Сохранение жизнеспособных клеток, тканей, органов при глубоком замораживании (криоконсервация) в течение длительного времени (десятки лет) представляет собой современную проблему при создании многих биологических и медицинских технологий. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в состояние обратимой остановки жизни и выхода из него связано с исследованием структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. В связи с этим изучение замораживания нервных клеток до ультранизких температур представляется весьма перспективным из-за возможности регистрации целостности клеточных мембран и рецепторов электрофизиологическими методами, возможности наблюдения за поведением криоконсервированных нейронов в культуре in vitro, а также благодаря возможности изучения поведения криоконсервированных трансплантатов нервной ткани в мозге животных. Несомненно, что в сочетании с гистохимическими, ультрамикроскопическими, иммунологическими и другими методами изучение криоконсервации нервных клеток (нервной ткани) внесет существенный вклад в понимание механизмов криоповреждений и криозащиты в процессе глубокого замораживания.
Интерес к проблеме криоконсервации нервной ткани имеет как научно-фундаментальный характер, так и прикладной в связи с необходимостью создания криобанка трансплантатов нервной ткани для медицинских целей (Frodl et all, 1994; Robbins et all, 1990; Sauer et all, 1992; Brunet et all, 2003). Первые результаты по выживанию ткани мозга цыпленка после замораживания до температуры -196°С были опубликованы в 1953 г. (Luyet, Gonzales, 1953). Позднее, в 1980 г., было показано, что нервная ткань эмбриона млекопитающих переживают замораживание до -90°С при хранении в течении 18 недель. Далее можно привести ряд работ, в которых эмпирически подобранные режимы замораживания и использование традиционных криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин) позволили с разной степенью сохранности заморозить ткань мозга крыс и приматов, в том числе человека (Sckott et all, 1986; Silani et all, 1988), культуру нервной ткани (Kawamoto, Barret, 1986; Petite, Calvet 1997; Sckott et all, 1986). В изучение прошедших замораживание нейронов входило тестирование жизнеспособности и описание морфологической сохранности, роста отростков в культуре in vitro, состояния рецепторов, синтеза медиаторов, восстановления электрической активности, приживляемости трансплантатов в мозге животных (Jensen et all, 1985; Sckott et all, 1986; Sucher et all, 1992). Успех криоконсервации в значительной степени зависел от возраста донора, скоростей замораживания-оттаивания, химической природы и концентрации криопротектора. Несмотря на актуальность проблемы, введение в практику нейромедицины методов криоконсервации, пока не получило развития в основном из-за непредсказуемости результатов, обусловленных недостаточностью сведений о механизмах криоповреждений и путей криозащиты.
Нейроны и нервы позвоночных и беспозвоночных животных благодаря свойствам электровозбудимых мембран и хорошо отлаженным способам регистрации электрической активности используются для исследований механизмов действия криопротекторов и низких температур (Pribor, Nara, 1969; Lenz et al., 1975; Menz, 1975; Scott and Lew, 1986; Гахова и др., 1989; Frodl et al., 1994; Чекурова, 1994; Kislov et al., 2000).
В ряде работ, выполненных на нейронах и аксонах позвоночных и беспозвоночных животных, показано, что после криоконсервации в присутствии защитных агентов восстанавливаются электрические параметры нейрональных мембран (Asher, 1972; Pasic, De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Sucher et al., 1991; Decherchi et al., 1997; Gakhova et al., 1997). Однако сохранение электрических свойств нейрональных мембран после криокон-сервирования нейронов не может быть единственным показателем жизнеспособности клеток. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в недеятельное состояние при глубоком замораживании и выхода из него сопря6 жено с изучением структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. Для нервной ткани, состоящей из высокоспециализированных клеток с внутриклеточной формой регенерации, изучение компенсаторно-приспособительных процессов, как результата воздействия криозащитных агентов и низких температур, имеет особое значение. В то же время работ по исследованию последствий криоконсервации на внутриклеточные структурные и метаболические свойства нейронов незначительное число, закономерности репарации клеточных структур после низкотемпературного воздействия до настоящего времени окончательно не выяснены и требуют дальнейших исследований. В этой связи комплексное изучение морфо-функциональных свойств нейронов на модельных объектах (например, нейронах беспозвоночных) представляется весьма актуальной задачей, поскольку это позволит не только определить области крио-повреждений и в значительной степени прогнозировать степень восстановления, но и оценить возможности повышения криорезистентности нейронов с помощью модификации криопротектирующих сред.
Целью данной работы было изучить восстановление структуры и функции нервных клеток после криоконсервации на примере идентифицированных нейронов МП1 и МПЗ изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Выяснить характер повреждений и нормализации структуры и функции нейронов после замораживания-оттаивания методами электронной и люминесцентной микроскопии.
2. Оценить степень влияния криопротектора на структуру и функцию нейрона (методами электронной и люминесцентной микроскопии).
3. Изучить способность криоконсервированных нейронов формировать отростки в культуре in vitro.
1. Обзор литературы.
Криоконсервация — обратимая остановка жизнедеятельности клеток На сегодняшний день криоконсервирование (замораживание и сохранение при сверхнизких температурах, -196°С) — единственный известный метод, способный обеспечить сохранение клеток и тканей животных и растений в течение многих месяцев и даже лет без значительной потери жизнеспособности.
Поскольку при столь низких температурах биохимические реакции, необходимые для жизни, не протекают, то клетки (ткани, органы, организмы) находятся в состоянии временной обратимой остановки жизни (жизнедеятельности), или анабиоза (Лозина-Лозинский, 1972, Голдовский, 1981, Ушатинская, 1990). При хранении биологического материала при -196°С единственным известным на сегодня повреждающим фактором является радиоактивный фон Земли и космические излучения. Расчеты, полученные на основании экстраполяции экспериментальных данных по действию радиации на клетки при низких температурах, показывают, что они могут храниться при -196°С по крайней мере в течение нескольких сотен лет без накопления летальных повреждений ДНК (Виленчик, 1983).
Согласно современным представлениям основной причиной повреждений клетки при замораживании является образование внеи внутриклеточного льда. При вымораживании воды в лед живые системы подвергаются воздействию комплекса физико-химических факторов. Среди них существенное значение имеют внутриклеточная кристаллизация, гиперконцентрация солей и ионной силы раствора, изменение величины рН и зарядовых характеристик мембран, значительное обезвоживание и фазовые превращения биополимеров и надмолекулярных структур (Пушкарь и др., 1977; Белоус, Грищенко, 1994).
Процесс кристаллообразования по-разному воздействует на клетки и ткани. Это зависит прежде всего от скорости охлаждения биоматериалов, 8 присутствия в среде криопротекторов и других защитных добавок, от скорости отогрева, от свойств самого биологического материала.
Процесс криоконсервирования в целом можно представить в виде схемы, состоящей из последовательных стадий:
1. Подготовка объекта к замораживанию: получение биологического материала, погружение в искусственную физиологическую среду и выдерживание в ней для адаптации. Длительность инкубирования и температурные условия зависят от конкретного объекта и поставленных задач.
2. Замещение физиологической среды на криозащитный раствор, который может содержать один криопротектор, или сочетание нескольких криопротекторов, метаболические вещества, антиоксиданты и др. Обычно этот раствор гипертоничен по отношению к клетке, поэтому криопротектор добавляют постепенно до конечных концентраций. Время выдерживания в этом растворе для осмотического уравновешивания внутриклеточной среды с криозащитным раствором может колебаться от нескольких минут до нескольких часов при постоянной температуре.
