Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster

1.1. Актуальность проблемыРНК-интерференция (РНКи) представляет собой подавление экспрессии генов, мобильных элементов и вирусов с помощью гомологичных коротких РНК (Ghildiyal and Zamore, 2009). К настоящему моменту у животных выделяют три основных класса репрессивных коротких РНК: siRNA (short interfering RNA), miRNA (microRNA) и piRNA (PIWI interacting RNA). piRNA активно изучаются в последние несколько лет, однако механизмы репрессии с помощью piRNA изучены гораздо меньше, чем для siRNA и miRNA. piRNA функционируют в составе эволюционно консервативной системы, подавляя экспрессию мобильных элементов в терминальных тканях животных. Нарушение функции piRNA приводит к транспозиционному взрыву и, как следствие, к утрате плодовитости. piRNA, как и другие классы коротких PIIK, действуют в составе комплексов RISC (RNA induced silencing complex). В состав этих комплексов входят белки семейства Argonaute (Ago), которые связывают короткие РНК. piRNA связываются белками Ago, относящимся к подсемейству PIWI. Механизм сайленсинга мобильных элементов с помощью piRNA изучен недостаточно. Существующие скудные данные указывают на то, что piRNA могут вызыпачь как деградацию мРНК мобильных элементов, так и их транскрипционный сайлепсинг. Белки подсемейства PIWI у дрозофилы (Aub, Ago3 и Piwi) и крысы (Riwi) обладают эндонуклеазной активностью (Gunawardane et al., 2007; Lau et al., 2006: Nishida et al., 2007; Saito et al., 2006). В яичниках и семенниках дрозофилы белки Aub и Ago3 локализуются преимущественно в ' перинуклеарных гранулах (структура, называемая «nuage», от франц. «облако»), что предполагает скорее посттранекрипционный механизм сайленсинга. С другой стороны, в яичниках дрозофилы белок Piwi локализуется в ядрах. Мутация в гейе spn-E, который необходим для образования и/или стабилизации piRNA, приводит к «открыванию» хроматина мобильных элементов (Klenov et al., 2007). В семенниках мышей показапа роль piRNA в метилировании ДНК мобильных элементов. Таким образом, потенциально piRNA могут подавлять экспрессию как с помощью деградации мРНК, так и на транскриицио’Шюм уровне, посредством эпигенетических модификаций. piRNA впервые были обнаружены в Лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики РАН при изучении системы подавления экспрессии семенник-специфичных повторяющихся генов Stellate (Aravin et al. 2001; Aravin et al. 2004). Эти piRNA продуцируются повторами Su (Ste) (Suppressor of Stellate), которые расположены на Y-хромосоме и имеют 90% гомологии с генами Stellate, которые расположены на Х-хромосоме и кодируют белок Stellate, гомологичный регуляторной Р субъединице казеин киназы 2 (Bozzetti et al., 1995). piRNA Su (Ste) связываются белком Aub. Делеция повторов Su (Ste) или мутация в гене aub ведёт к исчезновению piRNA Su (Ste) в семенниках и значительному увеличению количества мРНК Stellate, что вызывает накопление белка Stellate в кристаллах, приводя к нарушению сперматогенеза и стерильности самцов. Как и в случае piRNA-зависимого подавления экспрессии мобильных элементов, механизм репрессии генов Stellate с помощью piRNA Su (Ste) изучен недостаточно. Показано, что комплекс piRNA Su (Ste) и белка Aub способен деградировать мРНК Stellate in vitro (Nishida et al., 2007). Данная работа посвящена сравнению вклада механизмов деградации мРНК и репрессии транскрипции в Su (Ste) piRNA-зависимый сайленсинг генов Stellate.

1.2. Цели и задачи работыЦелью настоящей работы являлось исследование особенностей механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su (Ste). Были поставлены следующие задачи:1. Оценить вклад транскрипционного и посттранскрипционного сайленсинга в Sa (Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate. Для этого следовало сравнить степень увеличения количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов Stellate в семенниках дрозофилы при делеции повторов Su (Ste) или мутации в гене aub. Обнаружение сопоставимого возрастания количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов будет свидетельствовать о транскрипционной регуляции, а возрастание только уровня сплайсированных транскриптов укажет на посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов Stellate-2. Разработать способ раздельной детекции транскриптов эуи гетерохроматиновых генов Stellate и сравнить механизм их репрессии с помощью piRNA Su (Ste)-3. Определить, происходит ли деградация транскриптов Stellate в ядрах терминальных клеток семенников-4. Сравнить особенности piRNAи siRNA-зависимого подавления экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ.

1.3. Научная новизна результатов исследованияПоказано, что piRNA Su (Ste) подавляют экспрессию генов Stellate в основном с помощью деградации мРНК, происходящей не только в цитоплазме, но и в ядрах сперматоцитов. Экспрессия эуи гетерохроматиновых генов Stellate подавляется примерно в равной степени, что указывает на отсутствие влияния структуры хроматина на piRNA-зависимую регуляцию. Обнаружено сходство механизмов piRNAи siRNA-зависимой репрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ. Полученные данные позволяют предположить, чго piRNA, подобно siRNA, вызывают деградацию только немаскированных трансляционно активных транскриптов.

1.4. Практическая ценностьПолученные данные позволяют прояснить особенности механизма подавления экспрессии с помощью эволюционно консервативной системы РНКи у дрозофилы, чго может быть использовано при изучении биологических процессов в терминальных клетках человека, в регуляции которых РНКи играет существенную роль.

1.5. Апробация работыРабота апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки ИМГ РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на конференции, посвященной механизмам РНК-интерференции (Keystone Symposia, США, 2005), на конференциях для молодых учёных (Пущино, 2005, 2006; Киев, 2007), на конкурсе работ молодых учёных на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, 2008).

Структура и объём диссертацииДиссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и содержит главы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Диссертация содержит 19 рисунков, 1 таблицу и 241 литературную ссылку.

Заключение

.

В обзоре литературы представлено многообразие механизмов подавления экспрессии с помощью коротких РНК у дрозофилы, млекопитающих и, в меньшей степени, у других организмов. Короткие РНК могут вызывать деградацию полностью комплементарной РНК и/или подавлять транскрипцию гомологичного гена. Частичная комплементарность короткой РНК и мРНК может приводить к подавлению трансляции и/или к деградации мРНК. Наличие альтернативных.

механизмов ставит вопрос о вкладе того или иного механизма в суммарную репрессию. Задачей данной диссертационной работы было сравнение вклада деградации мРНК или подавления транскрипции в Su (Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate.

В разделе 1.4 обзора литературы рассмотрена локализация процессов РНКи. Очевидно, что подавление транскрипции происходит при помощи комплексов RISC, находящихся в ядре, а подавление трансляции при помощи RISC, находящихся в цитоплазме. Во многих случаях остаётся открытым вопрос о компартменте, в котором происходит деградация РНК-мишени. Считается, что большая часть такой деградации происходит в цитоплазме клеток, однако показано существование процессов деградации РНК-мишени и в ядрах. В данной работе определяли локализацию процессов деградации мРНК Stellate.

В настоящее время активно изучаются принципы взаимодействия коротких РНК с РНК-мишенями. Такие исследования проводятся в основном для miRNA (раздел 2.2.2.). Обнаружено, что главную роль в узнавании мишеней играет 5' часть miRNA. Для эффектовной посадки miRISC комплементарный сайт-мишень в мРНК должен быть расположен в З’НТО и иметь определённое нуклеотидпое окружение. В меньшей степени изучены механизмы регуляции таких взаимодействий. Взаимодействие miRNA с мишенью может ингибироваться регуляторными белками, связывающимися с мРНК вблизи места посадки miRISC. В то же время, почти совсем не изучены закономерности процессов взаимодействия коротких РНК с мРНК-мишенями, являющимися объектами других регуляторных систем. Наши данные на примере механизма сайленсинга генов Stellate частично заполняют этот пробел и позволяют предположить, что трансляционно репрессированные мРНК не подвергаются piRNA-зависимой репрессии.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Линии Drosophila melanogaster и генетические скрещивания.

Линии трансгенных мух, несущих одиночную инсерцию реггортёрной конструкции Ste703-lacZ или Stel34-lacZ на хромосомах 3 или 2, соответственно, были любезно предоставлены А. Тулиным и А. Аравиным. Репортёрные конструкции Ste703-lacZ и Stel34-lacZ содержат целый или 101 нуклеотид промотора Stellate и 141 или 33 нуклеоти" да транскрибируемой последовательности Stellate, соответственно, слитые с репортёрным геном lacZ. В состав репортёрной конструкции Ste703-lacZ входили шесть гетерохроматиновых генов Stellate. В результате скрещиваний были получены линии, несущие одну из конструкций в гомозиготном состоянии и делецию локуса Su (Ste) на Y хромосоме.

3.2. Использованные праймеры.

Праймеры для количественного ПЦР в реальном времени.

Праймеры к Stellate (см. рис 8).

1 5A AGTCTG АТАС AC AGCTGG ACGG AGC G.

2 5'-CGCTTGCACTTGCAGTACCTAG.

