Eenoo, F.T. Delbeke, N. Desmet, P. De Backer. Excretion studies with 4-androstene-3,17-dione. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strau?. Koln. 1998. P. 171−180.
  43. A.T. Cawley, R. Kazlauskas, G.J. Trout, J.H. Rogerson, A.V. George. Isotopic fractionation of endogenous anabolic androgenic steroids and its relationship to doping control in sports. // J. Chromatogr. Sei. 2005. 43. 1. P. 32−38.
  44. A.T. Cawley, E.R. Hine, G.J. Trout, A.V. George, R. Kazlauskas. Searching for new markers of endogenous steroid administration in athletes: «looking outside the metabolic box». // Forensic Sei. Int. 2004. 143. 2−3. P. 103−114.
  45. J.-F. Levesque, C. Ayotte. The oral administration of DHEA: the efficiency of steroid profiling. // In Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Gotzmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Strau?. Koln. 1999. P. 213−221.
  46. WAD A, Reporting and evaluation Guidance for testosterone, epitestosterone, T/E ratio and other endogenous steroids, Technical document TD2004EAAS, 2004.
  47. R. Hampl, M. Hill, L. Starka. 7-Hydroxydehydroepiandrosterone epimers in the life span. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2001. 78. 4. P. 367−372.
  48. R. Hampl, L. Starka. 16alpha-hydroxylated metabolites of dehydroepiandros-terone and their biological significance. // Endocr. Regul. 2000. 34. 3. P. 161 163.
  49. L. Starka, R. Hampl, M. Hanus, M. Matouskova, M. Hill. Plasma levels of 7-hydroxymetabolites of dehydroepiandrosterone in healthy Central European aging men. // Clin. Chem. Lab. Med. 2005. 43. 11. P. 1218−1222.
  50. O. Lapcik, R. Hampl, M. Hill, M. Bicikova, L. Starka. Immunoassay of 7-hydroxysteroids: 1. Radioimmunoassay of 7beta-hydroxy dehydroepiandrosterone. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998. 67. 5−6. P. 439−449.
  51. O. Lapcik, R. Hampl, M. Hill, L. Starka. Immunoassay of 7-hydroxysteroids: 2. Radioimmunoassay of 7a-hydroxy-dehydroepiandrosterone. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1999. 71. 5−6. P. 231−237.
  52. M. Davidson, A. Marwah, R.J. Sawchuk, K. Maki, P. Marwah, C. Weeks, H. Lardy. Safety and pharmacokinetic study with escalating doses of 3-acetyl-7-oxo-dehydroepiandrosteronein healthy male volunteers. // Clin. Invest. Med. 2000. 23. 5. P. 300−310.
  53. C.H.L. Shackleton, R.W. Kelly, P.M. Adhikary, C.J.W. Brooks, R.A. Hark-ness, P.J. Sykes, F.L. Mitchell. The identification and measurement of a new steroid 16a-hydroxydehydroepiandrosterone in infant urine. // Steroids. 1968. 12. 6. P. 705−716.
  54. M. Ingelman-Sundberg, A. Anders Rane, J.F. Gustafsson. Properties of hydroxylase systems in the human fetal liver active on free and sulfoconjugated steroids. //Biochem. 1975. 14. 2. P. 429−437.
  55. A.M.H. Brodie, V.C.O. Njar. Aromatase inhibitors in advanced breast cancer: mechanism of action and clinical implications. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998.66. 1−2. P. 1−10.
  56. F.A. Mac Neill, S. Jacobs, M. Dowsett, P.E. Lonning, T.J. Powles. The effects of oral 4-hydroxyandrostenedione on peripheral aromatisation in postmenopausal breast cancer patients. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1995. 36. 3. P. 249−254.
  57. D.J. Handelsman. Testosterone: use, misuse and abuse. // Med. J Aus. 2006. 185. 8. P. 436−439.
  58. M.E. Van Houten, L.J.G. Gooren. Differences in reproductive endocrinology between Asian men and Caucasian men a literature review. // Asian J. Androl. 2000. 2. 1. P. 13−20.
  59. D.P. Lookingbill, L.M. Demers, C. Wang, A. Leung, R.S. Rittmaster, R.J. San-ten. Clinical and Biochemical Parameters of Androgen Action in Normal Healthy Caucasian Versus Chinese Subjects. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1991.72. 6. P. 1242−1248.
  60. M. Okamoto, C. Setaishi, Y. Horiuchi, K. Mashimo, K. Moriya, S. Ito. Urinary excretion of testosterone and epitestosterone and plasma levels of LH and testosterone in the Japanese and Ainu. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1970. 32. 5. P. 673−674.