3. Глубокое охлаждение до температуры жидкого азота, -196°С. Это может быть замораживание путем непосредственного погружения биологического материала в жидкий азот, или замораживание в парах жидкого азота, или по определенной программе с применением специальных замораживающих устройств.
4. Длительное сохранение биологического материала в жидком азоте (-196°С), или в парах жидкого азота (-150 н-170°С) в специальных хранилищах.
5. Отогрев объекта по определенному режиму до положительных температур.
6. Отмывка криозащитного раствора и замещение его физиологической средой. При таянии кристаллов льда и отмывке клеток от криопротектора клетки обычно оказываются 9 гипертоничными по отношению к наружному раствору. Для избежания постгипертонического лизиса вымывание криопротектора обычно осуществляют медленно до исчезающих его концентраций.
На каждом этапе криоконсервации, клетки (ткани, органы) подвергаются воздействию разного рода химических и физических факторов. Развитие методов криоконсервации клеток, тканей, органов основано на изучении механизмов их криоповреждений и криозащиты в процессе замораживания и отогрева.
Способность восстановления жизнедеятельности после оттаивания заисит от сохранения целостности клеточных структур, межклеточных контактов, рецепторов и др. Степень сохранности непосредственно связана со свойствами клеток (тканей) — механизмами устойчивости к экстремальным воздействиям, к которым клетки (ткани, организмы) не могли быть приспособлены в течение своей эволюции. Раскрытие основных механизмов перехода в недеятельное состояние (анабиоз) и выхода из него сопряжено с изучением структурно-функциональных перестроек, происходящих при этих переходах. В связи с этим изучение замораживания нервных клеток (нервной ткани, мозга) до ультранизких температур представляется перспективным из-за возможности регистрации целостности клеточных мембран электрофизиологическими методами, возможностью наблюдения за поведением криоконсервированных нейронов в культуре ткани, и, благодаря развитой за последние годы техникой трансплантации нервной ткани в мозг животных, возможностью изучения криоконсервированных трансплантатов. Криоконсервация нервной ткани.
Первые наблюдения за выживаемостью нейрональной ткани после замораживания относятся к 1953 году, когда Лайет и Гонзалес (Luyet&Gonzales, 1953) показали, что ткань мозга цыпленка может переживать замораживание до -196°С. Позднее, в 1980 году, были опубликованы данные о переживании эмбриональной ткани мозга.
10 млекопитающих в течение нескольких недель при -90°С, замороженных с медленной скоростью с использованием 10% ДМСО. (Houl&Das, 1980). Дальнейшие работы показали возможность криоконсервации нервной ткани человека и животных при использовании криозащитных сред. Интерес к криоконсервации нервной ткани был проявлен в связи с развитием методов трансплантации клеток и тканей в медицинских целях, поэтому особое внимание было уделено изучению криоконсервации не изолированных нейронов, а нейрональной ткани (коры головного мозга, гипокампа и др.), которую можно трансплантировать в мозг реципиентам сразу после оттаивания, или через промежуточный этап проведения изолированных клеток через культуру in vitro.
К этому времени были уже достигнуты значительные успехи в криоконсервации и сохранении при температуре жидкого азота различных изолированных клеток в однородных суспензиях (клетки эмбриональной нервной ткани, клетки крови, взвесь сперматозоидов, клетки печени, селезенки, почки и др.) (Silani et al., 1988; Фуллер и др., 2003; Гольцев и др, 2003).
Замораживание ткани (и органов) в отличие от изолированных клеток до ультранизких температур сопряжено с определенными трудностями. Для успешного решения задач криоконсервации различных тканей (и органов) необходимо учитывать особенности их биологической организации. В противоположность клеточным суспензиям ткани (и органы) имеют фиксированную геометрию, высокую плотность клеток, разнообразие клеточных типов. Структурная организация, клеточная дифференциация, и, соответственно, степень функционирования отдельных клеточных популяций в этой системе различны. Поэтому проникновение и распределение криозащитных веществ, а также фронта кристаллизации в ткани происходят неравномерно, что обуславливает появление температурного градиента и градиента осмотического давления. Даже маленькие кусочки ткани, или органа (каковым является мозг моллюска), содержат клетки с различными морфофункциональными особенностями.
Оптимальные условия их выживания в процессе криоконсервации могут существенно отличаться, так как они по-разному реагируют на сдвиг температуры, природу и концентрацию криопротекторов, на сложные криоконсервирующие смеси и т. д. Наглядно это показано на примере замораживания в одних и тех же условиях седалищных нервов лягушки до -10-П5°С: нервы, лишенные оболочки, восстанавливали электрические пераметры после оттаивании, в отличие от интактных (Pribor&Nara, 1969). Нейроны и глиальные клетки человека и лабораторных животных в различной степени сохраняли жизнеспособность при одних и тех же условиях замораживания-оттаивания (Redmond et al., 1988; Koopmans et al., 2001; Гольцев и др. 2003). Показано также, что контакты, необходимые для функционирования тканевой системы, оказываются наиболее уязвимыми местами для осмотического стресса и фазовых переходов, сопровождающих процесс криоконсервации (Armitage et al., 1995; Yang et al., 1996).
К настоящему времени имеется ряд работ по криоконсервации эмбриональной и зрелой нервной ткани животных. Эмбриональные ткани, в том числе и нервная, отличаются пониженной иммунологической компетентностью и относительно хорошо переносят цикл замораживания^ отогрева при удачном подборе криопротекторов и криозащитных сред (Fang &Zhang- 1992; Collier et al., 1993; Swett et al., 1994; Petite et al., 1995; 1997; Koopmans et al., 2001). Тем не менее, авторы отмечают, что клетки, культивированные после длительной криоконсервации эмбриональной нервной ткани, были очень чувствительны к механическим и осмотическим воздействиям, а процент приживления трансплантатов после криоконсервирования был довольно низким (Albert, Das, 1984).
Существенную роль в восстановлении морфофункциональных свойств нервной ткани после воздействия таких экстремальных факторов, как охлаждение и замораживание, играет ее способность к регенерации. Клетки эмбриональной нервной ткани способны к митотическому делению и росту клеток, поэтому поврежденные клетки могут замещаться новыми, а критериями успешной криоконсервации может служить изучение биосинтеза.
12 белка и ДНК (клеточные механизмы, обеспечивающие эти функции ткани) (Бабийчук и др., 2000).
Клетки зрелой дифференцированной нервной ткани имеют внутриклеточную форму регенерации, и ее замораживание и восстановление криоповреждений могло встретить ряд трудностей, отличных от замораживания эмбриональной ткани. Тем не менее, показана возможность криоконсервации и восстановление жизнеспособности постнатальной нервной ткани практически при тех же условиях замораживания-оттаивания, что и эмбриональной ткани (Kawamoto Barret., 1986; Negishi et al., 2002; Petite et al., 1997). В недавней работе Брюне с соавт. (Brunet et al., 2003) опубликованы успешные результаты такого исследования. Авторы замораживали небольшие кусочки (1 мм3) коры головного мозга человека в среде DMEM (250 мкл) с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 8% ДМСО. Замораживание осуществляли медленно со скоростью 1°С/мин до -196°С и хранили в жидком азоте в течение 2-х лет. После быстрого оттаивания и механической диссоциации размороженных кусочков выделенные из них клетки были введены в культуру in vitro. Иммуноцитофлуоресцентный анализ показал, что и глиальные клетки, и нейроны криоконсервированной ткани в культуре не отличались от контрольных.