3 5-CCTGACCAATATTCCGATATTCTTTGGC.

4 5'-GGGTCGTCCAGGGGCGATC.

5 5-GTAATTCTCCGAATATAGTC.

6 5-CGATTTGAGTTGCATCAAGGCTTTCA.

Другие праймеры.

Adh-d3 5'-CGGCATCTAAGAAGTGATACTCCCAAAA Adh-r3 5-TGAGTGTGCATCGAATCAGCCTTATT.

Праймеры для полуколичественного ПНР.

Праймеры для получения ПЦР продукта, использованного в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной РНК T7-DSS1 (для Sie или Su (Ste)) 5';

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTCTGTGAACGAGTGAACTGGC T7-DSS2 (для Sie или Su (Ste)).

5-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTTACCGTGGGTTGTCCAGG T7-DSG1 (для lacZ).

5'-TAATACGACTCACTATAGGGATTCCACGTGGTTATGCCGATCGCGT T7-DSG2 (для lacZ).

5-TAATACGACTCACTATAGGGATTCCACATATCGGTGGCCGT'GGTGT T7-GFP1 5';

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGGCGAGGAGCTGTTCACC.

T7-GFP3 5';

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCCGAGGTGAAGTTCGAGG.

Праймеры, использованные при анализе экспрессии трансгенных конструкций Ste-lacZ в семенниках.

DSG1 (для Ste-lacZ) 5'-GTGGTTATGCCGATCGCGT DSG2 (дляSte-lacZ) 5-ATATCGGTGGCCGTGGTGT rp49d 5'-CAGGCCCAAGATCGTGAAG.

ф49г 5 '-TG AG AACGC AGGCGACC.

Праймеры, использованные при анализе экспрессии репортёрных конструкций hsp70-Ste-lacZ, hsp70-lacZ и hsp70-GFP в культуре клеток DSG1 (см. выше).

lacZ-rev 5ACCGCC AAGACTGTTACCCAT.

T7-GFP1 (см. выше).

5-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTGCTCAGGTAGTGGTTGTCG.

3.3. Выделение РНК из семенников или из ядерной и цитоплазматической фракций.

3.4. Обратная транскрипция.

проводились в объёме 30 мкл. Пробы +RT иRT амплифицировали параллельно. Во всех реакциях ОТ-ПЦР, приведенных в работе, не выявлялось продуктов амплификации вRT при тех же условиях.

3.5. Количественная ПЦР в реальном времени.

Количественную ПЦР использовали для оценки представленности кДНК эу-или гетерохроматиновых копий Stellate в семенниках или в ядерной и цитоплазматической фракциях, выделенных из семенников. Количественная ПЦР в реальном времени основана на том, что количество ПЦР-продукта в реакционной смеси определяется после каждого цикла амплификации по флуорисценции красителя SYBR green, появляющейся при его встраивании в образующиеся молекулы двухцепочечной ДНК. В каждую реакцию брали 3 мкл кДНК, по 2 мкл. каждого праймера в концентрации 3.3 пМ, 3 мкл. 10х буфера (0.67 M Tris-HCl рН 8.8, 166 мМ (NH4)2S04, 0.1% Twcen-20), 6 мкл. 25 мМ MgCb. 6 мкл. смеси четырёх дНТФ с концентрацией 1 мМ каждого дНТФ, SYBR green (1/10 000 из стока стандартной концентрации, Синтол), ROX (1/3000 из стока с концентрацией 100 pmole/мкл., Синтол) и 0,6 мкл. Hot Start Taq ДНК полимеразы (5и/мкл., СибЭнзим). ПЦР проводили в приборе Chromo4 (BioRad). В каждом эксперименте параллельно строили калибровочную кривую, показывающую зависимость порогового цикла амплификации от количества ДНК, добавленной в реакцию.

3.6. Выделение геномной ДНК Drosophila.

Буфер ТЕТ: 0.1 М Tris pH 9.1, 50 mM EDTA, 0.2% Triton Х-100.

3.7. Стандартные молекулярно-биологические методы.

Стандартные методы полимеразной цепной реакции, рестрикции,.

электрофореза и т. д. выполняли в соответствии с руководством (Sambrook J., 2001). Использовали ферменты и реактивы фирм MBI Fermentas, Ambion, Promega, Boehringer и др.

3.8. Выделение ядерной и цитоплазматической фракций из семенников.

Семенники извлекали из самцов, помещали в раствор С39 на льду, осаждали,.

Буфер для лизиса: 350 мМ сахарозы, 15 мМ HEPES (pH 7.6), 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА, 0.5 мМ ЭГТА, 1 мМ DTT, protease inhibitor cocktail (Roche), 0.5 u RNasin Plus (Promega).

Ресуспензионный буфер: 290 мМ сахарозы, 5 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 1.5 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, Triton Х-100 0.04%, protease inhibitor cocktail (Roche), 0.5 u RNasin Plus (Promega).

3.9. Нозерн анализ.

Буфер для нанесения: 95% формамид, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол, 0,025% SDS, 18 mM EDTA.

IxTBE: 89тМ Tris base, 89тМ борная кислота, 2 mM EDTA (pH 8), pH 8.3.

Буфер Church: 0.5 M фосфатный буфер pH 7.5, 1 тМ ЭДТА, 7% SDS.

Предгибридизационный буфер: 50 тМ фосфатный буфер pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.1% Фикол400, 0.1% поливинилпиролидон, 0.1% пирофосфат, 50 мкг/мл гепарин, 25 мМ ЭДТА, 1% саркозил, 150 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося.

Буфер для кинирования: 0.7 M Tris-IiCl, 0.1 M MgCl2, 50 мМ DTT. pH 7.6.

20xSSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H507.

Используемые олигонуклеотидные зонды:

mt tRNA M 5'-GGGTATGAACCCAGTAGCTTAA-3',.

tRNA К 5 '-AG ATTAAGAGTCTC ATGCTCTA-3.

piRNA Su (Ste)-4 5'- TCGGGCTTGTTCTACGACGATG-3'.

3.10. Сравнение количества белка по методу Бредфорда.

10 мкл. Z-буфера с гомогенизированными в нём семенниками или 1мкл ядерной или цитоплазматической фракций смешивали с 200 мкл. 5Х Bio-Rad Protein Assay буфера, после чего добавляли 800 мкл. воды и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре. В образцах измеряли поглощение при длинне волны 595 нм. В каждом опыте брали двойное количество субстрата, чтобы проверить линейную зависимость между количеством белка и интенсивностью сигнала.

3.11. Вестерн анализ.

Количество белка, используемого для Вестерн анализа, было выровнено с использованием метода Бредфорда. Для оценки чистоты разделения ядерной и цитоплазматической фракций проводили Вестерн анализ с мышиными моноклональными антителами к ламину В (DmO ADL67.10, Developmental Studies Hybridoma Bank), кроличьими моноклональными антителами к у-тубулину (Sigma).

Буфер для нанесения: 2% SDS, 100 мМ DTT, 60 мМ Tris-HCl рН 6.8, 0.01% бромфеноловый синий, 10% глицерин.

Буфер для электрофореза: 48 мМ Tris-HCl рН 9.2, 48 мМ глицин, 0.15% SDS.

Буфер для электропереноса: на 1 литр 3 г. Tris, 14.4 г. глицин, 77 мл. 96% этанола (готовить перед употреблением).

Буфер для забивки: 90% (по объёму) 0.5% молока, 0.1% Tween-20, IxPBS (1.7 мМ КН2Р04, 5.2 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl).

Буфер для промывки: IxPBS, 0.1% Tween-20.

Щелочной буфер: 100 мМ Tris рН 9.2, 100 мМ NaCl.

3.12. Иммуноокрашивание семенников и ядер

Ядерную фракцию наносили на предметное стекло (SuperFrost Plus Gold, Menzel-Glaser) и инкубировали 15 мин., чтобы ядра осели. Ядра фиксировали в течении 15 мин. в растворе 1.8% параформальдегида в lxPBS при комнатной температуре, промывали три раза в растворе РВТ по 5 мин. и инкубировали при комнатной температуре в течении 1−2 часов в растворе РВТ, содержащем 3% козьей антисыворотки и 0.1% Tween-20. Обработка антителами проводилась так же, как при иммуноокрашивании семенников.

Раствор PBTD: lxPBS, 0.1% Tween-20, 0.3% Triton Х-100, 0.3% дезоксихолат натрия.

Раствор РВТ: lxPBS, 0.1% Tween 20.

3.13. Гистохимическая окраска органов на активность ß—галактозидазы.

Механически выделенные из имаго семенники помещали в раствор 0,15 M.

Раствор С39: 3,2 mM NaH2P04, 4,2 mM NaHC03, 21 mM KCl, 69 mM NaCI.

Галактозидазный буфер: 0,15 М NaCI, 10 mM NaH2P04, pH 7,5, 1 шМ MgCl2, 3,1 mM K3[Fen (CN)o], 3,1 mM К4[Реш (СЫ)б|. Готовый раствор хранили в темноте, не более месяца.

3.14. Количественное определение активности ß—галактозидазы.

Z-буфер: 60 mM Na2HP04, 40 mM NaH2P04, 10 mM KCl, 1 mM MgS04, 0,35% меркаптоэтанол.

