В центрифужную пробирку берут 1 мл сыворотки крови к 2 мл спирта, смешивают и центрифугируют 20 минут. Затем к 1 лед прозрачного центрифугата прибавляют 0,5 мл спирта и 0,25 мл свежеприготовленной смеси диазореактивов Эрлиха (см. ниже). Окрасившуюся жидкость переносят в стаканчик колориметра и колориметрируют, сравнивая ее со стандартом, находящимся во втором стаканчике. Расчет производят по формуле:
C1=C2*H2*5/H1
где: С1 — количество билирубина (в мг%),.
С2 — концентрация стандартного раствора, Н1 — высота столба исследуемой жидкости (в мм),.
Н2 — высота столба стандарта (в мм),.
5 — степень разведения сыворотки.
Смесь диазореактивов Эрлиха готовят из двух растворов:
- 1. сульфаниловая кислота — 0,2 г, соляная кислота (удельный, вес 1, 19) З мл, дистиллированная вода — 200 мл;
- 2. азотнокислый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.
Оба раствора хранят в темной посуде. Для анализа приготовляют смесь двух растворов, для чего берут 10,0 мл первого раствора и 0,3 мл второго.
В качестве стандарта применяют раствор сернокислого кобальта (2,161 г предварительно высушенного реактива доводят дистиллированной водой до 100 мл), который хранят в темноте.
Для определения разновидностей билирубина и, следовательно, для дифференциации желтух применяют прямую и непрямую реакции.
Прямая реакция На 1 мл сыворотки крови наслаивают 0,5 мл смеси диазореактивов. Появление на границе жидкостей бордово-красного кольца указывает на наличие билирубина, проведенного через печень.
Положительная реакция всегда свидетельствует о патологии. Если кольцо появляется быстро, то это указывает на механическую желтуху, замедленная реакция отмечается при катаральной желтухе, циррозе печени, болезнях сердца.
Непрямая реакция В 1 мл сыворотки крови прибавляют 2 мл спирта, смешивают и центрифугируют. Затем 1 мл прозрачного центрифугата наслаивают в другой пробирке на смесь диазореактивов (1,5 мл). На границе жидкостей появляется цветное кольцо от розового до красно-фиолетового цвета.
Положительная реакция зависит от наличия в сыворотке крови билирубина, не проведенного через печень. В норме эта разновидность билирубина обнаруживается у лошади. Повышенное содержание такого билирубина наблюдается при гемолитической желтухе.
В норме в сыворотке крови содержится билирубина: у лошадей от 0,37 до 1,35 мг%; у крупного рогатого скота — 0,01−0,30 мг%; у других животных содержание билирубина в сыворотке очень незначительное (следы).
