Роль марганец-бикарбонатных комплексов в каталазной и водоокисляющей активностях фотосистемы 2

Актуальность темы

Способность окислять воду с выделением молекулярного кислорода за счёт энергии поглощённого света — одно из важнейших эволюционных приобретений живой природы. Фотосинтетическое окисление воды — основной источник как электронов, используемых для фиксации С02 при фотосинтезе, так и молекулярного кислорода в атмосфере. Окисление воды и выделение 02 при фотосинтезе осуществляется в фотосистеме 2 (ФС-2) — пигмент-белковом комплексе, погружённом в тилакоидную мембрану. ФС-2 состоит из трёх основных функциональных частей: 1) светособирающего комплекса, улавливающего кванты света и передающего энергию возбуждения хлорофилла на реакционный центр ФС-2, 2) реакционного центра, в котором происходит преобразование энергии возбуждённого хлорофилла в энергию разделённых зарядов, 3) водоокисляющего комплекса (ВОК), окисляемого реакционным центром и, в свою очередь, окисляющего воду с выделением 02. ВОК расположен на люменальной стороне тилакоидной мембраны. Он включает марганцевый кластер, состоящий из 4 атомов Мп и 1 атома Са, три водорастворимых белка с мол. м. 17, 23 и 33 кДа, ионы СГ и, возможно, НСОз". Механизм фотосинтетического разложения воды остаётся малоизученным, что во многом связано со сложностью строения ВОК и его неустойчивостью при попытках выделения из хлоропластов.

В ряде работ нашей лаборатории (см. обзор Klimov and Baranov, 2001) было показано стимулирующее влияние бикарбоната на устойчивость ВОК к повреждающим воздействиям, на восстановление переноса электронов и выделения 02 в препаратах ФС-2 с разрушенным ВОК при добавлении ионов Мп". Согласно одному из предположений, действие бикарбоната обусловлено образованием комплексов с ионами Мп, имеющим место в составе ВОК или при сборке ВОК из апо-ВОК и неорганических кофакторов [Klimov and Baranov, 2001]. Выяснение свойств и возможной роли Мпбикарбонатных комплексов во взаимодействии с ФС-2 может дать сведения как о строении и функционировании ВОК, так и о его эволюционном возникновении.

Модельной системой для изучения влияния бикарбоната на свойства ионов Мп в окислительно-восстановительных реакциях может служить известная каталитическая активность комплексов Мп11 с бикарбонатом в реакции разложения Н202 на 02 и воду (каталазная активность) [Сычёв, Исак, 1990]. Сведения о составе, константах устойчивости и каталазной активности Мп-бикарбонатных комплексов могут быть полезны также для выяснения природы каталазной активности ФС-2, предположительно связанной с переходами S-состояний. В пользу наличия каталазной активности у ВОК свидетельствовали колебания количества выделенного 02 из Н2О2 у тилакоидов с периодом в 2 вспышки при освещении короткими вспышками света в присутствии ингибитора каталазы NaN3 [Velthuys and Kok, 1978]. По другим данным, каталазная активность мембранных препаратов ФС-2 ВВУ-типа не обнаруживалась после обработки 3-амино-1,2,4-триазолом — ингибитором гемовой каталазы [Sheptovitsky and Brudvig, 1998]. Изучение взаимодействия ВОК с Н202 — возможным промежуточным соединением реакции окисления воды — важно для выяснения свойств S-состояний и их переходов и может помочь в раскрытии механизма фотосинтетического окисления воды.

Таким образом, изучение свойств Мп-бикарбонатных комплексов важно для понимания особенностей взаимодействия ФС-2 с ионами Мп11, выяснения роли бикарбоната в функционировании ФС-2 и источника каталазной активности ФС-2.

Цель и задачи. Цель работы — исследование роли марганец-бикарбонатных комплексов в окислительно-восстановительном взаимодействии ионов марганца с безмарганцевыми препаратами ФС-2, а также в каталазной активности ФС-2. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучение влияния бикарбоната, ацетата и формиата на светозависимый перенос электронов от ионов Мп11 к реакционным центрам препаратов ФС-2, не содержащих неорганического кластера ВОК;

2. Определение потенциала окисления Мп" до Мп111 в присутствии бикарбоната, ацетата и формиата, а также состава и констант устойчивости образуемых комплексов Мп111 при электрохимическом окислении Мп11;

3. Определение состава и констант устойчивости комплексов Мп11 с бикарбонатом, ацетатом и формиатом при электрохимическом восстановлении Мп11;

4. Выяснение природы каталазной активности Мп" -бикарбонатных комплексов;

5. Изучение каталазной активности ВОК.