Несомненный интерес в качестве объекта для исследований в области криоконсервации нервной ткани представляют простые нервные системы беспозвоночных. Несмотря на то, что беспозвоночные относятся к пойкилотермным животным и, вероятно, более устойчивы к низким температурам по сравнению с млекопитающими, их клетки, тем не менее, не приспособлены к анабиозу. Замораживание до температуры жидкого азота (криоконсервация, т. е.
введение
в криоанабиоз) требует использования криозащитных средств и специально подобранных режимов замораживания-оттаивания. Эксперименты, выполненные на личинках морских ежей (стадии плутеуса), имеющих развитую нервную сеть, показали, что криоконсервация в присутствии криопротекторов не повреждала эти жизненно-важные структуры: личинки после оттаивания плавали в толще воды и нормально развивались (Гахова и др., 1989). Личинки усоногих раков после замораживания до -196°С с использованием криопротекторов сохраняли фоточувствительные рецепторы (положительный фототаксис) (Гахова и др., 1990). Была осуществлена криоконсервация изолированного мозга пресноводных и морских голожаберных моллюсков (Pasic&De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Gakhova, 1997).
Основное преимущество этой модели над изолированными клетками и кусочками ткани мозга в том, что здесь идет речь о введении в анабиоз интактного органа, и соответственно сохранении клеточной гетерогенности, межклеточных связей, синаптических структур. Мозг морских и пресноводных моллюсков состоит из нескольких пар ганглиев, соединенных между собой комиссурами и коннективами. Каждый из ганглиев содержит глию и до 2000 нейронов разного размера (от 10 до 250 мкм — у пресноводных моллюсковот 10 до 1000 мкм — у морских голожаберников). Все ганглии и отходящие от них нервы заключены в соединительнотканную оболочку.
Тела нейронов, в том числе «гигантских», в ганглиях моллюсков расположены по наружной поверхности ганглия, и посылают свои аксоны в центральную область — в нейропиль, где находятся синаптические контакты между отростками нейронов (Боровягин, Сахаров, 1968; Kandel, 1976). Как показали эксперименты, замораживание изолированного мозга моллюсков с сохранением жизнеспособности возможно только в присутствии криозащитных агентов (Pasic&De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989). Авторы использовали изолированный мозг моллюска Lymnaea stagnalis L. для изучения механизмов действия криопротекторов и ультранизкого замораживания с применением методов фиксации мембранного потенциала и регистрации трансмембранных ионных токов на диализированных нейронах (Кислов, Пластинкин, 1994; Чекурова, 1994). Основные результаты показали, что независимо от используемого вида криопротектора (диметилсульфоксид, этиленгликоль, формамид, маннитол) происходило увеличение порога активации ионных каналов, уменьшение пика входящих и выходящих токов (К+. Na+, Са++, СГ), уменьшение проводимости мембраны для К+, Na+, Са++. Эффекты криопротекторов на ионные каналы имели обратимый характер. После оттаивания ганглиев, замороженных в жидком азоте, нейроны восстанавливали характерные для них электрические параметры через 1,5−2 часа. Несмотря на различия в деталях, нейроны беспозвоночных и позвоночных имеют ряд общих структурных особенностей (Kandel, 1976), поэтому результаты по изучению влияния криопротекторов и ультранизких температур могут быть в значительной степени экстраполированы на нейроны позвоночных.
Криопротекторы.
В настоящее время известно большое количество естественных и синтезированных веществ, способных предотвращать разрушение клеток при их замораживании и последующем отогреве. По характеру взаимодействия с клеткой криопротекторы можно разделить на проникающие в клетку и не проникающие. Первые отличаются высокой растворимостью и легкостью проникновения через мембраны, что приводит к понижению осмотического давления, создаваемого во время кристаллизации воды (Белоус и др., 1987). Наиболее широко используемые криопротекторы этого типа, как глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, формамид и др., по механизму действия можно отнести к полифункциональным: обезвоживание клеток за счет увеличения осмотичности внешнего раствора, сопровождающееся понижением точки максимального переохлаждения внутриклеточной жидкостизамедление образования кристаллов льда и изменение их формысвязывание свободной внутриклеточной воды, доступной для кристаллизации (Пушкарь и др., 1977; Белоус и др., 1987) — поддержание трехмерности структуры белковых молекул внутри клетки (Meryman et al., 1977) — стабилизация или ингибирование активности ферментов (Hochachka, Somero, 1973; Ring, 1980), стабилизация фосфолипидных мембран (Anchordogue et al., 1991).
Применение криопротекторов позволяет сохранить клетки, ткани при глубоком замораживании. Но в то же время используемые вещества могут оказывать токсическое действие на биологический объект, обусловленное как осмотическими, так и биохимическими эффектами (Fahy et al., 1990; Катков, 1999; Kopeika et al., 2003). Известно, что криопротекторы могут влиять на биоструктуры различного уровня организации и способны вызывать существенные изменения биохимических процессов в клетках (Fahy et al., 1990; Фулер и др., 2003). Криопротекторы также могут изменять свойства нуклеиновых кислот и вызывать денатурацию при высокой концентрации (Strauss et al., 1968; Корнилова и др., 1993). Поэтому выбор криозащитных веществ имеет большое значение при замораживании и долгосрочном хранении биологических объектов.
Виды животных, относящиеся к разным систематическим группам животных, часто обнаруживают различную чувствительность к одному и тому же криопротектору (Чуйко, 1989; Гахова, 1994; Чекурова, 1994). Показано, например, что ДМСО вызывал необратимое подавление спонтанной спайковой активности нервных клеток абдоминального ганглия морского моллюска Aplysia depilans, в то время как глицерин не оказывал токсического действия. Оба агента вызывали снижение значений МП, но ДМСО в большей степени, чем глицерин (Pasic, de sa Faria, 1970). Противоположные результаты получены на нейронах прудовика Lymnaea stagnalis L. (Кислов, Пластинкин, 1994; Чекурова, 1994).
Глицерин (от 0,5 до 3 М) оказывал токсический эффект на мембраны нейронов прудовика. Изучение интегральных токов на диализированных нейронах прудовика под воздействием криопротекторов различной химической природы (ДМСО, этиленгликоль, формамид) показало частичную и обратимую инактивацию Са" 1″ 1″ и Na+ ионных каналов входящего тока К+ (Кислов, Пластинкин, 1994). Изучая механизмы действия криопротекторов на нейрональную мембрану авторы делают вывод, что наиболее важными для мембраны являются осмотические эффекты, создаваемые высокими концентрациями протекторов. Изучение.
16 криозащитных свойств ДМСО, этиленгликоля и формамида при замораживании до -196°С изолированного окологлоточного кольца ганглиев прудовика со скоростью 500°С/мин показало, что наиболее эффективным был ДМСО (1,5 М). После оттаивания нейроны восстанавливали электрические характеристики мембран (Гахова и др., 1989; Gakhova et al., 1997).
Другие работы, выполненные на вентральном нервном стволе рака (Asher, 1972), седалищном нерве лягушки (Pribor, Nara, 1969) и седалищном нерве кролика (Lenz et al., 1975) и отходящих от поясничных корешков нервов крысы (Menz, 1975;) не выявили явного токсического действия ДМСО, глицерина или этиленгликоля. Уменьшение амплитуды ПД, вызванное этими агентами, восстанавливалось. При замораживании седалищного нерва лягушки до -10 н- 15 °C глицерин, как показано, не обладал криозащитным эффектом, тогда как ДМСО оказывал защитное действие на нервы, лишенные оболочек (в отличие от нервов с оболочками) (Pribor, Nara, 1969). ДМСО обладал более значимым криозащитным эффектом и при замораживании до -196°С седалищного нерва кролика (Lenz et al. 1975).
