Актуальность проблемы. Старение — это комплексный биологический процесс, связанный с прогрессивным снижением физиологических и биохимических функций индивидуальных тканей или органов. Старение характеризуется «тетрадой»: поражением мембран, инактивацией ферментов, нарушением клеточного деления и накоплением балластных полимеров, включая нуклеиновые кислоты, липиды и белки (Обухова Л.К., 1983). Особое значение в процессе старения приобретает окислительный стресс, так как он носит прогрессирующий и нарастающий характер. Согласно свобоно-радикальной теории старения нарушение биологического механизма ингибирования свободно-радикального окисления может быть пусковым фактором для развития различных возраст-ассоциированных патологий и процессов старения. Анализ тканевых повреждений показывает, что в условиях возрастного дисбаланса прои антиоксидантных систем белки являются одной из первичных мишеней для окислительного стресса. Окисленные модифицированные белки вовлекают в последующие процессы липиды клеточных мембран, что приводит к необратимым повреждениям клетки (Болдырев A.A., 2003).
В клетках активные кислородные метаболиты (АКМ) вызывают различные повреждения белковых молекул, такие как окисление аминокислотных остатков, образование белок-белковых сшивок, фрагментация молекул. Взаимодействие белков со свободными радикалами и активными формами кислорода (АФК) приводит к образованию гидроперекисей, альдегидов и других реакционных соединений. Присутствующие в клетках ферменты репарации белков (протеиназы, протеазы, пептидазы) расщепляют поврежденные молекулы до аминокислот и низкомолекулярных продуктов с целью их повторного использования или выведения из организма. Содержание окислено модифицированных белковых соединений в клетках, органах или целом организме представляет собой удобный показатель для оценки развития окислительного стресса (Зенков Н.К., 2003).
Предполагают, что встроенные в полипептидную цепь остатки аспарагина и глутамина действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы (Robinson A.B., 2001). Было показано, что амиды дикарбоновых аминокислот вовлечены в процесс старения. Изменение степени амидированности влечет за собой локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Белизи С.,
2001; Бибов М. Ю., 2004; Назарова И. Н., 2005; Robinson N.E., 2002). Можно предположить, что между генетически преопределенными посттрансляционными модификациями (ПТМ) и интенсивностью индуцированных окислительных процессов, участвующих в молекулярных механизмах развития старения, существуют сложные многосторонние связи.
Цель и задачи исследования
Целью работы явилось установление взаимосвязи окислительных модификаций и степени амидированности тканевых и индивидуальных белков в условиях физиологического и модельного старения.
В работе решались следующие задачи:
1. Изучить динамику степени амидированности суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс на различных этапах постнатального онтогенеза (2,4, 16, 18, 20 и 24 мес.).
2. Исследовать возрастную динамику окислительных модификаций суммарных белков по образованию карбонильных групп и уровню сульфгидрильных групп в различных тканях белых крыс.
3. Разработать модифицированный способ получения очищенного препарата сывороточного альбумина (СА) крыс.
4. Определить степень амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, содержанию сульфгидрильных групп, изменению собственной флуоресценции и флуоресценции остатков тирозина и триптофана сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс.
5. Изучить динамику амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, уровню сульфгидрильных групп, изменению флуоресценции остатков тирозина и триптофана бычьего сывороточного альбумина (БСА) сразу и при инкубации в течение 7, 14 и 28 суток в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37°С).
6. Исследовать влияние концентрации компонентов среды Фентона и времени инкубации на интенсивность окислительных модификаций и степени деструкции БСА по образованию карбонильных групп, изменению собственной флуоресценции белка и остатков тирозина и триптофана и электрофоретической гетерогенности.
7. Изучить влияние металл-катализируемых окислительных модификаций, индуцированных системой Фентона, на степень амидированности БСА.
Научная новизна работы: Впервые сопоставлена тканевая специфика степени амидированности и окислительных модификаций суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс разного постнатального возраста
2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.). Разработана новая, простая и экономичная модификация метода выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс. Впервые установлена зависимость степени амидированности сывороточного альбумина от условий индуцированного металл-катализируемого окисления в среде Фентона. Определены корреляционные связи между интенсивностью окислительных модификаций и степенью амидированности сывороточного альбумина в условиях физиологического и модельного старения.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Динамика степени амидированности и окислительной модификации суммарных белков при старении белых крыс индивидуальна для каждой из исследованных тканей.
2. Инкубация в среде Фентона изменяет в БСА не только уровень окислительной модификации, но и содержание амидных групп.
3. Старение БСА в условиях, моделирующих физиологические, приводит к изменению посттрансляционных модификаций и конформационным последствиям, сопоставимым с изменениями в СА крыс при их физиологическом старении.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют существенное значение для понимания молекулярных механизмов, происходящих при старении белков как in vitro, так и in vivo.
В ходе старения животных наблюдается разнонаправленный характер изменений как степени амидированности, так и окислительных модификаций суммарных белков различных тканей крыс. Однако четкой зависимости между посттрансляционными модификациями суммарных белков различных тканей и их способностью к обновлению не выявлено.
