Обнаружение и дифференциация энтеровирусов человека на основе анализа 5'-НТР генома

Актуальность проблемы. Энтеровирусы человека (сем. Picornaviridae, род Enterovirus), характеризуются иммунологическим и генетическим многообразием. Подавляющее большинство энтеровирусов человека являются патогенными, вызывая заболевания, полиморфные по клиническим проявлениям (полиомиелит, нейропатии, серозный менингит, миокардиты, гастроэнтерит, респираторные заболевания, конъюнктивиты и т. д.) и различные по тяжести течения. Многие заболевания энтеровирусной природы представляют важную проблему здравоохранения, некоторые из них имеют тенденцию к эпидемическому распространению. Установлена этиологическая связь энтеровирусной инфекции с патологией матери, плода и ребенка [7, 12, 22, 23,25,44].

Значимость энтеровирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления, а при расшифровке случаев групповой заболеваемости — и типирования возбудителя. Множество иммунологических типов энтеровирусов, различная чувствительных клеточных культур к отдельным представителям рода предопределяют длительность и трудоемкость традиционных методов выявления энтеровирусов и делают актуальной разработку новых подходов к решению проблемы обнаружения и дифференциации энтеровирусов. Прогресс молекулярной биологии и открытие принципов ПЦР дали возможность разработки альтернативных экспрессных, высокочувствительных и специфичных методов обнаружения энтеровирусов в клиническом материале и объектах внешней среды, что расширяет методическую базу эпидемиологического надзора за циркуляцией неполиомиелитных энтеровирусов и вирусов полиомиелита.

Цель исследования: Разработать комплексный метод выявления и дифференциации РНК энтеровирусов и охарактеризовать особенности циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода на современном этапе.

Задачи исследования:

1. С использованием компьютерных программ провести сравнительный анализ известных нуклеотидных последовательностей генома энтеровирусов. Подобрать олигонуклеотидные праймеры для обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека.

2. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК энтеровирусов в различных биологических субстратах.

3. Провести разработку метода ПДРФ-дифференциации 5'-НТР генома энтеровирусов человека.

4. С использованием типовых штаммов энтеровирусов человека и РНК энтеровирусов, выделенных от больных охарактеризовать SSCP-типы 5'-НТР генома. Оценить возможность применения SSCP-типирования фрагментов кДНК генома энтеровирусов в эпидемиологической практике.

5. Определить частоту обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом и другими нейроинфекциями, охарактеризовать гетерогенность энтеровирусов, циркулировавших в Н. Новгороде в 1999;2002 гг.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработаны оригинальные методические подходы для выявления и дифференциации РНК энтеровирусов, основанные на анализе одного и того же участка 5'-НТР генома: впервые подобрана серия олигонуклеотидных праймеров, позволяющая проводить выявление РНК энтеровирусов человека методом ОТ-ПЦР с одновременной дифференциацией на 2 геногруппы по 5'-НТР генома. впервые подобран и применен на практике оригинальный набор рестриктаз для анализа методом ПДРФ 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы II с целью идентификации генетических маркеров полиовирусов вакцинного происхождения. Новизна предложенного способа выявления и дифференциации энтеровирусов подтверждена патентом на изобретение № 2 189 396 «Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов». Приоритет от 27.10.2000. впервые в России дана характеристика SSCP-типов 5'-НТР генома энтеровирусов человека. Показаны многообразие SSCP-типов 5'-НТР генома энтеровирусов человека и возможность использования в качестве эпидемиологического маркера. впервые комплексное исследование 5'-НТР генома энтеровирусов было применено при расшифровке групповых заболеваний. Установлена роль энтеровирусов в возникновении 3-х групповых заболеваний ОКИ.

Предложенный комплекс методов обнаружения и дифференциации энтеровирусов человека (ПЦР, ПЦР-ПДРФ и ПЦР-SSCP) был применен в совместной работе с вирусологической лабораторией ЦГСЭН в Нижегородской области при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и анализе проб сточных вод с очистных сооружений Нижегородской области. Полученные результаты использовались в эпиднадзоре за энтеровирусными инфекциями.

Внедрение результатов исследования в практику.

Методические рекомендации № 2001/121 «ПЦР-ПДРФ выявление и дифференциация РНК энтеровирусов человека». Утверждены МЗ РФ 31.05.2001 г.