ДМСО в качестве криопротектора используется при исследованиях возможности ультранизкого замораживании эмбриональной ткани мозга млекопитающих: человека (Kawamoto&Barrett, 1986; Petite&Calvet. 1997;
Koopmans, 2001; Negishi, 2002), обезьяны (Redmond et al, 1988; Negishi,.
2002), крыс (Fang&Zhang, 1992; Swett et al., 1994). При изучении криоконсервации ткани мозга взрослых человека и животных также применяют диметилсульфоксид в качестве основного криозащитного компонента замораживающих сред (Collier et al., 1993; Petite&Calvet, 1997;
Koopmans et al., 2001; Jacoby et al., 2002; Brunet et al., 2003). Повидимому выбор разными авторами ДМСО в качестве криопротектора для нейрональной ткани человека и животных разных систематических групп не случаен. Многими работами показано, что скорость проникновения ДМСО в ткани животных намного выше, чем других веществ, как например, глицерина. Так, в работе Мейзура и соавт. (Mazur, 1976) показано, что полное.
17 насыщение поджелудочной железы эмбриона крысы ДМСО происходит при 0 °C за 10−15 мин, в то время как глицерин проникает в нее за 180 мин. Большинство эффектов ДМСО являются обратимыми и исчезают после удаления криопротектора (Чуйко, 1989). Суммарный криозащитный эффект ДМСО объясняется не только его коллигативными свойствами (снижение температуры начала кристаллизации жидкой фазы), с чем обычно связывают защитное действие криопротекторов, но определяется многообразными биологическими эффектами этого вещества: способность захватывать свободные радикалы, образующихся при замораживании биологического материала, тем самым предотвращая перекисное окисление в мембранных структурах клетки (Пушкарь и др, 1978; Фуллер и др, 2003; Fieck et all, 2000) — оказывать защитное влияние на мембранные гликопротеины (Anchordogue, 1991) — стабилизировать структуру белков и клеточных мембранстимулировать репаративные процессы после криоконсервации (Wewetzer, Delmaghani, 2001; Hunt et all, 2003), и др.
Однако, не исключается и токсическое действие ДМСО (Теодорович, Козлов, 1966; Strauss et al., 1968; Корнилова и др., 1993). Природа токсического эффекта ДМСО на молекулярном уровне изучается, а также ведется поиск блокирования этого эффекта (Fahy et al., 1990).
Известно, что токсическое воздействие криопротекторов, обусловленное химическими и осмотическими эффектами, в значительной степени зависит от природы и концентрации используемого вещества, и условий эквилибрации (осмотического уравновешивания клеток с раствором криопротектора): температуры и длительности контакта клеток с раствором криопротектора. Условия эквилибрации, как правило, подбирают опытным путем. Для сохранения целостности клеточных мембран добавление криопротектора до конечных концентраций в среду перед замораживанием осуществляют медленно во избежание резкого сокращения клеточного объема. Отмывание криопротектора после оттаивания биологического образца является еще более критичным, и его проводят также медленно (ступенчато), чтобы избежать резкого увеличения клеточного объема.
18 вследствие быстрого тока воды в клетку при выравнивании трансмембранных осмотических градиентов (Белоус, Грищенко, 1994). Скорости замораживания-оттаивания.
Экспериментальные данные, накопленные к настоящему времени, свидетельствуют о том, что для каждого типа замораживаемых клеток требуются свои оптимальные скорости охлаждения (замораживания).
Исторически сложилось два комплекса методов замораживания: медленное охлаждение со скоростями от 0,1до 2−3°С/мин, и быстром охлаждении, 10н-00°С/мин).
При медленном охлаждении клеток или тканей, когда скорости достаточно низкие (например, от 0.1 до 2−3°С/мин), идут зарождение, формирование и рост внеклеточных кристаллов льда. Внеклеточная вода вымораживается, в результате чего наружная среда (между кристаллами льда) становится гиперосмотичной по отношению к клетке. Для выравнивания осмотических градиентов свободная вода покидает клетку (дегидратация клетки). В результате, при низких скоростях охлаждения лед либо не образуется внутри клетки, либо его доля столь незначительна, что не повреждает клеточные структуры. Однако, при слишком медленном охлаждении клетка оказывается окруженной долгое время концентрированным раствором солей, входящих в состав среды. Кроме этого, при дегидратации повышается концентрация солей внутриклеточного раствора. Этот эффект может быть одной из основных причин гибели клетки. При высоких скоростях охлаждения клетки не успевают потерять доступную для кристаллизации свободную воду, внутренняя среда становится переохлажденной. И опасность заключается в образовании внутриклеточных кристаллов льда.
В последнее время часто используют сверхбыстрое охлаждениенесколько сот градусов в секунду. Эта методика позволяет достигать аморфизации остаточной воды в клетке. Все большее распространение приобретают методы криосохранения органов и больших кусочков тканей с использованием методик, обеспечивающих полную витрификацию ткани, т. е. исключающих образование льда (Fahy et all, 2004; Wusteman et all, 2004).
Для эмбриональных нервных клеток и ткани позвоночных используют в основном два режима замораживания: 1) двухэтапное замораживание с постоянной медленной скоростью (1°С/мин) до -60°С, затем погружение в жидкий азот- 2) трехэтапное — охлаждение до -25°С со скоростью 15−30°С/мин, выдерживание при этой температуре в течение 20 мин и последующее погружение в жидкий азот (Silani et al., 1988; Redmond et al., 1988). Оба режима не были связаны со свойствами конкретных криозащитных растворов и их концентрациями. Замораживание кусочков ткани мозга в парах жидкого азота также показало положительные результаты, хотя скорости охлаждения при этом скорее всего высокие (авторы не измеряли скорость охлаждения) Гольцев с соавт. (2003) показали значительную вариабельность сохранности клеток, определяемую режимом криоконсервирования. Глиальные клетки обладают большей криостабильностью по сравнению с нейрональными при одних и тех же режимах замораживания (Redmond et al., 1988; Гольцев и др., 2003).
Замораживание изолированных ганглиев морского моллюска Aplysia осуществляли в присутствии 10−20% глицерина с медленной скоростью (в 1 мл криозащитной среды на смеси соль-лед, -20°С, в течение 20 мин, затем — жидкий азот). Приблизительно через 1 час после оттаивания нейроны проявляли спонтанную активность.
Изолированный мозг другого моллюска, прудовика Lymnaea stagnlis, замораживали с высокой скоростью, 500°С/мин, до -196°С с использованием 1,5 М ДМСО. Оттаивание образцов для избежания рекристаллизации осуществляют с высокой скоростью (в случае мозга прудовика — 500°С/мин), обычно на водяной бане, 37 °C (Гахова и др., 1989).
Таким образом, показана принципиальная возможность сохранения в жизнеспособном состоянии нервных клеток эмбриональной и зрелой нервной ткани человека, позвоночных и беспозвоночных животных. Морфологическая и функциональная сохранность криоконсервированных.
