Лабораторная работа № 4. Определение чувствительности микроорганизмов к различным фитонцидам

Фитонциды являются веществами, создаваемыми растениями в процессе обмена веществ. Характерное свойство этих веществ — губительное действие на микроорганизмы (бактерии и плесневые грибы). Иногда их действие ограничивается только задержкой роста. В качестве фитонцидов можно использовать чеснок, репчатый лук, хрен, редьку, лимон и др.

Цель работы: выяснить чувствительность микроорганизмов к действию различных фитонцидов.

Оборудование и материалы: чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), микробиологические петли, чеснок, репчатый лук, хрен, редька, лимон, стеклянный шпатель, пипетки, спиртовка.

Объект исследования: чистые культуры микроорганизмов (можно использовать культуры из предыдущей работы — Bacillus subtilis, Sarcina lutea, Bacillus cereus).

Ход работы.

В стерильные, предварительно просушенные чашки Петри разливают по 10—15 мл МПА. На поверхность среды высевают суспензию суточной культуры микроорганизмов. Пипеткой берут 0,02 мл этой суспензии (одна капля) и стерильным шпателем растирают досуха на питательной среде в чашке Петри у пламени горелки.

Затем, измельчая растительный материал на шинковке или терке, готовят кашицу из растений, содержащих фитонциды (чеснок, репчатый лук, хрен, редька, лимон). Кашицу помещают на агар в чашки Петри. Делать это надо быстро, так как бактерицидное действие зависит от быстроты и степени измельчения материала. Одну чашку оставляют для контроля, т. е. производят посев, но не вносят фитонциды.

После того как произведен посев и внесены фитонциды, все чашки Петри помещают в термостат и оставляют стоять там в течение 36—48 ч при температуре 25 °C. По истечении указанного срока их вынимают и просматривают, отмечая различное развитие бактерий в контроле и под воздействием разных фитонцидов.

Задание. Результаты опыта записать в таблицу и зарисовать. Сделать выводы о чувствительности различных микроорганизмов к фитонцидам.

Лабораторная работа № 5. Культура плесневого гриба на полной и неполной питательных средах.

Для изучения особенностей питания микроорганизмов удобным модельным объектом является Aspergillus niger, который легко получить и использовать в постановке различных экспериментов, в том числе для определения значения отдельных минеральных элементов для роста.

Цель работы: изучить значение питательных элементов для роста гриба Aspergillus niger.

Оборудование и материалы: 20%-й раствор сахарозы; 1%-е растворы ZnS0₄, Н3ВО3, MnS0₄; 10%-е растворы NH₄N0₃, КН₂Р0₄, КС1, NaH₂P0₄, MgS0₄, MgCl₂, FeS0₄, FeCl₃, Na₂S0₄; колбы емкостью 100 мл; цилиндры емкостью 100 мл; пипетки на 10 и 1 мл; препаровальные иглы; вата.

Объект исследования: культура гриба Aspergillus niger.

Ход работы.

Готовят различные питательные среды для культивирования гриба Aspergillus niger.

Вариант 1 — полная питательная среда без микроэлементов, %: сахароза — 10,0; NH₄N0₃— 0,3; КН₂Р0₄— 0,2; MgS0₄— 0,05; FeS0₄ — 0,01.

Вариант 2 — среда без углерода: исключена сахароза. Для компенсации осмотической активности среды можно внести соответствующее по осмотическому эквиваленту количество хлорида натрия (NaCl), который не оказывает влияния на развитие гриба.

Вариант 3 — среда без азота: исключен NH₄N0₃.

Вариант 4 — среда без фосфора: КН₂Р0₄ заменен эквивалентным количеством КС1.

Вариант 5 — среда без калия: КН₂Р0₄ заменен эквивалентным количеством NaH₂P0₄.

Вариант 6 — среда без серы: MgS0₄ и FeS0₄ заменены эквивалентными количествами MgCl₂ и FeCl₃.

Вариант 7 — среда без магния: MgS0₄ заменен эквивалентным количеством Na₂S0₄.

Вариант 8 — среда без железа: FeS0₄ заменен эквивалентным количеством Na₂S0₄.

Вариант 9 — полная питательная среда с добавлением цинка: ZnS0₄— 0,01%.

Вариант 10 — полная питательная среда с добавлением марганца: MnS0₄— 0,01%.