Методические рекомендации «Энтеровирусные инфекции. Этиология, клиника, диагностика и профилактика». Утверждены Департаментом здравоохранения Нижегородской области в 2000 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплекс оптимизированных приемов, включающий бесфенольную экстракцию РНК из разнообразного вируссодержащего материала, детекцию РНК методом ОТ-ПЦР с помощью сконструированных праймеров, комплементарных консервативным участкам 5'-НТР генома, обеспечивает надежное выявление энтеровирусов человека в пробах от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектах внешней среды с одновременным типированием на две 5'-НТР геногруппы.

2. Профиль ПДРФ и SSCP-тип 5'-НТР генома энтеровирусов являются штаммовыми признаками и могут быть использованы в качестве эпидемиологических маркеров.

3. Территория Нижнего Новгорода в 1999;2002 гг. характеризовалась низкой активностью циркуляции и разнообразием генетических вариантов нейротропных энтеровирусов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на практическом симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций (аналитика, диагностика, техника, экономика)», проходившем в рамках Национальных дней России-99 (Москва, 12−14 октября 1999 г.).

Материалы диссертации обсуждались на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И. Н. Блохиной МЗ РФ и проблемных научно-практических семинарах института.

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И. Н. Блохиной 25 февраля 2003 г.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 262 литературных источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан и апробирован в практике эпиднадзора унифицированный метод амплификации к ДНК 5'-НТР генома, позволяющий одновременно выявлять и дифференцировать РНК энтеровирусов человека на 2 геногруппы.

2. Предложен метод высокосолевой очистки РНК, эффективный при выявлении энтеровирусов в фекалиях, СМЖ, носоглоточных смывах, сыворотке крови.

3. На основе анализа рестриктных карт участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека подобран оригинальный набор рестриктаз (Ava I, Bam Н I, Nco I для Sabin 1, Ava I, Alu I, Cla I, Sma I для Sabin 2, Alu I, Nco I, Pvu II для Sabin 3) для идентифицикации 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов методом ПДРФ.

4. Показана штаммовая специфичность SSCP-типа кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов и возможность использования его в качестве эпидемиологического маркёра. С использованием ПЦР-SSCP-типирования установлена роль энтеровирусов в возникновении групповых заболеваний ОКИ в Нижегородской области.

5. Из 280 пациентов с подозрением на вирусную нейроинфекцию РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР обнаружена: при нейропатиях в 13,1% случаев, при энцефалите и менингоэнцефалите -15,8%, при серозном менингите — 45,2% случаев.

6. Установлено, что территория Нижнего Новгорода в 1999;2002 гг. характеризовалась низкой активностью циркуляции нейротропных энтеровирусов. Показано преобладание энтеровирусов неполиомиелитной 5'-НТР-геногруппы, их генетическая неоднородность и формирование доминирующего генетического варианта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Значимость энтеровирусов в патологии человека обусловлена их широкой распространённостью, способностью вызывать острые и хронические заболевания, различающиеся по клиническим проявлениям и тяжести течения. Многие заболевания энтеровирусной природы представляют важную проблему здравоохранения и имеют тенденцию к эпидемическому распространению, что определяет необходимость своевременного выявления и идентификации энтеровирусов, оценки их вирулентных свойств и уровня циркуляции среди населения.

В конце 80-х гг. XX века при исследованиях генома энтеровирусов стали использовать метод ОТ-ПЦР. Наибольшее практическое применение получили способы выявления РНК энтеровирусов человека с использованием универсальных праймеров, впервые позволившие проводить диагностику энтеровирусной инфекции, удовлетворяющую запросам клиники. Однако, при проведении эпидемиологических исследований простого обнаружения вирусов недостаточно, необходим дифференциальный анализ. Особую значимость типирование энтеровирусов приобретает при наблюдении за циркуляцией полиовирусов. В этом случае имеют значение не только определение серотипа полиовируса, но и идентификация его происхождения от дикого или вакцинного полиовируса, оценка степени изменчивости дериватов вакцинных полиовирусов. При расшифровке случаев групповой заболеваемости необходимы дифференциация и оценка гетерогенности штаммов энтеровирусов.