20 клеток зависит от структурно-функциональных свойств замороженного образца (эмбриональная или постнатальная нервная тканьинтактный мозг, например, моллюсковсуспензия выделенных из ткани нейронов), химической природы и концентрации криопротектора в защитной среде, режимов низкотемпературного консервирования. Общий ответ клетки на воздействие внешних факторов Большинство представлений о механизмах криоповреждений и криозащиты клеток связано с биологическими мембранами, поскольку именно они воспринимают первые сигналы окружающей среды, и они первыми реагируют на стрессовые ситуации (Белоус и др., 1987). О результатах криоконсервирования нервных клеток часто судят по восстановлению электрических характеристик клеточной мембраны (Asher, 1972; Pasic, De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Decherchi et al., Gakhova et al., 1997). Вероятно это правомочно, поскольку рядом исследователей показано существование взаимосвязи между электрическими параметрами мембраны нейронов и морфофункциональным состоянием их ядра и цитоплазмы (Бочарова, 1975; Дьяконова, 1970; Гахова, 1979; Сотников и др., 1980).
О результатах криоконсервации также может свидетельствовать поведение нейронов в культуре in vitro и в ткани реципиентов после трансплантации клеток из замороженно-оттаянной донорской нервной ткани.
Имеются данные, что для проявления функциональной активности после оттаивания криоконсервированного биологического объекта необходим восстановительный период: для нейронов изолированных ганглиев аплизии — в течение 1-го часа (Pasic& De sa Faria, 1979) — личинок морского ежа — от 1 до 3-х часов (Гахова и др. 1988), для нейронов изолированного мозга прудовика — 1,5−2 часа (Гахова и др., 1989). Вероятно, этот период необходим для восстановления трансмембранных ионных градиентов и внутриклеточных репарационных процессов.
Адаптационные возможности нейронов с внутриклеточной формой регенерации значительно выше, чем у других клеток. При воздействии внешних факторов нервные клетки способны быстро реагировать путем.
21 изменений функционирования белоксинтезирующей системы в целом (Бродский, 1966; Дьяконова, 1970, Гахова, 1979; Гордон, 2000). Изменения компонентов белоксинтезирующей системы являются общим компонентом реакции клеток как на физиологические, так и повреждающие воздействия.
В этой связи изучение изменений белоксинтезирующей системы в восстановительный период, как ответ на стресс, вызванный охлаждением и глубоким замораживанием, имеет важное значение для понимания не только внутриклеточных механизмов криоповреждений, криоустойчивости, но и характера репарационных процессов.
На воздействие внешних факторов клетка отвечает изменением количества и состава работающих рибосом, морфологическими и функциональными изменениями комплекса Гольджи, митохондрий, эндоплазматического ретикулума. Как следствие внутриклеточных повреждений происходит накопление лизосом и остаточных телец на периферии клетки.
Изменения метаболизма рРНК как ответ на внешнее воздействие Способность к быстрой деградации и накоплению рибосом является характерной особенностью метаболической реакции нейронов на смену функционального состояния. Так, через ЗОминут после электрораздражения в приядерной области цитоплазмы нейронов моллюска появляется огромное количество рибосом, хотя меченая вновь синтезированная РНК в цитоплазме еще не обнаруживается (Бочарова, 1973). В цитоплазме заметные количества вновь синтезированной РНК обнаруживаются лишь спустя 1−2 часа с момента появления метки в ядре, но количество ее в 2 и более раз меньше, чем в ядре (Дьяконова, Вепринцев, 1970). Синаптическая активация нейронов в течение 10 минут вызывала изменения в объеме клеток и структурные перестройки, свидетельствующие о перестройке метаболизма, но не приводила к изменению скорости внутриклеточного синтеза РНК (Меркулова, Даринский, 1982). После окончания активации в течение 24 часов наблюдали усиление синтеза РНК, степень которого была прямо пропорциональна интенсивности предшествующего воздействия.
Накопление РНК в телах нейронов при воздействии может быть следствием двух процессов: усиления ее синтеза и транспорта или ослабления ее распада (Кленикова, Малинаускайте, 1980).
Существуют два основных метода цитохимического анализа нуклеиновых кислот (НК) — визуальная флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия. Проточная цитометрия позволяет исследовать большие массивы клеток за короткий промежуток времени, но не позволяет проводить исследования на идентифицированных нейронах, а следовательно, и морфологическое исследование клеток. Визуальная флуоресцентная микроскопия позволяет выявить и оценить характер распределения НК в клетке и отдельных клеточных структурах, но не дает понятия о количестве НК. Кроме того, этот метод позволяет исследовать идентифицированные нейроны, а значит, оценить и морфологические изменения клеток. Для решения этих вопросов был разработан метод флуоресцентной диагностики и двухволновые микрофлуориметры, представляющие собой комбинацию флуоресцентного микроскопа со спектроанализирующим устройством, снабженную электронными блоками регистрации и управления (Карнаухов и др., 1983; Карнаухов, 1987). Нуклеиновые кислоты не обладают флуоресценцией при комнатной температуре, поэтому флуоресцентные методы их анализа основаны на использовании флуоресцентных красителей, например, акридинового оранжевого (АО). Зеленая флуоресценция АО в комплексе с двухспиральными НК связана с интеркалированием мономеров красителя, а красная на молекулах РНК и денатурированных однонитевых участках ДНК — с образованием ассоциатов димеров красителя на фосфатных группах. Димеры и мономеры красителя различаются по своим оптическим свойствам (Карнаухов, 1978).
Известно, что при фиксации, заливке и приготовлении гистологических препаратов в цитоплазме клетки транспортная РНК не сохраняется, а доля мРНК составляет всего несколько процентов (Бродский, 1966),.
23 следовательно сохраняющаяся в цитоплазме РНК — это рРНК. Следовательно, свечение цитоплазмы обусловлено связыванием рРНК с красителем. Показано, что 37−45% РНК в клетке может находиться в двухспиральной конформации (Darzynkiewicz et all., 1975).
Димеры АО, связанные с односпиральными участками рРНК, флуоресцируют в красной области спектра I^oМономеры АО, интеркалированные в двухспиральные участки рРНК, флуоресцируют в зеленой области спектра I530- Следовательно, соотношение величин интенсивностей люминесценции комплексов АО с односпиральными и двуспиральными участками РНК Омо/Ьзо), обозначенное как параметр, а (а^мо/^зо) (Карнаухов, 1978), отражает соотношение однои двухспиральных участков рРНК в цитоплазме. Окрашивание цитоплазмы акридиновым оранжевым (АО) выявляет состояние рРНК в рибосомах (Gordon et all, 1997) и в связи с этим используется как показатель функциональной (синтезирующей) активности клетки (Карнаухов, 1978; Гордон, 1989; Карнаухов, 2001; Сергиевич, 2002; Карнаухова и др., 2002). Так, при увеличении температуры среды обитания моллюсков от 4 до 18 °C возрастает количество рибосом в цитоплазме (Вартонь, Боровягин, 1977), сопровождаемое повышением значения параметра, а (Мельникова, Карнаухов, 1980).
Изменения ультраструктуры нейронов на внешние воздействия.
На изменение внешних условий клетки отвечают общими изменениями ультраструктуры внутриклеточных органе лл. Так при стимуляции мотонейронов спинного мозга лягушки в течение 10 мин электрическими стимулами частотой 1Гц наблюдалось набухание элементов эндоплазматического ретикулума с его частичной дегрануляцией. При этом уменьшалось количество рибосом и полисом (Меркулова, Даринский, 1982). Увеличение длительности раздражения до 25 минут при неизменной частоте приводило к более выраженным изменениям органелл: сильнее набухали митохондрии в соме нейрона и наблюдались более интенсивная пролиферация и набухание элементов пластинчатого комплекса. При.