3.15. Полуколичественная ПЦР.

3.16. Электрофорез ПЦР-продуктов в акриламидном геле.

Препараты радиоактивно меченых продуктов ПЦР смешивали с буфером для.

нанесения в соотношении 3:2, наносили 2/5 ПЦР смеси на 1 форез. Для электрофореза использовался 5% полиакриламидный гель.' Электрофорез проводили при 25V/cm, в 1ХТВЕ до выхода бромфенолового синего. Гель после фореза переносили на лист ЗММ бумаги, сушили до полного исчезновения следов влаги и экспонировали на экран фосфоимиджера. Интенсивность полученных сигналов рассчитывали с использованием программы Image Quant.

Состав буфера для нанесения: 50% глицерин, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол.

Состав акриламидного геля: 5% раствор акриламид/бисакриламид (в соотношении 19/1) на бидистилированной воде, 1ХТВЕ (89 мМ Tris, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН8,3).

3.17. Выделение плазмидной ДНК.

Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в культуру клеток S2 Drosophila осуществляли из 25 или 100 мл культуры E. coli с помощью колонок Quagen Midi или Maxi в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

3.18. Получение дцРНК.

Для получения двухцепочечных РНК использовали ПЦР-продукты, ограниченные двумя противоположено ориентированными Т7 промоторами для синтеза смысловой и антисмысловой цепей РНК. ПЦР-продукты для синтеза.

дцРНК Su (Sie), Ste, GFP или lacZ получали с помощью ПЦР с праймерами, содержащими на 5' концах последовательности Т7 промотора, с плазмид, несущих последовательности Su (Ste), Ste, GFP или lacZ, соответственно.

3.19. РНКи в культуре клеток Drosophila melanogaster.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. piRNA Su (Ste) вызывают деградацию мРНК Stellate.

В геноме D. melanogaster на Х-хромосоме находятся тандемно повторяющиеся гены Stellate, а на Y-хромосоме гомологичные генам Stellate повторы Suppressor of Stellate (Su (Ste)). Гены Stellate и повторы Su (Ste) экспрессируются в семенниках. Белок Stellate гомологичен регуляторной р-субъединице протеинкиназы CKII и связывает каталитическую а-субъединицу CKII в ядрах, что может влиять на фосфорилирование ядерных белков (Bozzetti et al., 1995; Egorova et al., 2009; Livak, 1984; Livak, 1990). Повторы Su (Ste) в отличие от генов Stellate содержат поврежденные открытые рамки считывания и, по-видимому, не могут кодировать функционального белка (Balakireva et al., 1992; Kalmykova et al., 1998). При делеции повторов Su (Ste) происходит значительное увеличение количества мРНК Stellate, что вызывает накопление белка Stellate в виде кристаллов преимущественно в цитоплазме, а также в растворимой форме в ядрах сперматоцитов (Bozzetti et al., 1995; Egorova et al., 2009). Это приводит к различным мейотическим нарушениям в ходе сперматогенеза в линиях с меньшим числом генов Stellate и к стерильности самцов в линиях с большим числом генов Stellate (Livak, 1984; Livak, 1990; Palumbo et al., 1994). Показано, что транскрипция повторов Su (Ste) происходит в двух направлениях (Aravin et al., 2001). Антисмысловые транскрипты Su (Ste) нарезаются с помощью мало охарактеризованного механизма «первичного процессинга» (см. обзор литературы), что приводит к образованию piRNA Su (Ste) длиной 25−27 нуклеотидов. piRNA Su (Ste) связываются белком Aub (Nishida et al., 2007). Мутация в гене Aub приводит к исчезновению piRNA Su (Ste) и дерепрессии генов Stellate. Подавление экспрессии генов с помощью коротких РНК (в том числе piRNA) может происходить как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях (см. обзор литературы). Одна из задач настоящей работы состояла в оценке вклада транскрипционного и посттранскрипционного механизмов в Su (Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate.

Методом количественного ОТ-ПЦР в реальном времени (кОТ-ПЦР) оценивали эффект делеции повторов Su (Ste) или мутации aubstms' на количество.

сплайсированиых и несплайсированных (новообразованные в результате транскрипции пре-мРНК, не успевшие ¡-юдвергнуться процессу сплайсинга) транскриптов Stellate в семенниках. Увеличение количества несплайсированной мРНК Stellate при нарушении сайленсинга указывало бы на транскрипционную репрессию. Увеличение количества только сплайсированной мРНК Stellate укажет на то, что piRNA Su (Ste) вызывают деградацию мРМК Stellate. Такой подход основывается на том, что короткие РНК могут влиять на процессы транскрипции или деградации мРНК. а не на эффективность сплайсинга транскриптов-мишеней Действительно, у растений, дрожжей, дрозофилы и млекопитающих показано, что разные типы коротких РНК подавляют трансляцию, транскрипцию или вызывают деградацию мРНК-мишеней (см, обзор литературы), В тоже время, среди данных литературы отсутствуют указания на влияние коротких РНК на эффективность сплайсинга.

ciajH трямскрнпинн.

эухроматиноная khindi Stellate.

пол и А.

пол м Л.

Рис. 8. Схема эуи гетерохроматиновых КОПИЙ генов Stellate и положение праймеров, использованных для ПЦР. Подобранные праймеры обозначены цифрами ?-6, Пары нраймеров 1/3 и 2/3 использованы для амплификации эухроматиновых КОПИЙ Stellate, поскольку праймер 3 комплементарен последовательности, которая отсутствует к гетерохроматиновых копиях. Праймеры 1/3 (эу спл) амплифинируют преимущественно сплайсированиые транскрипты, поскольку для эухроматиновых копий Stellate их количество значительно больше, чем несплайсированных. Праймеры 2/3 (эу нести) амплифицнруют только несплайсированные транскрипты. Пары праймеров ¼ (гет сум) или 5/6 (гет неепп) позволяют амплифицировать сумму или несплайсированные транскрипты гетерохроматиновых копий Stellate, соответственно, поскольку 3' концевые нуклеотиды праймеров 4 и 6 комплементарны единичным нуклеотидным заменам, различающим оба типа Stellate (показаны большими буквами). При вычитании количества несплайсированных транскриптов из суммы получали количество сплайсированиых транскриптов гетерохроматиновых копий Stellate.

гетерохроматиновая копим Stellate.

Геном Drosophila melanogaster содержит два кластера генов Stellate, расположенные в эухроматиновом регионе 12Е (aySte) или дистальном гетерохроматине X хромосомы (reTSte) (Livak, 1990; Palumbo et al., 1994; Shevelyov, 1992; Tulin et al., 1997). Благодаря единичным нуклеотидным заменам, различающим эти кластеры, были подобраны праймеры, которые раздельно детектируют два типа транскриптов Stellate (рис. 8). ПЦР анализ с использованием в качестве матриц плазмид, содержащих эуили гетерохроматиновые копии Stellate или повтор Su (Ste), подтвердил специфичность праймеров (рис. 9А). Чтобы подтвердить локализацию детектируемых копий Stellate в эуили гетерохроматине, был использован подход, основанный на явлении недорепликации гетерохроматиновой ДНК в ядрах клеток слюнных желёз личинок (Abramov et al., 2005). В этих ядрах ДНК эухроматина подвергается множественной политенизации, в то время как ДНК гетерохроматина не реплицируется. Проведён количественный ПЦР в реальном времени с использованием ДНК, выделенной из слюнных желёз или из целых мух, и с праймерами к эуили гетерохроматиновым копиям Stellate или к гену Adh, который находится в эухроматине (маркёр ДНК, подвергающейся политенизации). Для каждой пары праймеров к Stellate рассчитывали соотношение Ste/Adh, а затем делили полученное отношение Ste/Adh в ДНК из слюнных желёз на отношение Ste/Adh в ДНК из целых мух и выражали отношение в процентах (рис. 9Б). Полученное отношение позволяет оценить относительную степень политенизации ДНК, которая амплифицируется данной парой праймеров. Если отношение близко к 100%, то праймеры амплифицируют копии Stellate, которые в слюнных железах подвергаются политенизации в той же степени, как и эухроматиновый ген Adh и, следовательно, лежат в эухроматине. Если отношение значительно ниже 100%, значит копии Stellate недореплицируются и, следовательно, лежат в гетерохроматине. Полученные результаты подтвердили, что праймеры для суммарных и несплайсированных транскриптов гетерохроматиновых Stellate (гет сум и гет неспл, соответственно) детектируют копии, расположенные в гетерохроматине, а праймеры для сплайсированных и несплайсированных транскриптов эухроматиновых Stellate (эу cm и эу неспл, соответственно) детектируют копии, расположенные в эухроматине.

пары принтеров.

гет сум гет неспл ЭУ СПЯ «>' неспл.

п лат II л я с эуSte + + - - + +.

|11Я!>|1||Я 1' 11'l'St' + + - - + +.

плазм ил ?1 с SufSte) + + + - - +.

продукт — — —.

X 2 х х S ц, о.

л с 3 =г п S.

а о а> s.

120 100 80 60 40 20.