На момент начала нашей работы в большинстве имевшихся в научной литературе сообщений о молекулярно-генетических методах типирования энтеровирусов описывались способы идентификации РЖ методом ОТ-ПЦР с помощью типоспецифичных олигонуклеотидных праймеров, что не удобно для ориентации в типовом многообразии энтеровирусов. Публикации о применении ОТ-ПЦР в комплексе с другими молекулярными методами для дифференциации и типирования энтеровирусов были единичными. В России публикации об опыте применения молекулярно-генетических методов в лабораторной диагностике энтеровирусных инфекций касались генотипирования только полиовирусов.

Целью настоящего исследования являлась разработка унифицированного комплексного метода, с помощью которого выявление и дифференциация РНК энтеровирусов человека могут быть осуществлены путем анализа одного и того же фрагмента вирусного генома, а также характеристика особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н Новгорода с применением разработанных методических подходов.

На первом этапе работы были подобраны олигонуклеотидные праймеры, с помощью которых можно проводить специфичную амплификацию в ОТ-ПЦР РНК всех энтеровирусов человека. К началу наших исследований было известно, что самой высококонсервативной областью генома энтеровирусов является 5' -НТР, кроме того, в результате филогенетического анализа этой области генома энтеровирусы человека были разделены на 2 геногруппы. Классификация энтеровирусов человека на 2 геногруппы на основе последовательности 5'НТР генома послужила основанием для подбора праймеров, позволяющих определять принадлежность энтеровирусов к той или иной геногруппе, что может быть полезным инструментом для ориентации в многообразии типов энтеровирусов и являться первым шагом в генотипировании вирусных изолятов. В результате сравнительного анализа 48 нуклеотидных последовательностей генома энтеровирусов человека 27 серотипов, собранных в базах данных DDBJ/EMBL/GenBank, с использованием программы Clustal X нами подобрана серия олигонуклеотидных праймеров: EvFl, EvRl, EvR2, EvIF2, EvIIF2. С помощью EvRl, EvFl, EvR2 в «полугнездовом» варианте ПЦР можно синтезировать фрагмент кДНК всех энтеровирусов человека длиной 534 п.н., размер ампликона которой удовлетворяет требованиям ПДРФ. В «гнездовом» варианте ПЦР с применением набора праймеров EvRl и EvFl для 1-го раунда и EvR2, EvIF2 и EvIIF2 для 2-го раунда, будут синтезироваться кДНК всех энтеровирусов человека и, одновременно, дифференцироваться на 2 геногруппы. Праймер EvIF2 является специфичным в отношении геногруппы I, включающей вирусы Коксаки, А 7, 9 и 16, вирусы Коксаки В 1−6, все вирусы ECHO, энтеровирусы 69 и 71 (размер фрагмента 291 п.н.), праймер EvIIF2 — в отношении геногруппы II, включающей полиовирусы, вирусы Коксаки, А 13, 18, 21 и 24, энтеровирусы 68 и 70 (размер фрагмента 321 п.н.). Такая дифференциация энтеровирусов с одновременным их обнаружением предложена нами впервые.

Специфичность подобранных олигонуклеотидных праймеров была проверена на прототипных штаммах вирусов Коксаки, А 7, 9, 13, 18, Коксаки В 1−6, ECHO 1−9, 11−20, 24−27, 29−33, энтеровирусов 68−71, полиовирусов 1−3 шт. Sabin, параэховирусов 1 и 2, ВГА шт. HAS 15, ротавируса шт. SA-11. В результате «полугнездовой» ПЦР с использованием праймеров EvRl, EvFI и EvR2 амплифицировались РНК энтеровирусов человека и не амплифицировались РНК параэховирусов, ВГА и ротавирусов, что свидетельствовало о специфичности сконструированных праймеров. В варианте «гнездовой» ПЦР с парой праймеров EvR2-EvIF2 специфично амплифицировались кДНК энтеровирусов геногруппы ЭВ1, с парой EvR2-EvIIF2 — к ДНК энтеровирусов геногруппы ЭВП.

С целью оптимизации метода пробоподготовки материалов от больных для исследования методом ПЦР мы провели сравнительный анализ выявляемое&tradeРНК энтеровирусов в биологических жидкостях с использованием традиционного фенол-хлороформенного способа экстракции НК и высокосолевого способа, рекомендованного Мейхи для экстракции НК вирусов, в собственной модификации. В модельном опыте соотношение ПЦР-положительных проб, контаминированных минимальным количеством вируса (0,01 TCID50), при солевом и фенол-хлороформенном способе обработки составляло 10: 9. Частота обнаружения энтеровирусов методом ОТ-ПЦР при тестировании одних и тех же биопроб от 88 больных не отличалась достоверно в зависимости от способа экстракции РНК. Полученные результаты свидетельствуют, что солевой способ экстракции РНК энтеровирусов не менее эффективен, чем классический с фенол-хлороформенной депротеинизацией, и позволяет выявлять РНК в фекалиях, СМЖ, сыворотке крови, носоглоточных смывах и концентратах сточных вод.