24 увеличении частоты стимуляции до 50Гц и раздражении в течение 10 минут наблюдалось нарушение упорядоченности расположения эндоплазматического ретикулума и его вакуолизация, дегрануляция мембран ретикулума с трансформацией в гладкие. В цитоплазме встречались характерные образования эндоплазматической сети в виде спиралей и концентрических окружностей. Наблюдалась пролиферация мембран комплекса Гольджи, появление лизосом и мультивезикулярных тел вблизи этого органоида. Значительное набухание митохондрий сопровождалось деструктивными изменениями их крист. Однако наблюдаемые патологические сдвиги в организации нейрона были обратимы (Меркулова, Даринский, 1982). Набухание эндоплазматического ретикулума с вакуолизацией цитоплазмы, увеличением аутофагоцитоза и набуханием структурных элементов аппарата Гольджи наблюдали в местах разрыва клеточной мембраны при перфузии нейронов моллюска (Погорелая и др, 1980). После перфузии изолированных нейронов обнаруживалось много митохондрий со сжатым матриксом и сохранившимися кристами. При этом в участках, удаленных от места разрыва плазматической мембраны органеллы, в том числе митохондрии, оставались интактными. Диссоциация и сборка эндоплазматического ретикулума и мембран аппарата Гольджи происходят при оплодотворении и раннем развитии яиц морского ежа (Jaffe, Terasaki, 1993; Terasaki, 2000). Обратимые и необратимые изменения митохонд-риальной структуры описаны на растительных клетках (Vartapetian et all, 2003). Обнаруженная лентовидная структура митохондрий относится за счет видоизменения митохондриальной организации, имеющее адаптивный характер в результате длительной аноксии. В этой же работе отмечена роль экзогенных Сахаров в увеличении сроков переживания клеток растений в условиях аноксии. Интересные данные по связи морфологии митохондрий с их потенциальной функциональной нагрузкой приведены в работе Липиной с соавт. (2002). Сравнивая образ жизни и строение кардиомиоцитов трех видов моллюсков (морского ангела, прудовика и виноградной улитки) авторы пришли к выводу, что больший относительный объем митохондрий с более.
25 плотной их укладкой и очень большое число межмитохондриальных контактов в кардиомиоцитах морского ангела говорят о большей функциональной нагрузке на эти органеллы. Увеличенные митохондрии с вакуолизированными изменениями крист здесь однозначно свидетельствуют о повышенной активности этих органелл.
Физиологический стресс характеризуется быстрым и преимущественным синтезом так называемых стрессорных белков. Эти белки синтезируются и в нормальных клетках, но или в малых количествах или имеют другую локализацию. Так, иммунофлуоресцентными исследованиями установлено, что за фрагментацию и /или везикуляризацию эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи ответственны изменения во внутриклеточном распределении двух стрессорных белков, 80 и ЮОкД, которые в клетках, растущих в обычных условиях ассоциируются с мембранами ретикулума и аппарата Гольджи соответственно (Welch, Suhan, 1985). В клетках после воздействия теплового шока оба этих белка обнаруживаются в ядре. Однако вакуолизация Гольджи не оказывает заметного эффекта на его функцию.
Сходные изменения органелл клеток наблюдались под влиянием разных воздействий: электрораздражения (Bocharova et al., 1972) облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971), аноксии (Vartapetian et all, 2003), длительного инкубирования в условиях гипотермии и гипоксии (Griffiths et all, 2000; Jantti et all., 1993), действия тяжелых металлов (Fowler et all, 1983; Woods, Fowler, 1986), героина и морфина (Borgia et all, 1982; Borgia, Crowell et all, 1982). Известно, что дегрануляция эндоплазматического ретикулума и его пролиферация в гепатоцитах взрослых крыс под действием тяжелых металлов (Т1С13*4Н20) (инъекции, Woods, Fowler, 1986), или при воздействии ethylbenzene (вдыхание, Elovaara et all, 1985) зависят от дозы. При этом во всех случаях в цитоплазме клеток было отмечено изменение морфологии митохондрий. При любом воздействии, как правило, наблюдается образование и накопление лизосом. Сходные по морфологии частицы были описаны ранее в разных тканях многих животных.
Среди различных по морфологии лизосомных частиц выделяют по крайней мере четыре типа: первичные лизосомы, вторичные лизосомы, аутофагосомы и остаточные тельца (Ченцов, 1984). Среди вторичных лизосом выделяют особую группу лизосом — аутофагосомы, в составе которых встречаются фрагменты или целые цитоплазматические структуры: митохондрии, элементы ретикулума, рибосомы, гранулы гликогена и т, д. Число аутофагосом значительно возрастает при метаболических стрессах, при различных повреждениях клеток (Покровский, Тутельян, 1976) Остаточные тельца содержат меньше гидролитических ферментов, в них происходит уплотнение содержимого, его перестройка. Часто в остаточных тельцах наблюдается вторичная структуризация непереваренных липидов, которые образуют сложные слоистые структуры (ламеллярные структуры, миелиноподобные структуры). Здесь же происходит отложение пигментных веществ, возможно, участвующих в дыхании (каротиноиды, Карнаухов, 1988). Известно о накоплении так называемых цитосом (лизосом, ламеллярных структур) в цитоплазме нейронов зимних моллюсков (взятых из температуры содержания 4°С) (Warton, Borovjagin, 1977) Миелиноподобные структуры встречаются и в нормальных клетках. Они были обнаружены при ультраструктурном исследовании культуры клеток олигоденроцитов (Nussbaum et all, 1998), цитоплазмы сине-зеленых водорослей (Авакян и др., 1978) или нейронов моллюсков (Боровягин, Сахаров, 1968), в развивающихся ооцитах (Айзенштадт, 1984; Семакова, Киселева, 2003).Известно накопление гранул липофусцина и ламеллярных структур (миелиноподобных тел) в результате старения организмов (Frolkis et all, 1995). Дальнейшая судьба остаточных тел может быть двоякой — одни из них выбрасываются из клетки путем экзоцитоза, другие остаются вплоть до гибели (гранулы липофусцина).
Особое место занимает увеличение числа лизосом, связанное с усилением аутофагоцитоза, например, в ответ на разнообразные воздействия. Так, при отравлении крыс Т2 токсином (микотоксин, метаболит плесневых грибов, поражающих корма и пищевые продукты) (Кравченко и др., 1983), в результате электрораздражения (Меркулова, Даринский, 1982), под.