  61. C. Ayotte. Detecting the Administration of Endogenous Anabolic Androgenic Steroids. // Doping in Sports. D. Thieme, P. Hemmersbach. Springer. London. 2010. 195. P. 78−93.
  62. J. J. Schulze, J. Lundmark, M. Garle, I. Skilving, L. Ekstrom, A. Rane. Doping Test Results Dependent on Genotype of UGT2B17, the Major Enzyme for Testosterone Glucuronidation. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008. 93. 7. P. 25 002 506.
  63. T. Sten, I. Bichlmaier, T. Kuuranne, A. Leinonen, J. Yli-Kauhaluoma, M. Finel. UDPGlucuronosyltransferases (UGTs) 2B7 and UGT2B17 Display
  64. Converse Specificity in Testosterone and Epitestosterone Glucuronidation, whereas UGT2A1 Conjugates Both Androgens Similarly. // Drug Metab. Disp. 2009. 37. 2. P. 417−423.
  65. L. Dehennin. On the Origin of Physiologically High Ratios of Urinary Testosterone to Epitestosterone Consequences for Reliable Detection of Testosterone Administration by Male Athletes. // J. Endocrinol. 1994. 142. 2. P. 353 360.
  66. E. Strahm, P.E. Sottas, C. Schweizer, M. Saugy, J. Dvorak and C. Saudan. Steroid profiles of professional soccer players: an international comparative study. // Br. J. Sport. Med. 2009. 43. 14. P. 1126−1130.
  67. R.C. Miller, E. Brindle, D.J. Holman, J. Shofer, N.A. Klein, M.R. Soules, K.A. O’Connor. Comparison of Specific Gravity and Creatinine for Normalizing Urinary Reproductive Hormone Concentrations. // Clin. Chem. 2004. 50. 5. P. 924−932.
  68. W. Schanzer. Metabolism of anabolic androgenic steroids. // Clin. Chem. 1996. 42. P. 1001−1020.
  69. A.T. Kicman, D.B. Gower. Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical perspectives. // Ann. Clin. Biochem. 2003. 40. 4. P. 321−356.
  70. A.T. Kicman, S.B. Coutts, C.J. Walker, D.A. Cowan. Proposed Confirmatory Procedure for Detecting 5a-Dihydrotestosterone Doping in Male Athletes. // Clin. Chem. 1995. 41. 11. P. 1617−1627.
  71. D.H. Catlin, C.K. Hatton and S.H. Starcevic. Issues in detecting abuse of xeno-biotic anabolic steroids and testosterone by analysis of athletes' urine. // Clin. Chem. 1997. 43. 7. P. 1280−1288.
  72. M. Kohler, M.K. Parr, G. Opfermann, M. Thevis, N. Schlorer, F.-J. Marner, W. Schanzer. Metabolism of 4-hydroxyandrostenedione and 4-hydroxytestosterone: Mass spectrometric identification of urinary metabolites. // Steroids. 2007. 72. 3. P. 278−286.
  73. F. Callies, W. Arlt, L. Siekmann, D. Hubler, F. Bidlingmaier, B. Allolio. Influence of oral dehydroepiandrosterone (DHEA) on urinary steroid metabolites in males and females. // Steroids. 2000. 65. 2. P. 98−102.
  74. M.K. Parr, G. Opfermann. Analytical properties of 4-hydroxysteroids and some esters. // Recent Advances in Doping Analysis, M. Donike, H. Geyer, A. Got-zmann, U. Mareck-Engelke, S. Rauth. Sport und Buch Straufl. Koln. 2004. P. 129−138.
  75. C.W. Weykamp, T.J. Penders, N.A. Schmidt, A.J. Borburgh, J.F. van de Calseyde, B.J. Wolthers. Steroid profile for urine: reference values. // Clin. Chem. 1989. 35. 12. P. 2281−4.
  76. P. E. Sottas, C. Saudan, C. Schweizer, N. Baume, P. Mangin, M. Saugy. From population- to subject-based limits of T/E ratio to detect testosterone abuse in elite sports. // Forensic Sei. Int. 2008. 174. 2−3. P. 166−172.
  77. Eurachem. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics. Eurachem. Teddington. 1998.
  78. P. E. Sottas, M. Saugy, C. Saudan. Endogenous steroid profiling in the athlete biological passport. // Endocrinol. Metab. Clin. North. Am. 2010. 39. 1. P. 5973.
  79. A. P. Worth, M. T. D. Cronin. The use of discriminant analysis, logistic regression and classificationtree analysis in the development of classification models for human health effects. // J Mol. Struct. (Theochem). 2003. 622. 1−2. P. 97 111.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?