Таким образом, представленные результаты апробации разработанного нами варианта ОТ-ПЦР для выявления РНК всех энтеровирусов человека свидетельствуют, что этот метод в комплексе с оптимизированным способом высокосолевой экстракции РНК эффективен при тестировании различных биопроб от больных: фекальных проб, СМЖ, носоглоточных смывов, сывороток крови.

На следующем этапе наших исследований была проведена разработка методов дифференциации энтеровирусов по 5'-НТР генома. Анализ рестриктных карт последовательностей кДНК 5'НТР генома 48 шт. энтеровирусов человека, построенных с помощью программы MicroGeni, показал, что профили ПДРФ кДНК 5'-НТР генома, полученные путем обработки одними и теми же рестриктазами, могут совпадать у энтеровирусов разных серотипов и в тоже время, могут быть различными у штаммов, принадлежащих одному серотипу.

На основании полученных данных был сделан вывод, что профиль ПДРФ кДНК 5'-НТР генома может быть использован как штаммовый признак энтеровируса, но не пригоден для определения серотипа. В связи с этим мы ограничили задачу наших исследований, связанных с рестриктных анализом, разработкой вариантов ПДРФ для идентификации к ДНК 5'-НТР генома вакцинных и диких полиовирусов. Поскольку энтеровирусы человека формируют по 5'-НТР генома 2 геногруппы, а идентификация геногруппы упрощает ориентацию в многообразии энтеровирусов, первым этапом дифференциации изолятов энтеровирусов на геногруппы была выбрана ПЦР с группо-специфичными праймерами: EvIF2 и EvIIF2, и общим праймеромEvR2. Сайты рестриктаз были идентифицированы как на КДНК534, получаемой в результате «полугнездовой» ПЦР, так и на КДНК321, синтезируемой в процессе «гнездового» варианта ПЦР.

В результате анализа рестриктных карт участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека, относящихся к геногруппе II, были подобраны рестриктазы Alu I, Ару I, Asu II, Ava I, Ava II, BamH I, Bfa I, Cla I, Нае II, Hga I, Hha I, Hph I, Mlu I, Mly I, Nci I, Nco I, Nru I, Nsp BII, PflM I, Pvu II, Sma I, Sty I, Tsp 5091, Xma I, с помощью которых можно идентифицировать генетические маркеры вакцинных и родственных им полиовирусов, а также маркеры, свойственные нейровирулентым предшественникам вакцинных полиовирусов.

Анализ кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы II методом ПДРФ, реализуемый при использовании малого набора рестриктаз, был проверен на кДНК вакцинных штаммов Сэйбина. Рестриктазы Ava I, Bam Н I, Nco I специфично гидролизовали кДНК генома полиовируса Sabin 1- Ava I, Cla I, Sma I — к ДНК Sabin 2- Nco I, Pvu II — к ДНК Sabin 3. Рестриктаза Alu I специфично гидролизовала кДНК всех трех вакцинных полиовирусов, при этом для кДНК полиовируса каждого типа получался свой, отличный от других профиль ПДРФ. Экспериментальные профили к ДНК 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов Sabin совпали с теоретически рассчитанными. Рестриктаза Ava II не гидролизует кДНК вакцинных полиовирусов, но узнает кДНК диких предшественников полиовирусов Sabin 1 и Sabin 2 и может быть использована для определения реверсий у дериватов этих вирусов.

Новизна разработанного способа дифференциации энтеровирусов методом ПДРФ защищена патентом [Патент на изобретение № 2 189 396 «Способ обнаружения и дифференциации РНК энтеровирусов». Приоритет от 27.10.2000].