пет эу эу гет гет эу эу неспл сум неспл спл неспп сум неспл спл без инсерции S rerSte.

Ste в эухроматине.

Рис. 9. Проверка специфичности пар праймеров, детектирующих эуили гетерохроматиновые копии генов Stellate. А. ПЦР анализ плазм ид, несущих эуили гетерохроматиновые копии генов Stellate или повтор Su (Ste), подтверждает специфичность праймеров для нес планированной (эу неспл, гет неспл) или сплайсированмой/суммарной (эу спл, гет сум) мРНК Stellate. Б. Проверка локализации детектируемых копий Stellate в эуили гетерохроматине. Приведены расчётные значения, полученные в результате деления отношения Stellate/Adh в слюнных железах на это отношение в целых мухах. Этот тест под тверждает, что пары праймеров гет неспл и гет сум или эу неспл и эу спл детектируют копии генов Stellate, расположенные в гетераили эухро матине, соответственно. При использовании линии мух, несущих трансген с шестью повторами гетерохроматиновых генов Stellate в эухроматине хромосомы 3, происходит увеличение расчётных значений для праймеров специфичных к гетерохроматиновым копиям Stellate, что подтверждает обоснованность использования данного теста.

Обнаружено, что как деления повторов Su (Ste), так и мутация auh5″ «приводят к незначительному увеличению количества несплайсированных гран скриптов, в то время как количество с планированных транскриптов сильно возрастает (в 10−50 раз) для обоих типов Stellate (рис. 10).Таким образом.

пос [транскрипционная деградация мРНК является основным механизмом подавления экспрессии генов Stellate. Сходство результатов, полученных для эуи гетерохроматиновых копий Stellate, указывает на то, что положение копий в геноме не влияет на механизм их репрессии, что хорошо согласуется с иосп’ранскрипционным механизмом сайленсинга генов Stellate.

s эу гетеро эу гетеро эу гетеро.

ш эндогенные 6 гетеро Ste эндогенные.

Sie в эухроматине Sfe.

делеция Su (Ste) мутация аиЬ.

Рис. 10. Делеция повторов Su (Ste) или мутация в гене aub вызывает преимущественное увеличение количества сплайсированной, но не несплайсированной мР1 (К Stellate в семенниках дрозофилы. Показано, во сколько раз увеличивается количество сплайсированной (тёмные столбцы) или несплайсированной (светлые столбцы) эухроматиновой (эу) или гетерохроматиновой (гетеро) мРИК Stellate при делеции повторов Su (Ste) (по сравнению с мухами дикого типа) или при мутации в гене auh (мутация — sling-I, сравнивали гомозигот по мутации с гетерозиготами) по данным кОТ-ПЦР.

4.2. piRNA Su (Ste)-зависимая деградация мРНК Stellate может происходить как в цитоплазме, так и в ядрах.

Белки Ago, являющиеся ключевыми компонентами эффекторного комплекса RISC, осуществляющего деградацию мРНК-мишени, обнаруживаются как в цитоплазме, так и в ядрах клеток у различных организмов (Aravin et al., 2008; Brennecke et al., 2007; Guang et al., 2008; Liu et al., 2005bOhrt et al, 2008; Robb et al., 2005; Weinmann et al., 2009). В культуре клеток млекопитающих белок Ago2 транспортируется в ядро, для чего необходим рецептор импорта импортин 8 (Weinmann et al., 2009). При этом, Ago2 является единственным белком подсемейства Ago у млекопитающих, обладающим слайсерной активностью (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). В соответствии с этим в культуре клеток млекопитающих siRNA могут вызывать деградацию РНК-мишеней как в цитоплазме, так и в ядрах (Robb et al., 2005; Zeng and Cullen, 2002). Представляло интерес выяснить, могут ли piRNA Su (Ste) вызывать деградацию мРНК Stellate в ядрах? Для этой цели было решено определить, происходит ли увеличение уровня мРНК Stellate в ядрах сперматоцитов при делеции повторов Su (Ste).

Из лизатов семенников мух с делецией повторов Su (Ste) и мух дикого типа были получены ядерная и цитоплазматическая фракции. Чистота разделения фракций была проверена с помощью Вестерн анализа с антителами против ламина и у-тубулина, которые локализуются в ядре и цитоплазме, соответственно (рис. IIA). Согласно методике фракционирования ядерная фракция не должна содержать ядерных мембран. Чтобы это оценить, был проведён Вестерн анализ с антителами против калнексина, который является трансмембранным белком эндоплазматического ретикулума (рис. ПА). В целом, Вестерн анализ показал, что ядерная фракция практически не загрязнена белками цитоплазмы. Чистота разделения фракций была также проверена с помощью Нозерн анализа с использованием РНК, выделенной из обеих фракций (рис. ПА). Был использован зонд, комплементарный цитоплазматической лизиновой тРНК или митохондриальной метиониновой тРНК. Применимость Нозерн анализа для количественного сравнения уровней тРНК была подтверждена с помощью калибровочного эксперимента, в котором обнаружена линейная корреляция между количеством РНК, взятой для анализа, и интенсивностью сигнала после гибридизации (рис. 11Б). Согласно данным Нозерн анализа степень загрязнения ядерной фракции цитоплазматической РНК не превышала 10%.

Методом кОТ-ПЦР в каждой фракции определяли, во сколько раз увеличивается уровень мРНК Stellate при делеции повторов Su (Ste). Обнаружено, что количество сплайсированных гетерохроматиновых транскриптов Stellate возрастает в цитоплазматической и ядерной фракциях в 37 и 13 раз, соответственно (рис. 11В). Для эухроматиновых Stellate степень дерепрессии в цитоплазматической и ядерной фракциях составляет 36 и 17 раз, соответственно (рис. ИВ). Значительная дерепрессия Stellate в ядерной фракции не может быть объяснена цитоплазматическим загрязнением, поскольку по данным Нозерн анализа загрязнение ядерной фракции цитоплазмой не превышает 10%. Это позволяет заключить, что деградация мРНК Stellate происходит как в цитоплазме, так и в ядрах.

количество тотальной РНК ((jg) 0,4 1 4 8.

дик ни тип.

делецни Su (Ste).

ядра цит ядра цит.

о. s 3 (О 40.

к X, а о.

о а. >. е о о 30.

(С о. X X 20.

ш аз ц.

0) 5 ф ч 10.

? несплайсиронанные транскрипты.

¦ еппайсированные транскрипты.

ядро цит.

ядро цит aySte.

0 2 4 6 8 10 количество тотальной РНК, взятой для Нозерн анализа (рд).

Рис. 11, Деградация мРНК Stellate, вызванная piRNA Su (Ste), происходит как в цитоплазме, так и в ядрах. А. Оценка чистоты ядерной и цитоплазматической фракций. Вверху: Нозерн анализ с зондами, комплементарными митохондриальной метионнновой тРНК (mt tRNA М) и цитоплазм этической лизиновой тРНК (tRNA К). Внизу: Вестерн анализ с антителами против лам и на (ядерный белок), у-тубулина (цитоплазматический белок) и кал не кс и на (траисмембранный белок эндоплазм этического ретикулума). Б. Калибровочный Нозерн анализ (зонд к митохондриальной метиониновой тРНК) демонстрирует, что сигнал, полученный после гибридизации, коррелирует с количеством РНК, взятым для анализа. Этот эксперимент показывает, что Нозерн анализ может быть использован для количественного сравнения уровней тРНК и piRNA Su (Ste) в ядерной и цитоплазматической фракциях. В. Делеция повторов Su (Ste) приводит к возрастанию количества сплайсированных эухроматиновых (эу) и гетерохроматиновых (гетеро) транскриптов Stellate как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях, выделенных из семенников дрозофилы.

4.3. Белок Aub и piRNA Su (Ste) присутствуют как в ядрах, так и в цитоплазме сперматоцитов.

Деградацию мРНК Stellate осуществляет эффекторный комплекс, содержащий piRNA Su (Ste) и белок Aub. Учитывая, что деградация траискриптов Stellate происходит как в цитоплазме, так и ядрах ожидалось обнаружить Su (Ste) piRNA и белок Aub в обоих компартментах. В соответствии с этим предположением piRNA Su (Ste) были детектированы с помощью Нозерн анализа как в ядерной, так и в цитоплазматичсской фракциях (рис. 12А). В качестве зондов использовали рибопробу, детектирующую сумму Su (Ste) piRNA, или олигонуклеотидный зонд комплементарный Su (Ste)-4 piRNA, которая является наиболее представленной среди piRNA, иммунопреципитирующихся с белком Aub (Nishida et al., 2007). В ядре Su (Ste) piRNA только в 2 раза менее представлены, чем в цитоплазме (рис. 12Б), что исключает возможность объяснить присутствие piRNA в ядрах цитоплазматической контаминацией, которая не превышает 10%. Результаты Вестерн анализа указывают на присутствие белка Aub в ядерной и цитоплазматической фракциях, причём примерно в равных концентрациях (рис. 12А). Поскольку общее количество белка, выделенное из ядер сперматоцитов, было примерно в 10 раз меньше, чем количество белка, выделенное из цитоплазмы, можно заключить, что примерно 1/10 часть от общего количества белка Aub находится в ядрах сперматоцитов, а 9/10 в цитоплазме.