В отличие от разнонаправленных динамик содержания амидных, карбонильных и сульфгидрильных групп в суммарных белках, отличающихся тканевой спецификой, посттрансляционные модификации индивидуального белка (сывороточного альбумина) имеют сходную картину как при физиологическом, так и при модельном старении.
Важным в теоретическом плане является установление взаимосвязи между степенью амидированности и окислительными модификациями белков, выявляемые по содержанию карбонильных групп, битирозиновых сшивок и окислению триптофана.
Полученные в работе результаты свидетельствуют о сопряжении спонтанных и индуцированных посттрансляционных модификаций, являющихся пусковым механизмом конформационных изменений белков, приводящих к нарушению их функциональной активности и накоплению во времени их аномальных, модифицированных форм.
Обнаруженная взаимосвязь между окислительной модификацией белка и степенью его амидированности имеет принципиальное значение, поскольку позволяет объяснить наблюдавшееся ранее увеличение амидированности белков в некоторых тканях при состояниях организма, сопряженных с окислительным стрессом.
Разработка модифицированного способа выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс позволяет упростить и сократить во времени базовый метод, не нанося ущерба степени чистота и гомогенности препарата.
Материалы, полученные в работе, используются на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета при чтении спецкурсов «Биология старения» и «Химия белка с основами биокатализа».
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием, (Новосибирск, 2008) — 8-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008) — Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2008) — 3-й Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009) — 9-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2010) — 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых. «Биология — Наука 21-го века» (Пущино, 2010) — 2-й Международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2011) — Юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 — в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Возрастные изменения содержания амидных, сульфгидрильных и карбонильных групп в суммарных белках разных тканей белых крыс
Задачей данного раздела работы явилось установление общих закономерностей и тканевой специфики изменений амидированности, содержания сульфгидрильных и карбонильных групп в суммарных белках скелетных мышц, сердца, больших полушарий мозга, печени, селезенки и тестикул крыс разного возраста. Избранные ткани отличаются, функциями, белковым составом и интенсивностью обмена белков. По приведенной в обзоре литературы классификации избранные ткани содержали постмитотические необновляемые (мышцы, сердце, мозг) и постмитотические обновляемые (печень, селезенка, тестикулы) клетки.
Для тканей, за исключением мозга, исследованы возрастные группы 2, 4, 16, 18 и 24 месячных животных. Возрастные изменения рассматривались относительно 2-х месячного возраста. Ткань мозга исследована у молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) животных. Возрастные группы избраны на основе данных таблицы 1 обзора литературы.
Выбор 2-х месячных животных в качестве контроля обусловлен увеличением скорости возрастных изменений в большинстве органов и тканей позвоночных с наступлением половой зрелости. Экспериментально установлено, что интенсивность накопления возрастных изменений значительна не в старости, а в более ранние возрастные периоды (Фролькис В.В., 1992).
3.1.1. Изменение содержания амидных групп суммарных белков тканей белых крыс при старении
Основной причиной образования аномальных по структуре и функциям белков являются их постсинтетические изменения. Немаловажное значение в постсинтетических изменениях структуры белковой молекулы играет неферментативное дезамидирование Асн и Глн. Неферментативное дезамидирование — гидролитическая реакция, требующая для образования продукта только наличие воды (Wright Н.Т., 1991). Оба продукта этой гидролитической реакции — природные аминокислоты аспартат (Асп) и глутамат (Глу) (Robinson А., 2001; Robinson N., 2004; Назарова И. Н., 2005).
Из двух амидов Асн является более легкогиролизуемым аминокислотным остатком и относится к фракции ЛАГ, в то время как Глн образует фракцию ТАГ. Дезамидирование Асн для ППЦ белка имеет двойственную природу. Во-первых, процесс потери амидных групп Асн создает дополнительные сайты (Асп) для атаки каспазами, протеолитическими ферментами систем включения апоптоза. Во-вторых, именно химическая предпочтительность дезамидирования Асн «запускает» процесс автофрагментации белка (Олехнович Л.П., 1985).
Однако при окислительных воздействиях активными формами кислорода и свободными радикалами на белковую молекулу происходит окисление боковых частей глутамильных и аспартильных остатков и гистидина, что может рассматриваться как одна из причин нарастания уровня амидных групп (Berlett B.S., 1997).
Гидролиз амидов генетически предопределен и рассматривается как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белка в тканях (Robinson N.E., 2001). Универсальный процесс посттрансляционного дезамидирования является началом структурных преобразований, облегчающих атаку белка протеолитическими ферментами (Лукаш А.И., 1994).
Белки скелетных мышц
В табл. 5 (см. рис. 10) представлены результаты, демонстрирующие динамику изменения содержания САГ, ЛАГ и ТАГ в препаратах суммарных белков мышц крыс при их физиологическом старении. Уровень суммарной амидированности исследуемых образцов 2 месячных крыс составил 205,6 мкМ амидного азота на 1 грамм белка. Распределение амидов по фракциям ЛАГ и ТАГ произошло таким образом: 123,9 мкМ ЛАГ и 81,7 мкМ ТАГ на 1 грамм белка.