Разработанный способ ПДРФ применили для анализа 8 ампликонов, чья принадлежность к энтеровирусам геногруппы II была установлена типированием методом ПЦР 119 РНК энтеровирусов. Четыре из них были обнаружены в пробах неврологических больных и 4 в концентратах сточных вод. В результате ПДРФ-анализа было идентифицировано происхождение от вакцинных полиовирусов к ДНК 5'НТР генома 5-ти изолятов энтеровирусов геногруппы II. При исследовании тех же проб в культуре ткани Нер-2, проведенных параллельно в вирусологической лаборатории ЦГСЭН, полиовирусы были выделены только в 3 случаях, при этом тип вируса совпадал с типом вакцинного вируса, определенным методом ПДРФ кДНК 5'НТР генома. Тип и происхождение остальных трех изолятов энтеровирусов геногруппы II не были выяснены. Профили ПДРФ кДНК 5'-НТР генома этих энтеровирусов не были характерны для штаммов Sabin и их диких предшественников, что позволяет отнести их к неполиомиелитным энтеровирусам.

Таким образом, проведенное исследование показало возможность применения разработанного способа ПЦР-ПДРФ как для сравнительной характеристики изолятов полиовирусов, выделенных в культуре ткани, так и для идентификации последовательностей, характерных для 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов, непосредственно после обнаружения РНК природного энтеровируса в исследуемой пробе методом ОТ-ПЦР. Также эти исследования позволили показать преимущественную циркуляцию на территории Н. Новгорода энтеровирусов неполиомиелитной геногруппы I. Все исследованные изоляты идентифицированных полиовирусов имели генетические характеристики 5'-НТР генома штаммов Сэйбина.

Результаты идентификации 5'-НТР генома вакцинных полиовирусов методом ПДРФ предоставлялись в областной центр ГСЭН в Нижегородской области и использовались в эпиднадзоре за энтеровирусными инфекциями.

Другим молекулярно-генетическим методом, позволяющим проводить дифференциацию штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, является SSCP-метод. Мы применили технологию SSCP для анализа кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы I с целью оценки гетерогенности циркулирующих вариантов энтеровирусов.

На первом этапе было проведено изучение SSCP-профилей 42 прототипных штаммов энтеровирусов. В результате было установлено широкое разнообразие SSCP-профилей кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов. Практически все проанализированные штаммы энтеровирусов имели свои картины распределения одиночных нитей кДНК 5'-НТР-генома. Исключение составили штаммы вируса ECHO 4 и вируса ECHO 7, энтеровируса 71 и вируса ECHO 29, SSCP-профили которых, соответственно, попарно были идентичны.

Для изучения стабильности 5'-НТР генома штаммов энтеровирусов, принадлежащих одному серотипу были проанализированы к ДНК 3-х штаммов вируса ECHO 6: прототипного 3314/1213, и двух, выделенных в Нижнем Новгороде в 1981 и 1999 гг. SSCP-профили кДНК всех 3-х вирусов были различны, что свидетельствовало об изменении первичной структуры 5'-НТР генома в процессе длительной циркуляции. Полученные нами результаты, нашедшие подтверждение в исследованиях других авторов, свидетельствуют, что SSCP-тип 5'-НТР генома энтеровирусов не является серотипспецифичным признаком и не может быть использован для идентификации серотипа. Это может быть связано с естественной изменчивостью, которая является результатом мутаций или межтиповых внутримолекулярных рекомбинаций, происходящих во время циркуляции энтеровирусов среди населения. Полученные результаты свидетельствуют, что специфичность SSCP-типа 5'-НТР генома энтеровирусов, также как и ПДРФ-профиля, не может распространяться дальше штамма.

Возможность использования SSCP-типа энтеровируса как стабильного признака штамма подтвердилась экспериментальным фактом: SSCP-профили кДНК 5-ти штаммов вируса Коксаки В 6, выделенных от больных с разными клиническими проявлениями энтеровирусной инфекции в Нижнем Новгороде в течение одного сезона (1981 г.), были идентичны.

Метод SSCP, с оптимизированными условиями постановки электрофореза (для продуктов ОТ-ПЦР с использованием подобранных праймеров), был применен для анализа РНК энтеровирусов геногруппы I, выявленных при расшифровке 2-х групповых заболеваний (групповое заболевание ОКИ с респираторными симптомами в медицинском училище г. Н. Новгорода в 1999 г. и вспышка ОКИ в детском летнем лагере в 2002 г.). высокая частота обнаружения энтеровирусов у заболевших и контактных лиц, идентичность SSCP-профилей кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов, выявленных внутри каждой группы заболевших, дала основание полагать, что этиологической причиной данных заболеваний была энтеровирусная инфекция. Кроме того, единообразие профилей кДНК указывало на единый источник инфекции — больного. При этом SSCP-типы у вирусов, вызвавших эти вспышки, различались, что свидетельствовало о том, что каждое групповое заболевание было вызвано разными энтеровирусами. При изучении эпиднеблагополучия в санатории Нижегородской области был установлен значительный полиморфизм SSCP — профилей энтеровирусов, обнаруженных у 13 из 15 сотрудников пищеблока и в пробе питьевой воды. При этом SSCP-тип энтеровируса, выявленного в воде, совпал с SSCP-типом, который был идентифицирован у энтеровирусов, выявленных у 3-х человек. Полученные результаты указывали на источник инфекции — загрязненную воду.