27 действием облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971) возникают обширные скопления лизосом, называемые еще очагами дегенерации. Очаги дегенерации в нейронах состоят из продуктов распада ультраструктур и окружающей мембраны, образуя фагосому. Известно, что развитие дегенеративных процессов в цитоплазме нейронов у различных животных при функциональном перенапряжении и других воздействиях не сопровождается гибелью клеток. Жизнедеятельность клеток сохраняется вследствие одновременно протекающих процессов образования лизосом, а также реперативной регенерации ультраструктур (Манина, 1971). В результате воздействия изменяется и внутренняя структура лизосом: появляются лизосомы, содержащие прерывистые и накладывающиеся друг на друга ламеллярные структуры (Nott, Moore, 1987). Увеличение числа лизосом в клетках при патологических процессах — обычное явление. Однако в большинстве случаев смерти клетки не предшествовало освобождение гидролаз из лизосом (Ченцов, 1984). Ферменты лизосом, без сомнения, участвуют в автолизе погибших клеток, но это вторичное явление, а не причина гибели самих клеток. Таким образом, изменение функционального состояния и действие повреждающих факторов вызывают в клетках однотипные изменения в состоянии рибосом, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, митохондрий и накоплении лизосом. В большинстве случаев изменения, вызванные повреждающими факторами, обратимы при восстановлении нормальных условий. Для выяснения механизмов действия низких температур и успешного научно обоснованного поиска условий низкотемпературного консервирования различных клеток, органов и тканей особое значение приобретает исследование состояния ультраструктурной организации клеток, так как этот уровень является единственным связующим звеном между данными молекулярной биологии, биофизики, биохимии и макромикроскопческой морфологии. Кроме того, изучение ультраструктуры клетки на уровне которой осуществляется непосредственная связь структурных и функциональных показателей, позволяет локализовать повреждения и в определенной мере прогнозировать степень восстановления.
В настоящее время по вопросу изменения ультраструктуры клетки при действии низких температур и факторов низкотемпературного консервирования имеются разрозненные работы, которые требуют обобщения с целью установления общих и частных закономерностей. В обзоре Пушкаря с соавт. (1978) по ультраструктуре клетки при воздействии низких температур и замораживания описаны изменения ультраструктуры митохондрий, выражающиеся в набухании, исчезновении крист отдельных митохондрий, снижении плотности матрикса. При этом как медленно, так и быстро оттаянные и/или замороженные клетки демонстрировали сходные изменения ультраструктуры митохондрий. Изменения гранулярного эндоплазматического ретикулума зависели от температуры инкубирования в растворе криопротектора: глицерин, добавленный при 0 °C вызывал значительно меньшее набухание ретикулума, чем при 22 °C. В последнем случае была отмечена незначительная дегрануляция ретикулума. О структурах комплекса Гольджи в цитоплазме клеток сразу после оттаивания ничего не говорится. Возможно, что наблюдаемое усиление вакуолизации цитоплазмы при низких температурах происходит за счет редукции диктиосом Гольджи.
В литературе, посвященной проблеме криоконсервации, изучение морфологии клеток на уровне световой и электронной микроскопии, метаболизма РНК и ДНК, белка и липидов (в том числе мембранных фосфолипидов), активности ферментов (в т.ч. мембранных) сводится к изучению повреждений и устойчивости под влиянием низкотемпературных факторов, и к оценке жизнеспособности криоконсервированного материала (на основании морфологических показателей, подвижности, пролиферирующей и регенерирующей способности) (Пушкарь и др. 1978; Белоус, Грищенко, 1994; Фуллер и др, 2003). Работ, посвященных характеру и динамике восстановления ультраструктуры и функции клеток после воздействия замораживания-оттаивания, в доступной литературе не обнаружено.
2. Материалы и методы.
Крупные и ярко окрашенные нейроны мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. (класс Gastropoda, подкласс Pulmonata, отряд Basommatophora) хорошо идентифицируются. На нейронах мозга этого моллюска были отработаны концентрации криопротективных веществ (Гахова, 1989) при замораживании, описаны электрофизиологические характеристики (Дьяконова с соавт. 1970; Бочарова, 1975), ультраструктурные особенности (Дьяконова с соавт. 1970; Warton et all, 1977; Pogorelaya et all, 1977). Большую роль при выборе объекта сыграла его доступность в природе. Большие размеры клеток позволяют изучать структурные и метаболические изменения на одиночных идентифицированных нейронах. На основании электрических характеристик можно говорить о сохранности клеточных мембран после замораживания-оттаивания.
3. Результаты исследования ультраструктуры криоконсервированного мозга после оттаивания свидетельствуют о восстановлении структуры и функции нейрона в течение 8 часов инкубирования при 4−6°С.
4. Диметилсульфоксид оказывает влияние на структуру и функцию клетки. Уровень функциональной активности под воздействием 2 М ДМСО возрастает в среднем на 35% относительно контроля и вносит основной вклад в изменения параметра, а криоконсервированных нейронов.
5. Криоконсервированные нейроны после длительного (18 часов) инкубирования в физиологическом растворе при 4−6°С способны формировать отростки.
6. Общая картина ультраструктурных и функциональных изменений нейронов после оттаивания является следствием суммарного воздействия ДМСО, длительного инкубирования в физиологическом растворе и физических процессов, сопровождающих замораживание-оттаивание клеток.
Заключение
.
В результате проведенных исследований получены данные, свидетельствующие о том, что нейроны прудовика Lymnaea stagnalis L. способны возвращаться к жизнедеятельности после замораживания и длительного, до 2-х лет, хранения изолированного мозга при температуре жидкого азота, -196°С. Электрические параметры (МП и ПД) мембран восстанавливались до характерных для данных нейронов значений, что согласуется с ранее полученными данными (Гахова и др., 1989; Gakhova et al., 1997). Впервые показано, что нейроны, изолированные из криоконсервированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. и помещенные в культуру in vitro, способны к регенерации, образуя отростки неотличимые от таковых у контрольных нейронов. Однако для проявления этих функций нейронам после оттаивания необходимо было пройти восстановительный период: выдерживание деконсервированного и отмытого от криопротектора (ДМСО) мозга моллюска в физиологической среде при низкой температуре (4−6°С). Для восстановления электрических параметров в этих условиях потребовалось не менее 1,5−2 часов. Для формирования нейрональных отростков перед высевом в культуру также было необходимо предварительное выдерживание оттаянного мозга при низких температурах (в наших экспериментах от 15 до 18 часов, Ивличева, Дмитриева и др., 2004).
Люминесцентное и электронномикроскопическое исследования нейронов показали сложный характер морфофункциональных изменений в этот период (Дмитриева и др, 2001; Dmitrieva et all, 2003). Максимальные изменения функциональной активности криоконсервированных нейронов по параметру, а (увеличение значения, а на 35−40% после оттаивания нейронов и отмывания криопротектора) находились, как показано нами, в соответствии с физиологически обусловленным диапазоном для этого объекта (Карнаухова, Сергиевич, Дмитриева и др., 2002).