ли км и тип.

деления Su (Ste).

ядра ииг tupa циг.

сумма piRNAs SufSte).

Su (Sie)-4 piRNA.

34 нг 25 ht.

14 ht.14 ht.

1%? -fr W >5.

6- g 70 «g.

g i 5S 50 К ?3 ffi n> q 40 с.

О =r в о.

ai га а. о.

? mttRNA M ¦ Su (Ste) piRNA.

дикий делоция тип Su (Ste).

Рис. 12. piRNA Su (Ste) и белок Aub обнаруживаются как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях. А. Распределение белка Aub и piRNA SufSte) между ядерной и цитоплазмати чес кой фракциями. Вверху: Нозерн анализ с РНК зондом, комплементарным сумме piRNA SufSte). В середине: Нозерн анализ с ДНК олигонуклеотидом, комплементарным уникальной SufSte)-4 piRNA. Внизу: Вестерн анализ с антителами против белка Aub. Б. Содержание митохондриальной меч ион я новой тРНК и SufSte) piRNA (количественный расчёт сигналов из рис. ПА и 12А) в ядерной фракции в сравнении с цитоплазматической фракцией.

С помощью иммуноокрашивания была изучена локализация белка Aub в семенниках (рис. 13А). Основной сигнал от Aub (показан красным) обнаруживается в районе ядерной оболочки и напоминает так называемый nuage, являющийся распространённой перинуклеарной структурой, обнаруживаемой вокруг ядер терминальных клеток многих организмов {Eddy, 1975). При более подробном рассмотрении видно, что «кольцеобразный» сигнал состоит из диффузного н гранулярного компонентов. Отсутствие сигнала в семенниках мутантных по Aub мух подтверждает специфичность иммуноокрашивания (рис. 13А). В качестве маркёра границы ядра использовали ламин В (показан зелёным), который является ядерным белком, связанным с внутренней ядерной мембраной. Обнаружена колокализация Aub и ламина В (рис. 13А). Это указывает на локализацию части белка Aub в ядрах, что согласуется с данными фракционирования.

Для дополнительного изучения локализации Aub было проведено иммуноокрашивание препаратов выделенных ядер сперматоцитов (рис. 13Ь). Aub.

детектировали преимущественно в виде гранул, которые колокализуются с ламином В. Интенсивность сигнала от Aub была значительно слабее, чем в семенниках, что согласуется с оценками результатов фракционирования, согласно которым количество белка Aub в ядрах сперматоцитов может быть примерно на порядок меньше, чем в цитоплазме. Результаты фракционирования, кОТ-ГТЦР и иммуноокрашивания указывают на то, что небольшая часть комплексов piRNA-Aub находится в ядрах сперматоцитов вблизи внутренней мембраны, где может вызывать деградацию мРНК Stellate.

л анти-Aub анти-ламин В наложение.

дикий тип.

анти-Aub анти-ламин В наложение.

Рис. 13. Иммуноокрашивание семенников и выделенных ядер с антителами к АиЬ. А. Локализация белка АиЬ в семенниках. Проведено иммуноокрашивание семенников с антителами против АиЬ (показано красным) и ламина (показано зелёным), который является ядерным белком. Колокализация АиЬ и ламина В даёт жёлтый сигнал, возникающий при наложении красного и зелёного сигналов. Специфический сигнал от белка АиЬ был выявлен путём сравнения иммуноокрашиваний семенников мух дикого типа с семенниками мух с мутацией в гене ииЪ (использованы трансгетерозиготы аиЬИЬ!/аиЬ&'43, обозначенные -/-). Шкала — 10 (ил. Б. Локализация АиЬ в выделенных ядрах. Ядерная фракция была окрашена с антителами против АиЬ и ламина. Сигналы от АиЬ (в виде точек) колокализуются с ламином.

4.4. Изучение регуляции экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ.

Помимо piRNA, к основным классам коротких РНК животных относят siRNA и miRNA (см. обзор литературы). Механизмы регуляции экспрессии мишеней с помощью siRNA и miRNA изучены гораздо лучше, чем механизмы регуляции экспрессии с помощью piRNA. Представлялось интересным сравнить механизмы репрессии одной и той же мишени с помощью piRNA и siRNA. В качестве мишени были выбраны репортёрные конструкции Ste-lacZ, несущие часть гена Stellate слитую с репортёрным геном lacZ, кодирующим р-галактозидазу.

4.4.1 piRNA Su (Ste) вызывают непропорционально низкое изменение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с уровнем р-галактозидазы.

С помощью полуколичественного ОТ-ПЦР и метода количественной оценки активности Р-галактозидазы в семенниках изучали регуляцию экспрессии трансгенных репортёров Ste703-lacZ (предоставлена А. Тулиным) и Stel34-lacZ (Aravin et al., 2001) (рис. 14). Для проверки линейной корреляции между количеством материала, взятого-для анализа, и интенсивностью сигнала в пОТ-ПЦР и в определении активности Р-галактозидазы, брали 2-х кратные количества кДНК или лизата семенников, соответственно. Обнаружено, что при делеции повторов Su (Ste) количество мРНК Ste-lacZ увеличивается в 1,5 раза, а уровень Р-галактозидазы в 4−7 раз (рис. 15А, Б). Незначительное увеличение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с изменением уровня Р-галактозидазы указывает на то, что подавление транскрипции не играет важной роли в репрессии конструкций, что согласуется с данными, полученными для эндогенных Stellate (рис. 10). Кроме того, для эндогенных генов Stellate также обнаружено, что делеция повторов Su (Ste) приводит к непропорциональному увеличению количества белка по сравнению с уровнем мРНК (возрастание количества белка Stellate более чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009), что заметно превышает увеличение уровня мРНК Stellate (30−50 раз, рис. 10)). Обнаружение сходных эффектов piRNA Su (Ste) на экспрессию трансгенных конструкций Ste-lacZ и эндогенных Stellate позволяет экстраполировать результаты, полученные при изучении конструкций, на эндогенные гены. Более слабая степень дерепрессии конструкций Ste-lacZ по сравнению с эндогенными Stellate может быть объяснена тем, что репортёрные конструкции не содержат большей части последовательности Stellate и.

Ст 11 |)T.

i pa iiCKpiuiuHii.

Рспортёрные конструкции в геноме D.melanogaster.

Ste 703-lacZ Stel34-lacZ.

Репортёрные конструкции, которые в составе плазм ид трансфецвровались в культуру клеток S2 D.melanogaster.

hsp70-Ste-lacZ [.

hsp 70-lacZ.

niiPHK-Slft' или Su (StL') диРНК lucZ.

hsp 70 Г* lacZ.

1 —-И йшМ L.

дцРН К lacZ.

дцРНК GFP.

Рис. 14. Репортёрные конструкции Ste-lacZ. Репортёрные конструкции Ste703-lacZ и Steli4-lacZ содержат интактный промотор Stellate или 101 нуклеотид промотора Stellate и 141 или 33 нуклеотида транскрибируемой последовательности Stellate, соответственно, слитые с репортёрным геном lacZ. Ген lacZ показан не и масштабе (его длина составляет 3308 нт.). Конструкция hsp70-Ste-lacZ содержит после hsp70 промотора первые 585 нт. транскрибируемой последовательности Stellate. Конструкции hsplO-lacZ и hsp70-GFP содержат промотор hsp70 и гены lacZ и GFP. соответственно. Двойной линией обозначены гомологичные двухцепочечные РНК, используемые для когрансфеции вместе с репортёрными конструкциями в культуру клеток S2 D.melanogaster.

Ste703-lacZ.

Stel34-lacZ.

дикий делеция тип Su (Ste).

? мРНК Ste-lacZ.

¦ активность ß—галактозидазы.

Рис. 15. Экспрессия траисгенной репортёрной конструкции Ste-lacZ в семенниках при делеции повторов Би (51е). А. Окрашивание на активность Р-галактоз ид азы семенников мух, несущих трансгенные ренортёрные конструкции Ste703-lacZ или Лс 134−1ас2. Б. Возрастание уровня мРНК $ 1е-1ас2 (светлые столбцы) и активиосги Р-галактозидазы (тёмные столбцы) в семенниках мух при делеции повторов 8и ($ 1е).

комплементарные этой последовательности 8и (3(е) не участвуют в.

репрессии Ste-lacZ.

4.4.2 siRNA вызывают непропорционально низкое изменение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с уровнем ß—галактозидазы в культуре клеток Drosophila.

Для изучения механизма репрессии конструкции Ste-lacZ с помощью siRNA культуру клеток S2 дрозофилы трансфецировали плазмидой, несущей конструкцию hsp70-Ste-lacZ, и дцРНК, которая в результате процессинга нарезается с образованием siRNA. КотрансфекЦйЯ гомологичной дцРНК (Su (Ste), Sie или lacZ) вела к 7−10 кратному уменьшению активности ß—галакгозидазы (по сравнению с котралсфекцией, в которой использовалась негомологичная дцРНК GFP), но лишь к 1,5−2 кратному уменьшению количества мРНК Ste-lacZ (рис. 16А). Таким образом, siRNA в культуре клеток, также как и piRNA в семенниках.