Таким образом, при изучении возможности применения метода SSCP для генотипирования энтеровирусов человека было установлено, что SSCP-профиль анализируемого нами участка 5'-НТР генома энтеровирусов человека является стабильным признаком штамма и может быть использован в качестве эпидемиологического маркёра при оценке гетерогенности вирусных изолятов и расшифровке вспышек заболеваний энтеровирусной природы.

Разработанные методы анализа 5'-НТР генома энтеровирусов человека, были применены при изучении особенностей циркуляции нейротропных энтеровирусов в Нижнем Новгороде в период 1999;2002 гг.

Оптимизированный «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР с использованием праймеров EvRl, EvFl, EvR2, EvLF2 и EvIIF2 в комплексе с высокосолевым способом пробоподготовки применили для обнаружения РНК энтеровирусов в фекалиях, СМЖ, сыворотке крови, носоглоточных смывах неврологических больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию. Всего было исследовано 688 проб. Частота обнаружения РЖ энтеровирусов в фекалиях составила 22,73%, в СМЖ — 17,73%, в носоглоточных смывах -11,81%, в сыворотках крови 10,93%. Показательно, что достаточно часто РНК энтеровирусов выявлялась в сыворотках крови. Известно, что выделение энтеровирусов из сывороток крови на клеточных культурах мало эффективно вследствие образования иммунных комплексов с нейтрализующими антителами. При ПЦР исследовании этот лимитирующий фактор не действует, благодаря чему результативность выявления энтеровирусов у больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию методом ОТ-ПЦР может быть повышена путем включения сывороток крови в спектр анализируемых биопроб.

Для того, чтобы оценить влияние тестирования расширенного спектра биопроб на выявляемость энтеровирусов при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию, были проанализированы данные обнаружения РНК энтеровирусов в разных материалах от 60 больных серозным менингитом с положительным результатом ПЦР-исследования у которых были взяты четыре пробы: фекалии, СМЖ, сыворотка крови и носоглоточный смыв. Частота обнаружения РНК энтеровирусов у этих больных в фекалиях составляла 51,67 ± 6,45%, в СМЖ — 40,00 ± 6,32%, в носоглоточных смывах 21,67 ± 5,32%, в сыворотке крови 18,33 ± 5,00%. РЖ энтеровирусов в ряде случаев была обнаружена только в одной из проб: в фекалиях в 35,00%, в СМЖ -30,00%, в сыворотке крови — 8,33%, реже в носоглоточных смывах -3,33%. Таким образом, результаты нашей работы свидетельствуют о целесообразности комбинирования разных типов биопроб при обследовании больных на энтеровирусы. В нашем случае выявляемость энтеровирусов при комбинированном исследовании четырех биопроб повысилась почти в 2 раза по сравнению исследованием только фекалий и в 2,5 раза — с СМЖ.

В период с 1999 по 2002 гг. с использованием метода ОТ-ПЦР было обследовано 280 неврологических больных, госпитализированных в инфекционные стационары г. Н. Новгорода с диагнозом: серозный менингит, менингоэнцефалит и энцефалит, нейропатии (полинейропатия, полинейрорадикулопатия, мононейропатия, неврит лицевого нерва). При комплексном исследовании различных биопроб РЖ энтеровирусов была обнаружена у 94 больных (33,57%). Частота обнаружения энтеровирусов у при нейропатиях — 13,1%, при энцефалите и менингоэнцефалите — 15,79%, при серозном менингите — 45,2%. Полученные результаты частоты обнаружения энтеровирусов при разных формах нейроинфекций соответствуют многочисленным многолетним данным наблюдения за энтеровирусными инфекциями, в результате которых было установлено, что серозный менингит является одним из наиболее частых клинических проявлений энтеровирусной инфекции.

