Исследование крови. 
Применение прогестагенов и их сочетаний при гипофункции яичников у коров-первотелок

Пробы крови для исследований у коров брали путем пункции из яремной вены. Концентрацию гормонов в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для получения сыворотки, в центрифужную пробирку брали 1 мл крови, прогревали кровь 1 час при температуре 37 °C, для образования сгустка, полученную сыворотку центрифугировали в течение 10 мин при 1500−3000 об/мин. Сыворотку крови получали в лаборатории эндокринологии ВИЖа. Концентрацию прогестерона определяли в ГУ Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента ветеринарии МСХ РФ.

В основе определения прогестерона в биологических жидкостях животных лежит конкурентный вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Принцип метода основан на конкуренции между адсорбированным на поверхности лунок планшета прогестероном и свободным прогестероном (в калибровочной пробе или анализируемом образце) за активные центры связывания меченых пероксидазой антител к прогестерону. В результате иммуноспецифической реакции между антителами к прогестерону и самим прогестероном, содержащихся в пробах (стандарты и образцы) и на поверхности лунок планшета образуются комплексы антитело-прогестерон. Комплекс антиген-антитело, не связанный с поверхностью планшета, удаляют путем промывки.

В результате ферментативной реакции пероксидазы с перекисью водорода субстратного раствора происходит окрашивание 3,3', 5,5'-тетраметилбенэидина (ТМВ) в синий цвет. Интенсивность окраски обратно пропорциональна содержанию прогестерона в анализируемом образце.

В набор для определения концентрации прогестерона (ИФА-ПРОГ.б.) входят следующие компоненты:

Планшет плоскодонный из прозрачного пластика для иммуноферментного анализа цельный (96-луночный) или стриповый (6 стрипов по 16 лунок каждый или 12 стрипов по 8 лунок каждый) с адсорбированным конъюгатом -1,2 или 5 шт.

Стандарты прогестерона калиброванные, лиофилизированная аморфная масса желтого цвета (сыворотка):

• а) стандарт, содержащий 0 нМ/л — 1 (2) фл.
• б) стандарт, содержащий 0,3 нМ/л -1 (2) фл.
• в) стандарт, содержащий 1,0 нМ/л — 1 (2) фл.
• г) стандарт, содержащий 3,0 нМ/л -1 (2) фл.
• д) стандарт, содержащий 10,0 нМ/л — 1 (2) фл.
• е) стандарт, содержащий 30,0 нМ/л — 1 (2) фл.
• ж) образец контрольный, содержащий 7,0 нМ/л прогестерона -1,2 или 5 фл.
• 3. Конъюгат антител к прогестерону и пероксидазы из корня хрена (жидкость красного, желтоватого цвета или бесцветная — 0,3 — 15 мл). — 1 фл.
• 4. Буфер № 1, бесцветная жидкость — 0,3, 0,6 или 1,5 мл (сыворотка крови) — 1 фл
• 5. Буфер № 2, жидкость красного, желтоватого цвета или бесцветная — 0.3 — 15 мл — 1 фл.
• 6. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) — натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный; калий фосфорнокислый однозамещенный; натрий хлористый (рН 7,3 ±0,1); 20-кратный концентрат с детер-гентом, бесцветная жидкость— 15, 30 или 75 мл. — 1 фл.
• 7. Тетраметилбензидин (ТМБ) — бесцветная прозрачная жидкость — 2,2, 4,4 или 11мл. — 1 фл.
• 8. Субстратный раствор, бесцветная прозрачная жидкость-8,8, 17,6 или 44 мл — 1 фл.
• 9. Стоп-реагент (4-х нормальная серная кислота), бесцветная прозрачная жидкость — 12, 24 или 60 мл — 1 фл.

Для постановки ИФА использовались:

Однои многоканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками разных объемов;

Вибротермостат с температурой нагрева от 20 °C до 45 °C;

Холодильную камеру с температурой -18°С;

Промывающее автоматическое устройство;

Спектрофотометр с вертикальным лучом и длиной волны 450 нм;

Водяная баня;

Оптическую плотность (ОП) растворов в лунках с контрольным и анализируемыми образцами после остановки ферментативной реакции измеряли на спектрофотометре «Униплан» фирмы ЗАО «ПИКОН» при длине волны 450 нм.

Расчет конечной концентрации гормона проводится с учетом степени концентрирования анализируемого образца в процессе подготовки проб. Для сыворотки крови коров и нетелей результат, полученный методом ИФА, является окончательным.