вызывают непропорционально низкое изменение уровня мРНК Ste-lacZ, Репрессия конструкции Ste-lacZ была одинакова при использовании полностью гомологичных дцРНК Sie и lacZ или гомологичной на 90% дцРНК Su (Ste), что указывает на то, что отсутствие гомологии на 10% между короткой РНК и мишенью не является причиной непропорционально низкого изменения уровня мРНК.

Согласно литературным данным, siRNA вызывают более сильную деградацию гомологичной мРНК, чем была обнаружена в случае мРНК Ste-lacZ (1,5−2 раза) (Ghildiyal and Zamore, 2009). Чтобы оценить эффективность siRNA-инициированной деградации в используемых экспериментальных условиях, провели нокдаун экспрессии плазмиды hsp70-GFP с помощью дцРНК GFP vi обнаружили уменьшение уровня мРНК GFP в 10 раз (рис. 16Б). Таким образом, 90% мРНК GFP деградирует в ответ на дцРНК GFP, тогда как в случае мРНК Ste-lacZ лишь 20−40% транскриптов подвергаются деградации. Было предположено, что 60−80% транскриптов Ste-lacZ защищены от деградации с помощью неизвестного механизма. Чтобы оценить, ответственна ли за защиту мРНК Ste-lacZ от деградации последовательность Stellate, был проведён нокдаун плазмиды hsp70-lacZ, не содержащей последовательности Stellate, с помощью дцРНК lacZ. Обнаружено уменьшение уровня мРНК lacZ в 5 раз (рис. 16В), что значительно сильнее эффекта дцРНК lacZ на количество мРНК Ste-lacZ (уменьшение в среднем в 1,3 раза). Таким образом, последовательность Stellate снижает эффективность siRNA-зависимой деградации мРНК Ste-lacZ.

о о, а >.

? мРНК 51е-1асг ¦ активность [1-галактозидазы.

вРР Эи^е) Ste.

Л X Ф ш о.

0=Р Би^е) дцРНК.

X н л: го.

? мРНК 1асг.

¦ активность р-галактозидазы 100.

ьс X О. ?

? 40 ¡-й го С.

Рис. 16. 51Я]^А-зависимая репрессия репортёриой конструкции $, 1е-1ас2 в кульгуре клеток 52. А. Уровень мРНК 51е-1ас2. измеренной с помощью пОТ-ПЦР, (светлые столбцы) и активность р-галактоз ид азы (тёмные столбцы) при котрансфекции плазмнды }щ)70−8(е-1ас2 и одной из дцРМК: СРР (нет гомологии с мРНК Б1е-1ас2. используется как отрицательный контроль, принят за 100%), Бифе), Я/е или 1ас2. При нарезании дцРНК образуются которые, как видно ИЗ Ь и В, вызывают эффективную деградацию.

комплементарной мРНК. Б. Уровень мРНК ОГР при котрансфекции плазмиды ИзрУО-ОРР и дцРНК ОГР или Зи (8(е). В. Уровень мРНК ¡-ас2 (светлые столбцы) н активность р-галактозидазы (тёмные столбцы) при котраисфскции плазмиды Ь$р70−1ас2 и дцРНК СРР или дцРНК 1ас2.

Можно предположить, что неизвестный «маскирующий» белковый комплекс связывает определённый мотив в последовательности Sie в транскриптах Ste-lacZ и тем самым защищает их от деградации, вызванной siRNA. и подавляет их трансляцию. В то же время, некоторое количество молекул мРНК Ste-lacZ транслируется и может подвергаться siRNA-зависимой деградации (рис. 17). Таким образом, согласно данной модели причина непропорциональности в изменениях количеств транскриптов и белка заключается в том, что siRNA взаимодействуют лишь с транслирующимися транскриптами.

Схожесть результатов, полученных при исследовании piRNAи siRNA-зависимой репрессий конструкции Ste-lacZ, позволяет предположить, что и в семенниках только немаскированная фракция тотальной цитоплазматической мРНК Ste-lacZ и Stellate подвергается piRNA-зависимой деградации и трансляции.

деградация.

немаеккрованнан мРНК Ste-lacZ.

маскированная мРНК Ste-lacZ.

трансляция.

Рис, 17. Гипотеза, объясняющая, почему в ответ на ptRNA и siRNA уровень мРНК Ste-lacZ изменяется непропорционально низко по сравнению с уровнем ß—галактозидазы. Эффекторный комплекс RISC направлен на деградацию транслирующихся транскриптов Ste-lacZ. Другие транскрипты Ste-lacZ связаны неизвестным репрессорным белком (ами), который ингибирует трансляцию этих транскриптов и защищает от RISC-зависимой деградации.

Существуют альтернат"вные гипотезы, которые могли бы объяснить полученные результаты, однако они хуже согласуются с данными экспериментов. Во-первых, можно было бы предположить, что piRNA и siRNA подавляют.

трансляцию мРНК Ste-lacZ. Доводы о малой вероятности такой альтернативы приведены в разделе обсуждение результатов. Во-вторых, часть транскриптов Ste-lacZ могла бы избегать деградации из-за того, что находится в ядре. Однако, эта гипотеза плохо согласуется с данными о piRNA-зависимой деградации эндогенных транскрилтов Stellate в ядрах (см. раздел 4.2.). Кроме того, если эта гипотеза верна, то в цитоплазме должна обнаруживаться дерепрессия мРНК Ste-lacZ пропорциональная дерепрессии уровня р-галактоз идазы. Напротив, в выделенной из семенников ц и то плазматической фракции делеция повторов Su (Ste) вызывает такое же непропорционально низкое увеличение уровня мРНК Ste-lacZ, как и при анализе с использованием целых семенников (рис, 18), что делает данную гипотезу маловероятной.

? мРНК Ste-lacZ.

¦ активность Д-галактозидазы.

N «Л.

" л о 4.

Ste703-lacZ.

Рис. 18. Увеличение количества мРНК регюртёрной конструкции 3! е703−1ас2 и р-галактозидазы в цитоплазматической фракции семенников при делении повторов 5и ($ 1е).

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Посттранскрипционная репрессия генов Stellate.

Методом количественного ОТ-ПЦР показано, что делеция повторов Su (Ste) или мутация в гене aub, кодирующем piRNA? ы (57е,)-связывающий белок Aub, приводят к значительному увеличению количества сплайсированной, но не несплайсированной мРНК Stellate. Это указывает на то, что piRNA Su (Ste) преимущественно вызывают деградацию сплайсированной мРНК Stellate, а не репрессию транскрипции. Данный эффект обнаружен для генов Stellate, расположенных как в эу-, так и в гегерохроматине, что указывает на отсутствие влияния структуры хроматина на механизм репрессии и согласуется с представлениями о посттранскрипционной регуляции.

Система Ste/Su (Ste) уникальна для D. melanogaster, поскольку у других видов рода Drosophila соответствующих генов нет (Usakin et al., 2005). Амплификация повторяющихся генов Stellate и гомологичных повторов Su (Ste) в ходе эволюции вида melanogaster приводила к увеличению количества белка Stellate в сперматоцитах, что, по-видимому, нарушало процессы гаметогенеза. Вероятно, система РНКи, участвующая в репрессии повторяющихся мобильных элементов в семенниках (Kalmykova et al., 2005), была в ходе эволюции адаптирована для репрессии генов Stellate. Повторы Su (Ste) приняли на себя функцию по кодированию антисмысловых piRNA. Для репрессии были использованы белки Aub и Ago3, которые экспрессируются в сперматоцитах (Gunawardane et al., 2007; Li et al., 2009; Nishida et al., 2007). Наиболее простое объяснение посттранскрипционного механизма репрессии генов Stellate может заключаться в том, что это единственный способ сайленсинга, который могут осуществлять белки Aub и Ago3.

Альтернативной причиной выбора механизма посттранскрипционной репрессии может быть необходимость высокого уровня репрессии генов Stellate. Возможно, подавление транскрипции не могло бы обеспечить необходимый уровень репрессии генов Stellate, поскольку, при этом механизме, эффекторный комплекс обнаруживает локус-мишень за счёт связывания с РНК, которая транскрибируется этим локусом (Moazed, 2009). Вследствие этого, такая репрессия требует частичной транскрипции подавляемого локуса и, вероятно, множественность повторов Stellate приводит к тому, что такая транскрипция.

давала бы слишком высокий уровень мРНК Stellate. Посттранскрипдионная деградация мРНК Stellate обеспечивает очень сильную репрессию белка Stellate (согласно Вестерн анализу, проведённому JI.B. Олениной в нашей лаборатории, при делеции повторов Su (Ste) уровень белка Stellate возрастает более чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009)), что может быть необходимо для нормального функционирования терминальных тканей самцов.

5.2. Деградация транскриптов Stellate в ядрах.