Спорадические случаи асептического серозного менингита (АСМ) стали регистрироваться в г. Горьком (сейчас г. Нижний Новгород) начиная с 60-х годов. С точки зрения роли энтеровирусов в возникновении АСМ в г. Горьком М. В. Троицкой был изучен период 1976;1988 гг. Представляло научный и практический интерес охарактеризовать динамику заболеваемости АСМ и роль энтеровирусов в её- возникновении на современном этапе с применением разработанных нами молекулярно-генетических методов.

Для анализа многолетней динамики заболеваемости АСМ были привлечены официальные данные аналитического отдела городского центра СЭН по Н. Новгороду. Анализ 27 летних данных показал относительно низкий уровень заболеваемости АСМ. Начиная с 1976 г. выраженные подъёмы заболеваемости АСМ наблюдались в 1987 г. (6,4 °/ооооо), 1989 г. (14,0 °/ооооо) и 1998 г. (6,3 °/ооооо) — В исследованный нами период времени (1999;2002 г.) максимальный подъём заболеваемости АСМ наблюдался в 2000 г. (5,0%оооо). При этом, средняя частота обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом составляла 56,5%, достигая в июле-августе 74%.

Динамика интенсивности эпидпроцесса серозного менингита с подтвержденной энтеровирусной инфекцией за 4-х летний период абсолютно повторяла динамику регистрируемой заболеваемости АСМ, что может свидетельствовать о ведущей роли энтеровирусов в возникновении этого заболевания в Н. Новгороде.

Все РНК энтеровирусов, обнаруженные в пробах больных серозным менингитом (п=91), были типированы методом ПЦР. Установлено, что.

Все РНК энтеровирусов, обнаруженные в пробах больных серозным менингитом (п=91), были типированы методом ПЦР. Установлено, что большинство изолятов энтеровирусов (96,6%) принадлежат I геногруппе (неполиомиелитных) энтеровирусов по 5'-НТР генома. В пробах от двух больных (3,4%) были идентифицированы энтеровирусы геногруппы II, в состав которой входят полиовирусы. В результате ПДРФ-анализа к ДНК изолятов энтеровирусов геногруппы II генетических маркеров полиовирусов выявлено не было.

С целью изучения разнообразия циркулирующих вариантов энтеровирусов кДНК генома энтеровирусов геногруппы I, обнаруженных у больных серозным менингитом, были проанализированы методом SSCP. Зарегистрировано 22 SSCP-5'HTP типа, что свидетельствовало о генетическом полиморфизме циркулирующих энтеровирусов. В период подъёма заболеваемости АСМ в 2000 г. преобладал (62,5%) один геновариант. В предыдущий 1999 г. этот вариант энтеровируса был обнаружен только в одном случае АСМ. Это дало основание полагать, что подъём заболеваемости серозным менингитом был связан с формированием штамма энтеровируса с повышенной нейровирулентностью.

Проведенная характеристика SSCP-типов кДНК 5'-НТР генома энтеровирусов, выявленных у неврологических больных, позволила определить значение SSCP-типирования при анализе спорадической заболеваемости энтеровирусными инфекциями, которое заключается в изучении гетерогенности энтеровирусов, циркулирующих среди населения, и выделении доминирующего типа с целью его последующей характеристики.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы был разработан комплексный метод, в котором выявление и дифференциация энтеровирусов осуществляются путем анализа одного и того же участка 5'-НТР генома. Этот комплекс методов включает: выявление РНК энтеровирусов методом ОТ-ПЦР в широком наборе биопроб с одновременной дифференциацией на 2 геногруппыидентификацию генетических маркеров вакцинных полиовирусов методом ПДРФоценку гомогенности или гетерогенности изолятов энтеровирусов методом SSCP. На основе анализа частоты обнаружения энтеровирусов у больных серозным менингитом и другими нейропатиями, многолетней динамики заболеваемости серозным менингитом и оценки гетерогенности энтеровирусов показана низкая активность циркуляции нейротропных энтеровирусов среди населения Н. Новгорода в 1999;2002 гг. Эффективность разработанных методов, подтвержденная при обследовании больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и объектов внешней среды, расшифровке групповых заболеваний энтеровирусной природы и анализе гетерогенности циркулирующих энтеровирусов, позволяет рекомендовать данный способ обнаружения и дифференциации энтеровирусов для применения в практике вирусологических исследований.