Вариант 11 — полная питательная среда с добавлением бора: Н₃В0₃—0,01%.

Следует рассчитать эквивалентный процент замещающего вещества (это относится ко всем вариантам, за исключением первых трех). Если в каждом из этих вариантов исключить какую-либо соль, то одновременно удаляются два элемента питания вместо одного. Так, в варианте № 4 (среда без фосфора) при удалении КН₂Р0₄ одновременно исключаются фосфор и калий. Поэтому калий необходимо внести в среду в эквивалентном количестве в виде КС1. Кроме того, необходимо помнить, что Aspergillus niger аэробный организм, поэтому для создания оптимальных условий аэрации используют колбы емкостью 100 мл с 30 мл среды.

Пример расчета.

Вариант 4 — среда без фосфора: КН₂Р0₄ (0,2% в среде) заменяют на КС1.

Молекулярная масса КН₂Р0₄— 136, КС1 — 74.

Сначала определяют содержание (в процентах) калия (X) в среде:

• 136 г КНоР0₄ составляют 0,2%;
• 39 г К — Х%;

X = 0,06%.

Затем устанавливают количество КС1 (в процентах), эквивалентное изъятому количеству КН₂Р0₄:

• 39 г К соответствуют 0,06% К;
• 74 г — 7% КС1;
• 7 = 0,1%.

Далее рассчитывают количество каждого вещества в граммах в 30 мл среды, зная их процентное содержание.

Пример расчета.

Необходим раствор, концентрация NH₄N0₃ в котором 0,3%:

в 100 мл раствора содержится 0,3 г NH₄N0₃;

в 30 мл—XrNH₄N0₃;

X = 0,09 г.

Таким же образом рассчитывают навески всех остальных компонентов среды.

Так как навески в большинстве своем очень малы, что затрудняет взвешивание, удобнее использовать готовые растворы: 20%-й раствор сахарозы; 1%-й раствор микроэлементов; 10%-е растворы всех остальных солей. Для этого следует определить, сколько миллилитров каждого раствора надо взять, чтобы внести соответствующую навеску.

Пример расчета.

Для NH₄N0₃:

в 10 мл 10%-го раствора NH₄N0₃ содержится 10 г NH₄N0₃;

в 7 мл 10%-го раствора NH₄N0₃ — 0,09 г NH₄N0₃;

7 = 0,9 мл.

Подобным же образом рассчитывают (в мл) все ингредиенты для каждого варианта и вносят их в колбу.

Просуммировав объемы растворов в каждом варианте, вычтя полученные суммы из 30 мл, получают количество дистиллированной воды, которое необходимо добавить в каждую колбу.

Колбы со средой заражают спорами гриба Aspergillus niger, закрывают ватными пробками и подписывают варианты опыта.

Среды перед внесением спор гриба не стерилизуют, так как высокая концентрация сахара и кислая реакция среды за счет кислых солей калия, магния и железа препятствуют росту бактерий.

Для каждого варианта опыт желательно повторить дважды. Опытные колбы помещают в термостат при 28—30 °С.

Материал анализируют через семь дней, так как к этому времени гриб вполне разовьется. Пленка, выросшая в первом варианте, принимается в качестве образца, с ней сравнивают все остальные. Обычно в этом варианте рост гриба очень хороший. Рост гриба оценивают визуально.

Отмечают состояние культуры гриба:

• а) характер мицелия — сплошная пленка или островками, плотная или студенистая, складчатая или гладкая;
• б) спороношение — обильное или слабое, зрелые или незрелые спорангии.

Для более точной оценки пленку гриба тщательно промывают с нижней стороны водой. Затем пленку из каждого варианта опыта можно высушить в сушильном шкафу при 105 °C до постоянной массы и взвесить, принимая вес пленки гриба в первом варианте за 100%.

На средах, где исключен тот или иной элемент питания (особенно при большой потребности в нем) гриб не растет или растет очень слабо. При полном удалении из питательной среды необходимого элемента гриб развиваться не будет.

Задание. Результаты опыта записать в таблицу и зарисовать. Сделать выводы о необходимости различных питательных элементов для нормального роста гриба Aspergillus niger и об особенностях развития гриба в отсутствие и при дополнительном внесении какого-либо элемента питания.