Научная новизна. Показано, что ацетат и формиат, в отличие от бикарбоната, не способствуют переносу электронов от ионов Мп11 к реакционным центрам препаратов ФС-2, не содержащих энзиматического Mn-содержащего центра ВОК. Показано, что в присутствии бикарбоната, формиата и ацетата потенциал электрохимического окисления (Е°) Мп11 до Мп111 (равный 1,18 В для аква-катиона Мп11) значительно понижается, причём бикарбонат вызывает более сильное (до 0,67 В) по сравнению с формиатом (до 0,77 В) и ацетатом (до 0,69 В) снижение Е°. Показано, что в присутствии бикарбоната кроме водного комплекса Мп11 окисляться электродом могут и МпП-бикарбонатные комплексы (MnnHC03+, E°i = 0,61BМпи (НС03)2, Е°ц = 0,52 В). Обнаружено, что бикарбонат образует с Мп111 электронейтральный комплекс Мп1П (НС03)з ((3 = 1,73×1014 М" 3), тогда как формиат и ацетат — положительно заряженные комплексы Мпш (НСОО)2+ (Р = 2,86×1012 М" 2) и Мпш (СН3СОО)2+ ф = 7,9×1013 М" 2).

Вольтамперометрическим методом показано, что бикарбонат образует с Мпп комплексы состава МпНСОэ+ (при 10−100 мМ БК, р= ЮМ" 1) и Мп (НС03)2 (при 100−600 мМ БК, Р = 350М" 2). На основании сопоставления данных по светозависимому окислению Мп11 препаратами ФС-2 и электрохимических данных предположено, что фотоокислению безмарганцевыми препаратами ФС-2 подвергается водный комплекс Мп", и что необходимость бикарбоната в этом процессе может обуславливаться снижением потенциала окисления Мп11 при образовании комплекса с Мп111, электронейтральностью Мпш-бикарбонатного комплекса и участием бикарбоната в связывании ионов ИГ, образующихся при окислении воды или при гидролизе Мпш. Показано, что порядок каталазной активности Mn-бикарбонатных комплексов по НС03~ равен 4, а порядок по Мп равен 2 при рН 7,4. Показано, что комплексы Мп11 с формиатом и ацетатом не имеют каталазной активности. На основании кинетических закономерностей и электрохимических данных предложен новый механизм реакции разложения Н202 с участием двух молекул комплекса Мп (НС03)2. Предположено, что необходимость бикарбоната для каталазной активности Мп11 обусловлена как снижением потенциала окисления Мп, так и способностью связывать ионы выделяющиеся при окислении Н202.

Практическая значимость. Полученные результаты могут использоваться при исследовании механизма окислительно-восстановительных реакций с участием марганца, для создания искусственных химических систем, способных к светозависимому окислению воды, при разработке защиты биохимических систем от Н202.

Апробация. Материалы диссертации были представлены на 16-й зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10−13 февраля 2004 г.- на 8-й международной пущинской школе-конференции молодых учёных, Пущино, 17−21 мая 2004 г.- на 18-х Пущинских чтениях по фотосинтезу и.

Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 19−23 июня 2005 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи: 1 статья в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 статья в реферируемом международном журнале и 4 тезисов конференций.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в проведении биохимических, электрохимических и физико-химических исследований, в обработке и интерпретации экспериментальных данных, теоретическом обобщении научной литературы и формулировке выводов. Основная часть результатов получена автором самостоятельно. Флуориметрические исследования переноса электронов в препаратах фотосистемы 2 были проведены совместно с к.б.н. С. К. Жармухамедовым. Электрохимические измерения были проведены совместно с к.х.н. Ю. Н. Козловым и к.б.н. А. А. Казаковой.

2. Обзор литературы.

5. Выводы.

Показано, что стандартный потенциал электрохимического окисления Мп11 до Мп111 в водном растворе (равный 1,18 В) снижается в присутствии бикарбоната до 0,67 В, что может лежать в основе известного эффекта стимуляции бикарбонатом фотопереноса электрона от экзогенного Мп11 к реакционному центру ФС-2 в субхлоропластных препаратах, не содержащих Мп-содержащего водоокисляющего комплекса.

Показано, что несмотря на значительное снижение стандартного потенциала окисления Мп11 в присутствии формиата и ацетата (до 0,77 В и 0,69 В, соответственно), ни один из этих анионов (в отличие от бикарбоната) не способен стимулировать фотоокисление Мп11 реакционным центром ФС-2.

Электрохимическим исследованием окисления Мп11 до Мпш и восстановления Мп11 до Мп° выявлено, что бикарбонат образует с Мп111 электронейтральный комплекс Мпш (НСОз)з (Р = 1,73×1014 М" 3), тогда как формиат и ацетат — положительно заряженные комплексы Мпш (НСОО)2+ ф = 2,8 6×1012 М" 2) и Мпш (СН3СОО)2+ ((3 = 7,9×1013 М" 2). С Мп11 бикарбонат образует заряженный комплекс МппНС03+ (Р = 10 М" 1) и электронейтральный комплекс Мпи (НС03)2 ((3 = 350 М-"), тогда как в присутствии формиата и ацетата образуются только положительно заряженные комплексы Мпп (НСОО)+ и Мпп (СН3СОО)+.