Показано, что при делеции повторов Su (Ste) количество сплайсированных транскриптов Stellate возрастает как в цитоплазматической, так и в ядерной фракциях, выделенных из семенников. В ядерной фракции уровень транскриптов гетерои эухроматиновых генов Stellate в среднем увеличивается в 15 раз, что лишь в 2−2,5 раза меньше, чем в цитоплазме. Такая заметная дерепрессия в ядерной фракции не может возникать в результате загрязнения цитоплазмой, поскольку с помощью Вестерн анализа с антителами к у-тубулину (белок цитоплазмы) и калнексину (трансмембранный белок ЭПР) а также Нозерн анализа с зондом к митохондриальной метиониновой тРНК показано, что ядерная фракция практически не содержит цитоплазматических белков и РНК (степень загрязнения по РНК не превышает 10%). Следовательно, деградация мРНК Stellate с помощью piRNA Su (Ste) происходит в ядрах сперматоцитов. Большая степень дерепрессии Stellate в цитоплазматической фракции указывает на то, что там также происходят процессы деградации мРНК Stellate. Таким образом, в данной работе впервые была показана способность piRNA вызывать деградацию мишеней в ядерном компаргменте клетки.

К настоящему моменту, локализация процесса РНКи-зависимой деградации РНК-мишени изучена недостаточно. Считается, что основная часть инициированного siRNA или miRNA посгтранскрипционного сайленсинга происходит в цитоплазме (Carthew and Sontheimer, 2009). Этот вывод основывается на нескольких наблюдениях. Во-первых, по данным иммуноокрашивания большая часть белков подсемейства Ago в клетках дрозофилы и млекопитающих локализуется в цитоплазме (Parker and Sheth, 2007). Во-вторых, в составе siRISC находят белки, взаимодействующие с рибосомой (Ishizuka et al., 2002). В-третьих, miRNA-зависимая репрессия трансляции направлена на транслирующиеся мРНК цитоплазмы (Carthew and Sontheimer,.

2009). Однако, белки подсемейства Ago находят и в ядрах (Ohrt et al., 2008; Robb et al., 2005). Показано, что в культуре клеток человека импортин 8 необходим для транспорта белка Ago2 в ядра (Weinmann et al., 2009). Тот факт, что клетка использует специальный аппарат для транспорта Ago2 в ядра указывает на важную роль этого белка в ядерном компартменте. Эта роль может заключаться как в подавлении транскрипции (Janowski et al., 2006), так и в деградации мРНК-мишеней в ядре (Robb et al., 2005). Обнаруженная в данной работе деградация мРНК Stellate в ядрах и цитоплазме сперматоцитов указывает на сходство механизмов piRNAи siRNA-зависимой репрессии, осуществляющих деградацию мРНК-мишеней как в цитоплазматическом, так и в ядерном компартментах.

5.3. Локализация белка Aub в сперматоцитах.

Белок Aub, связывающий piRNA Su (Ste), а также сами piRNA Su (Ste) обнаружены как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях лизатов семенников. Иммуноокрашивание с антителами к Aub показало его наличие в выделенных ядрах, а также в цитоплазме сперматоцитов вблизи ядерной мембраны. Границу ядра выявляли с помощью иммуноокрашивания с антителами к ламину В, который является ядерным белком, ассоциированным с внутренней ядерной мембраной. Сигналы от Aub и ламина В частично перекрываются, указывая на присутствие Aub в ядрах вблизи внутренней ядерной мембраны. Каких-либо других локусов внутриядерной локализации Aub не детектировано. Таким образом, обнаружение белка Aub в ядрах сперматоцитов согласуется с данными о деградации мРНК Stellate в ядрах.

Локализация Aub в семенниках, обнаруженная в данной работе, напоминает опубликованную ранее (Snee and Macdonald, 2004). Однако в работе Snee с соавторами не использовался маркёр, показывающий границу ядерной мембраны, что не позволило установить наличие Aub в ядрах.

В яичниках дрозофилы значительная часть белка Aub локализуется в перинуклеарной структуре nuage (см. обзор литературы). Nuage представляет собой электронноплотную структуру, видимую в световой или электронный микроскопы вокруг ядер терминальных клеток многих животных. По мере изучения РНКи, процессы piRNA-зависимого сайленсинга стали связывать с nuage, поскольку с этой структурой колокализуется ряд белков, необходимых для функционирования piRNA. Белок Vasa, являющийся компонентом nua^e,.

обнаруживается в ядрах питающих клеток яйцевой камеры (Findley et al., 2003). Другой компонент nuage в яичниках, белок Maelstrom, функционирует как шатл, перемещающийся между nuage и ядром питающей клетки (Findley et al., 2003). Таким образом, присутствие в ядрах характерно, по крайней мере, для некоторых компонентов nuage, и обнаруженная локализация белка Aub в ядрах сперматоцитов не является уникальной. Возможно, использование маркёров, показывающих расположение ядерной мембраны, позволит обнаружить и другие компоненты nuage на внутренней поверхности ядер.

Вероятная причина локализации в ядрах сперматоцитов белка Aub и связанных с ним piRNA Su (Ste) заключается в недостаточной эффективности деградации мРНК Stellate в цитоплазме и, следовательно, необходимости дополнительной деградации этой мРНК в ядрах. Однако, молено предположить и альтернативное объяснение. Возможно, причиной локализации белка Aub в ядрах является то, что только в этом компартменте может происходить образование piRNA Su (Ste) (что сопровождается одновременной загрузкой этих коротких РНК в белок Aub). Это приводит к появлению в ядрах репрессорного комплекса Aub/piRNA Su (Ste), который вызывает деградацию ядерной мРНК Stellate. То есть, деградация мРНК Stellate в ядрах может быть сопутствующим процессом, который не вносит существенного вклада в общую репрессию Stellate'. Действительно, антисмысловые транскрипты Su (Ste), являющиеся предшественниками piRNA, обнаруживаются только в ядрах сперматоцитов (Aravin et al. 2004). Антисмысловые транскрипты Su (Ste) нё подвергаются сплайсингу и полиаденилированию, т. е. процессам, которые увеличивают эффективность экспорта транскриптов из ядра. Поэтому транспорт антисмысловых транскриптов Su (Ste) из ядер может быть затруднён. Исходя из этого можно предположить, что нарезание антисмысловой РНК SufStej происходит непосредственно в ядрах сперматоцитов. В дальнейших исследованиях необходимо определить локализацию процесса биогенеза piRNA Su (Ste).

5.4. Избирательность деградации, направляемой piRNA Su (Ste).

Количество мРНК репортёрной конструкции Ste-lacZ в ответ на гомологичные piRNA или siRNA уменьшается значительно слабее,.чем количество кодируемой этой конструкцией р-галактозидазы. В культуре клеток,.

где показана эффективная деградация мРНК lacZ в ответ на siRNA, не происходит столь же эффективной деградации мРНК Ste-lacZ, что указывает на то, что последовательность Stellate защищает мРНК от деградации. Схожесть результатов, полученных при изучении репрессии репортёрных конструкций Ste-lacZ с помощью piRNA и siRNA, позволяет предположить, что оба типа коротких РНК подавляют экспрессию конструкций по единому механизму. Предполагается, что деградация направлена лишь на транслирующиеся транскрипты Ste-lacZ и существует пул защищенных от деградации, нетранслирующихся транскриптов Ste-lacZ («маскированные транскрипты»), что объясняет причину непропорционально низкого изменения уровня мРНК по сравнению с белком (рис. 19).

Существуют две дополнительные интерпретации полученных данных. Можно было бы предположить, что отсутствие значительного изменения уровня мРНК Ste-lacZ, объясняется тем, что piRNA и siRNA могут подавлять трансляцию этой мРНК. Однако, «трансляционная» гипотеза хуже согласуется с данными литературы. Во-первых, способность piRNA подавлять трансляцию к настоящему моменту не была показана, но многие эксперименты свидетельствуют о том, что белки подсемейства Piwi, связывающие piRNA, могут вызывать деградацию мРНК-мишени (Gunawardane et al., 2007; Nishida et al., 2007; Saito et al., 2006). Во-вторых, в культуре клеток эксперимент был проведён таким образом, чтобы siRNA вызывали только деградацию мРНК-мишени, поскольку для репрессии была использована дцРНК, полностью (100%) комплементарная мРНК Ste-lacZ (дцРНК Ste и lacZ) (Forstemann et al., 2007; Tomari et al., 2007).

Вторая альтернативная гипотеза заключается в том, что часть транскриптов Ste-lacZ задерживается в ядре и таким способом избегает деградации с помощью piRNA или siRNA. Однако, нами показано, что в ядрах сперматоцитов piRNA Su (Ste) могут вызывать деградацию мРНК Stellate. Кроме того, эта гипотеза предполагает, что в цитоплазме сперматоцитов при делеции повторов Su (Ste) уровень дерепрессии мРНК Ste-lacZ будет пропорционален степени дерепрессии Р-галактозидазы. Однако, в выделенной из семенников цитоплазме обнаружена такая же непропорционально низкая дерепрессия мРНК Ste-lacZ, как и при использовании целых семенников. В целом, приведённые выше данные указывают на предпочтительность для объяснения результатов гипотезы о маскировании, хотя детали этого процесса и, в частности, белок (ки), участвующие в маскировании мРНК Ste-lacZ, ещё предстоит выявить.