Исследование изменений ультраструктурной организации идентифицированного нейрона МПЗ под влиянием криопротектора ДМСО, замораживания-оттаивания, длительного инкубирования в физиологическом растворе и охлаждения показало, что на каждое воздействие клетка отвечает сходными изменениями органелл. Исследование влияния ДМСО показало набухание цистерн (приядерная область) и разрыхление эндоплазматического ретикулума с частичной фрагментацией («розетты», Манина, 1971), образование большого количества лизосом, увеличение объема отдельных митохондрий приядерной области наряду с нормальными митохондриями на периферии клетки. После инкубации с ДМСО наблюдалось увеличение складчатости ядерной мембраны. Под воздействием ДМСО происходило накопление большого числа электронно-плотных гранул, лизосом, липосом, ламеллярных структур, наблюдалось появление крупных вакуолей. При последующем инкубировании этих нейронов в физиологическом растворе при 4−6°С изменения ультраструктуры нейрона МПЗ носили сходный характер с изменениями ультраструктуры, наблюдаемыми при длительном инкубировании в физиологическом растворе контрольных нейронов. Замораживание-оттаивание оказывало более сильное воздействие на ультраструктурную организацию нейрона, чем криопротектор. В ультраструктурной организации нейрона сразу после оттаивания (без отмывания ДМСО, 22°С) прежде всего необходимо отметить зональность морфологических изменений органелл, выраженную сильнее, чем при воздействии только криопротектора. Наиболее значительны были изменения органелл приядерной области клетки: сильное увеличение цистерн ретикулума в объеме, набухание митохондрий с деструктивными изменениями крист, увеличение складчатости ядерной мембраны. Периферическая часть цитоплазмы практически не показала изменений: митохондрии имели нормальные размеры и форму, цистерны эндоплазматического ретикулума были лишь незначительно увеличены в объеме. Изменения диктиосом аппарата Гольджи не были подчинены зональности цитоплазмы, носили одинаковый характер и выражались ь формировании комплексов сложных пузырьков. Развивалась общая вакуолизация цитоплазмы. После отмывания криопротектора отмечено усиление общей вакуолизации цитоплазмы криоконсервированных нейронов, выраженное в дальнейшем увеличении цистерн ретикулума, присутствии большого количества гладкоконтурных пузырьков. Ультраструктурная организация ядрышка свидетельствует об усилении синтетических процессов в ядре (увеличение гранулярного компонента в ядрышке), при этом наблюдалось увеличение числа пор ядерной оболочки (рис. 27). Редко встречающиеся структуры комплекса Гольджи представляли собой 2−5 электроннопрозрачных цистерн. Происходило накопление разнообразных по форме и размеру ламеллярных структур, в большей степени, чем липосом и лизосом. Митохондрии с деструктуивными изменениями уже не встречались, но возрастало число лизосом. Можно отметить усиление аутофагоцитоза, что также может свидетельствовать о начале процессов нормализации ультраструктурной организации нейрона. При последующем инкубировании криоконсервированных нейронов в физиологическом растворе при 4−6°С наблюдалось начало сборки цистерн аппарата Гольджи в единый комплекс, уменьшение объема цистерн ретикулума, их организация в единую сеть. Ультраструктурная организация ядрышка в этот период говорит об инволюции ядра, ведущей к снижению активности. На охлаждение от 22 до 4−6°С контрольные нейроны отвечали сходными изменениями органелл цитоплазмы: набуханием цистерн ретикулума, формированием комплексов сложных пузырьков из аппарата Гольджи (вакуолизация цитоплазмы), увеличением складчатости ядерной мембраны, увеличением числа пор ядерной оболочки (ультраструктурная организация ядрышка в этот период свидетельствует об активации синтетических процессов в ядре), набуханием митохондрий с деструктивными изменениями крист. В общем, ультраструктурная организация контрольных нейронов после охлаждения свидетельствует об увеличении синтетической активности клетки. После длительного инкубирования в физиологическом растворе в ультраструктурной организации всех нейронов (как опытных, так и.
90 контрольных) наблюдались сходные изменения эндоплазматического ретикулума, митохондрий (удлинение и уплощение). В некоторых клетках были видны скопления гранул на периферии клетки. Уплощенные цистерны комплекса Гольджи образовывали сеть, встречалось много лизосом, ламеллярных структур, на периферии клетки присутствовали скопления структур, называемые очагами дегенерации (Манина, 1971). Встречались гипертрофированные структуры аппарата Гольджи, измененные цистерны ретикулума (розетты, свидетельствующие о фрагментации ретикулума), большие вакуоли в цитоплазме.
Описанные изменения ультраструктуры в результате а) влияния ДМСО, б) воздействия замораживания-оттаивания, в) охлаждения от 22 до 4−6°С и г) длительного (8ч) инкубирования в физиологическом растворе при 4−6°С демонстрируют сходный (независимо от воздействия) характер перестроек эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, митохондрий, образование и накопление лизосом, ламеллярных структур, очагов дегенерации, увеличение количества крупных вакуолей, присутствующих в меньших количествах в норме. Описанные изменения в ультраструктурной организации нейрона после воздействий не приводят к гибели клетки.
Аналогичные изменения органелл клеток наблюдались под влиянием разных воздействий: электрораздражения, облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971), аноксии (Vartapetian et all, 2003), длительного инкубирования в условиях гипотермии и гипоксии (Griffiths et all, 2000; Jantti et all., 1992), действия тяжелых металлов (Fowler et all, 1983; Woods, Fowler, 1986), героина и морфина (Borgia et all, 1982; Borgia, Crowell et all, 1982). Известно, что дегрануляция эндоплазматического ретикулума и его пролиферация в гепатоцитах взрослых крыс под действием тяжелых металлов (Т1С13*4Н20) (инъекции, Woods, Fowler, 1986) зависят от дозы, При этом во всех случаях в цитоплазме клеток было отмечено изменение морфологии митохондрий. Повышение объемной плотности митохондрий (набухание) также не может однозначно свидетельствовать в пользу повышения функциональной активности этих органелл или.
91 свидетельствовать наоборот, о снижении их функции. Так, изучая влияние радиационного облучения на размеры митохондрий кардиомиоцитов крыс в ранние сроки после облучения обнаруженное увеличение количества крупных митохондрий авторы связывали со снижением их дыхательной функции (Сироткин и др., 1988). В работах Маниной (1971) набухание митохондрий связывается скорее с увеличением их функции, чем со снижением активности. Подобные изменения цистерн гранулярного ретикулума (набухание) наблюдались при охлаждении другими авторами (Arber et all., 1986). Под влиянием циклогексимида, известного ингибитора белкового синтеза, происходило образование в цитоплазме скоплений трубчатых структур различного размера, лизосом и ламеллярных структур (Horvath et all, 1973). В цитоплазме криоконсервированных нейронов после длительного выдерживания в физиологическом растворе также обнаруживались подобные образования, но особенно много их было в цитоплазме контрольных нейронов. Характерные образования эндоплазматической сети в виде спиралей и концентрических окружностей в цитоплазме опытных нейронов после 8 часового инкубирования в физиологическом растворе при 4−6°С не отличались от наблюдаемых после воздействия электрораздражения мембранных образований (Меркулова, Даринский, 1982). Возможно, что длительное влияние физиологического раствора оказывало на нейроны даже больший эффект, чем замораживание-оттаивание.
Известно, что широко применяемый криопротектор ДМСО может оказывать не только защитное, но и повреждающее действие на клетку (Kopeika et al., 2003).
Скопление лизосом и электронно-плотных гранул на периферии клетки может свидетельствовать также и о повреждениях внутриклеточных структур (Манина, 1971), которые не были летальными для клетки, 4Td подтверждается ростом отростков в клеточной культуре. Под воздействием ДМСО наблюдалось образование и накопление лизосом, содержащих прерывистые и накладывающиеся друг на друга ламеллярные структуры, пожалуй, даже в большей степени, чем в результате замораживания-оттаивания или длительного инкубирования. Сходное усиление аутофагических процессов в клетках Mytilus edulis наблюдали под действием антрацена и фенантрена (Nott, Moore, 1987), тяжелых металлов (Fowler et all, 1983).
В работе методами люминесцентной и электронной микроскопии показано, что значительный вклад в ответ клеток на замораживание-оттаивание составляет ответ нейрона на воздействие криопротектора, в частности ДМСО.
Таким образом, комплексное изучение нейрона после криоконсервации изолированного мозга моллюска позволило не только показать сохранение жизнеспособности нейронов после временной остановки его жизнедеятельности, но и охарактеризовать структурно-функциональные перестройки клетки при воздействии разных факторов, сопровождающих процесс криоконсервации. Общая картина функциональных и структурных перестроек нейрона после криоконсервации носит компенсаторный характер.