Сравнение электрохимических данных с данными по восстановлению электронного транспорта в препаратах ФС-2 позволило выдвинуть предположение о том, что фотоокислению безмарганцевыми препаратами ФС-2 подвергается водный комплекс Мп11. Необходимость бикарбоната в этом процессе может обуславливаться: а) снижением потенциала окисления Мп11 вследствие образования комплекса Мпш (НСОз)з, б) электронейтральностью Мпш-бикарбонатного комплекса и в) участием бикарбоната в связывании протонов, освобождающихся при окислении воды или при гидролизе водного комплекса Мп111.

5. Показано, что комплекс Мпп (НСОз)2 обладает каталазной активностью, тогда как водный комплекс Мп11 и комплекс Мп1ГНС03+ (а также комплексы МппСН3СОО+ и МппНСОО+) не активны. Предложен механизм каталитического разложения Н202 Мп-бикарбонатными комплексами, предполагающий участие двух молекул Мпп (НС03)2. Предположено, что необходимость бикарбоната для проявления каталазной активности Мп11 обусловлена образованием в его присутствии электронейтрального комплекса Мпп (НС03)2, сопровождающимся снижением потенциала окисления Мп", а также способностью бикарбоната связывать ионы Н+, выделяющиеся на стадии окисления Н202.

6. Показано, что каталазная активность препаратов ФС-2 связана с присутствием в них связанной с мембраной гемовой каталазы, и не связана с функционированием Mn-содержащего водоокисляющего комплекса.

4.6.

Заключение

.

Данные настоящей работы и других работ (Klimov et al., 1995; Allakhverdiev et al., 1997; Baranov et al., 2000) показывают, что перенос электронов от Мп11 к реакционному центру ФС-2 ускоряется при концентрациях НСОз", при которых, как следует из наших электрохимических данных, не происходит предварительного образования Мпп-бикарбонатных комплексов (рис. 23). Это означает, что перенос электронов происходит при окислении водного комплекса Мп11 до Мп111 в присутствии бикарбоната. В этом случае роль бикарбоната может состоять в его связывании с Мпш, образованным при фотоокислении Мп11 реакционным центром ФС-2, с образованием комплекса Мпш (НСОз)з, что приводит к снижению потенциала окисления Мп11 вследствие того, что константы устойчивости комплексов бикарбната с Мп111 и Мп11 различаются на 12 порядков. Не • исключено также, что в процессе реконструкции ВОК образуется тройной комплекс Мпп-НС03″ -ФС-2, который подвергается светозависимому окислению [Baranov et al., 2004].

В нашей работе показано, что в присутствии ацетата и формиата также уменьшается потенциал окисления Мп11, но перенос электронов к ФС-2 не ускоряется. Мы предполагаем, что важным отличием бикарбоната от ацетата и формиата при взаимодействии с ФС-2 может быть способность связывать ионы Н1″, освобождающиеся при окислении воды или при гидролизе водного комплекса Мп111 в области рН 6−7, в которой ФС-2 имеет наивысшую активность. Ещё одним отличием бикарбоната является способность образовывать электронейтральный комплекс Мп (НСОз)з при окислении Мп11, что может уменьшать электростатическое отталкивание ионов Мп11 и таким образом облегчить их доступ к реакционному центру ФС-2. шттттж рД е^тв ие^н а^р^^.

ШШ мп^нсошШШр

ШШУ//У/Ш МгУ’НСО* ¦щжж шшш.

Каталазная активность Мп" —- ш.

I-1−1—I—I I I I I I-1−1—I—I I I I I I-1−1—I—I I I I I I-1−1—I—I I I I I I.

1СУ4 1СГ3 1СГ2 10~1 1.

Бикарбонат, M.

Рис. 23. Области концентраций бикарбоната, при которых наблюдались активация переноса электронов от экзогенного Мп11 в препаратах ФС-2, образование комплексов Мпш и Мп", и каталазная активность Мпп.

Несмотря на то, что бикарбонат необходим как для фотоокисления Мп11 реакционными центрами ФС-2, так и для проявления каталазной активности Мп11, в этих реакциях участвуют разные виды комплексов. Каталазная активность проявляется при концентрации бикарбоната выше 100 мМ, что, согласно нашим электрохимическим данным, соответствует образованию комплекса Мпп (НС03)2 (рис. 23). Комплексы Мпп (НС03)2 способны к донированию электронов на реакционные центры аноксигенных бактерий (Khorobrykh et al., 2008). В то же время, светозависимое окисление Мп11 в ФС-2 происходит без предварительного образования Мпп-бикарбонатных комплексов, но с последующим образованием Мпш-бикарбонатных комплексов, как описано выше.