Обнаруженные особенности механизма регуляции репортёрных конструкций Ste-lacZ показаны и для эндогенных Stellate. При делеции повторов Su (Ste) количество мРНК Stellate возрастает в 30−50 раз (рис. 10), а количество белка Stellate более, чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009). Более слабый эффект делеции повторов Su (Ste) на экспрессию конструкций Ste-lacZ по сравнению с эндогенными Stellate может быть объяснён меньшей длиной последовательности Stellate в мРНК Ste-lacZ. Это сужает спектр эффекторных комплексов Aub/piRNA Sn (Ste), участвующих в репрессии. Таким образом, гипотеза о маскировании может быть распространена и на эндогенные Stellate. Согласно этой гипотезе, экспрессия эндогенных Stellate и репортёрных конструкций Ste-lacZ подавляется не только с помощью piRNA Su (Ste) -з ави с и м о й деградации мРНК в ядре и цитоплазме, но и с помощью неизвестного белка (ов), ингибирующего трансляцию (рис. 19).

По-видимому, среди смысловых транскриптов Sa (Ste) доля транслирующихся мРНК меньше, чем среди мРНК Stellate. Это может быть объяснено тем, что нуклеотидные замены в мРНК Sn (Ste), отличающие эту мРНК от Stellate, приводят к возникновению сайтов альтернативного сплайсинга и преждевременным стоп кодонам (Balakireva et al., 1992). В соответствии с этим, количество смысловых транскриптов Su (Ste) при мутации в гене аиЪ увеличивается в 5 раз слабее, чем количество мРНК Stellate, несмотря на то, что piRNA Su (Ste) имеют более высокую степень комплементарности с мРНК Su (Ste) (Vagin et al., 2006). Вероятно, piRNA Sn (Ste) преимущественно вызывают деградацию более активно транслирующейся мРНК Stellate.

Предполагаемые свойства piRNA-зависимого сайлеисинга генов Stellate могут быть распространены и на репрессию мобильных элементов. Показано, что в семеиниках дрозофилы мутация в гене piwi приводит к существенному увеличению скорости транспозиций ретротраиспозона mdgl при незначительном увеличении количества мРНК mdgl (Kalmykova et al., 2005). Вероятно, piRNA вызывают преимущественную деградацию трансляционно активной мРНК транспозонов.

п о с ле до ва т е л ь-ность.

гомологичная Stellate.

транспозон hoppel.

повторы St/fSfe).

антисмысловои транскрипт Su (Ste).

цитоплазма.

гены Stellate.

мРНК Stellate.

Рис. 19. Предполагаемый механизм посггранскрипционпой репрессии генов Stellate с помощью повторов Su (Ste). Транскрипция повторов Su (Ste), иниииируемая промотором транспозона hoppel, приводит к образованию антисмысловых транскриптов Su (St е), которые нарезаются в ядре или в цитоплазме (в данный момент это неизвестно) с образованием piRNA Su (Ste). Белок Aub связывает piRNA Su (Ste) и вызывает деградацию мРНК Stellate в ядре (1) или в цитоплазме (2), Предполагается, что неизвестный репрессорный белок (ки) связывает остальные транскрипты Stellate, подавляя их трансляцию и защищая от деградации, вызываемой комплексом Aub/piRNA Su (Ste) (3).

Зависимость Su (Ste) piRNA-инициированной деградации мРНК Ste-lacZ и Stellate от регуляторных (в данном случае маскирующих) белков, связанных с этими мРНК, хорошо согласуется с существующими представлениями о механизмах репрессии с помощью siRNA и miRNA. В яичниках дрозофилы трансляционно неактивные маскированные мРНК не подвергаются siRNA-зависимой деградации, а после снятия трансляционного блока начинают деградировать (Kennerdell et al., 2002). В терминальных тканях D. reriu белок Dndl связывается с мРНК гена nanosJ вблизи сайтов отжига miR-430, что не позволяет этой miRNA осуществить репрессию (Kedde et al., 2007; Mishima et al. 2006). По-видимому, процессы сайленсинга с помощью коротких РНК, как и другие основные пути регуляции экспрессии, сами подвергаются активной регуляции и, таким образом, встраиваются в состав единой регуляторной сети, определяющей жизнедеятельность клетки.

5.5. Оценка вкладов Su (Ste) piRNA-зависимой деградации и трансляционной репрессии в подавление экспрессии генов Stellate.

Для создания цельной картины репрессии генов Stellate важно сравнить вклады Su (Ste) piRNA-зависимой деградации и трансляционной репрессии в общий сайленсинг. Обозначим количество транслируемой мРНК Stellate в семенниках мух дикого типа за X, а количество нетранслируемой РНК за Y. При делеции повторов Su (Ste) количество белка Stellate увеличилось более чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009) и, если считать, что эффективность трансляции не изменилась, то количество транслируемой мРНК Stellate будет 200Х. Примем также допущение, что количество нетранслируемой мРНК Stellate не изменилось и осталось Y. Общее количество мРНК Stellate при делеции повторов Su (Ste) увеличилось в 42 раза (в среднем для эуи гетерохроматиновых копий). В результате получаем уравнение:

(X+Y)*42=200X+Y.

42X+42Y=200X+Y.

Получается, что в семенниках дикого типа нетранслируемой мРНК Stellate в 3,9 раза больше, чем транслируемой. При отсутствии Su (Ste) piRNA-зависимой репрессии количество нетранслируемой мРНК меньше, чем транслируемой в 51 раз (200/3,9). Таким образом, репрессия трансляции не может компенсировать Su (Ste) piRNA-зависимую репрессию. Если нарушить трансляционную репрессию, то, согласно расчётам, значительного увеличения количества белка Stellate не произойдёт. Таким образом, Su (Ste) piRNA вносят гораздо больший вклад в репрессию генов Stellate, чем предполагаемый механизм трансляционной репрессии.

Подобный расчёт был проведён и для репортёрных конструкций Ste-lacZ (использованы средние значения дерепрессии по мРНК и ß—галактозидазе для конструкций Ste703-lacZ и Stel34-lacZ).

(X+Y)*1,24=5,57X+Y 1,24X+1,24 Y=5,57X+Y 0,24Y=4,33X Y=18X.

Вклад трансляционной репрессии в сайленсинг репортёрных конструкций Ste-lacZ больше, чем вклад Su (Ste) piRNA-зависимой репрессии, что, по-видимому, объясняется меньшей длиной последовательности Stellate в конструкции.

Приведённые расчёты могут быть использованы лишь для грубой оценки, поскольку основываются на ряде допущений, однако они позволяют предположить этапы возникновения системы репрессии генов Stellate в эволюции D.melanogaster. Вероятно, на первом этапе усиливающаяся в ходе эволюции экспрессия генов Stellate подавлялась за счёт репрессии трансляции. Был использован повсеместно экспрессирующийся репрессорный белок (ки), поскольку трансляционная репрессия конструкции Ste-lacZ происходит и в культуре клеток S2, полученной на основе эмбриональных стволовых клеток дрозофилы. На. втором этапе, когда экспрессия генов Stellate возросла так сильно, что не могла быть подавлена за счёт трансляционной репрессии, для сайленсинга была приспособлена семенникспецифичная система РНКи, которая изначально * использовалась для репрессии мобильных элементов. Ключевым событием стала появившаяся способность антисмысловой РНК повторов Su (Ste) нарезаться в результате первичного процессинга с образованием piRNA. Вероятно, этому способствовало то, что транскрипция антисмысловой РНК Su (Ste) инициируется с промотора транспозона hoppel, который репрессируется с помощью piRNA в семенниках (Aravin et al., 2003). Таким образом, репрессия трансляции не играет существенной роли в сайленсинге генов Stellate, однако она могла вносить важный вклад в сайленсинг Stellate на более ранних этапах эволюции D. melanogaster.

6. выводы.

Изучены особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su (Ste) у Drosophila melanogaster.

1) Делеция повторов Su (Ste) или мутация в гене аыЬ приводят к значительному накоплению сплайсированных, но не несплайсированных транскриптов эуи гетерохроматиновых копий генов Stellate в семенниках. Полученные данные показывают, что piRNA Su (Ste) преимущественно вызывают деградацию мРНК Stellate.

2) Накопление сплайсированных транскриптов Stellate, вызванное делецией повторов Su (Ste), происходит не только в цитоплазматической, но и в ядерной фракциях, выделенных из семенников. Следовательно деградация транскриптов Stellate может происходить как в цитоплазме, так и в ядрах семенников Drosophila melanogaster.

3) Подавление экспрессии репортёриой конструкции Ste-lacZ как с помощью piRNA в семенниках, так и с помощью siRNA в культуре клеток сопровождается непропорционально сильным снижением активности (3-галактозидазы, но сравнению со снижением уровня мРНК Ste-lacZ.

4) В культуре клеток siRNA вызывают значительное падение уровня мРНК lacZ и существенно меньшее уменьшение количества мРНК Ste-lacZ, что указывает на роль последовательности Stellate в защите мРНК от деградации, направляемой siRNA. Предполагается, что существует пул нетранслирующихся транскриптов Ste-lacZ, который оказывается защищенным от деградации, вызванной как piRNA, так и siRNA.