Методы измерения клеток на гематологических проточных анализаторах

1. Кондуктометрия является наиболее распространенным способом проточного анализа клеток крови и широко используется для проведения рутинных исследований в гематологических лабораториях. Этот метод применяют на некоторых исследовательских моделях многопараметровых установок для анализа и сортировки клеток, а также на большинстве гематологических анализаторов, производящих дифференциальный подсчет формулы крови.

Кондуктометрический детектор представляет собой капилляр диаметром порядка 70 мкм и длиной, обычно составляющей 0,75 диаметра, через который с большой скоростью пропускается суспензия клеток, находящихся в растворе электролита. По обе стороны от капилляра (апертуры) находятся электроды, между которыми поддерживается постоянный ток.

Поскольку электрическое сопротивление клетки значительно выше сопротивления электролита, в момент прохождения клетки через апертуру ее электрическое сопротивление резко возрастает. Амплитуда регистрируемого при этом импульса прямо пропорционально зависит от объема вытесненного электролита и отражает объем клетки. Подсчет количества объектов в единице объема пробы позволяет проанализировать их концентрацию. Более детальный анализ заключается в изучении распределения клеток по объему. В литературе кондуктометрический метод обозначают DC (от англ. direct current — измерение сопротивления).

Радиочастотный анализ (RF — radio frequency) является разновидностью кондуктометрического метода и используется на некоторых гематологических анализаторах. При прохождении апертурного отверстия объектом в токе высокой частоты также возникают сигналы, амплитуда которых зависит от размеров ядра, плотности ядерного матрикса и цитоплазматических включений (см. рис. 1). Эти сигналы в большей степени отражают характер внутренней структуры клетки.

2. Регистрация свето-рассеяния и поглощения. Физический анализ свето-рассеяния частиц и клеток достаточно сложен и нуж-дается в детальном рас-смотрении. Светорассеяние обусловлено клеточным размером, формой, плотно-стью, окрашиванием и гра-нулярностью внутрикле-точных структур. Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и отражающих компонентов. Светорассеяние для характеристики клеток измеряется разными путями. При малых углах относительно оси падающего света преобладает дифракция. Рассеяние вблизи первого минимума переднего светового дифракционного изображения используют для измерения размера объектов. С возрастанием угла рассеивания увеличивается значение рефракционных эффектов. Поскольку рефракционные лучи пересекают внутренность клетки, регистрируемые при этом сигналы в большей степени отражают внутриклеточную микроструктуру.

Преломление зависит от поглощения и может применяться для измерения способности клеток окрашиваться поглощающими красителями. Ослабление осевого света (поглощение) также используется для проточного анализа.

В частности, этот метод применяется в гематологических анализаторах «Техникон Н-3? («Тесhnicon», США) и в приборах фирмы «Rochе» (Швейцария) для дифференциального подсчета лейкоцитов периферической крови.

• 3. Флюориметрия — измерение флюоресценции красителей, связанных с избирательными клеточными структурами — главное в применении проточной цитометрии. Флюоресценция имеет 3 основных преимущества в проточных исследованиях: 1) флюоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам; 2) концентрация красителя для исследования клетки очень низкая; 3) нефлюоресцирующие соединения могут становиться флюоресцирующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами. Наибольшее применение в цитофлюориметрии нашли методики анализа распределения клеток по содержанию ДНК и флюоресцентная метка клеток антителами (иммунофенотипирование), которые можно применять одновременно (на одном образце). Основные линии поглощения и излучения флюорохромов, наиболее часто используемых в проточной цитофлюориметрии, приведены в табл. 1. Более подробную информацию о флюоресцентных зондах можно получить в обзорах. Интенсивность флюоресцентного сигнала, а, следовательно, и качество измерений зависят от различных инструментальных характеристик. Сюда входят интенсивность возбуждающего света, скорость движения объектов в потоке, спектр возбуждения красителя, квантовая эффективность красителя, собирающая и передающая эффективность световой оптики и чувствительность фотоэлектронных умножителей.
• 4. Изучение поляризации флюоресценции позволяет охарактеризовать такое важное биологическое свойство, как вязкость или текучесть мембран, которое отражает функциональное состояние клетки. При поляризации лазерного излучения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. В том случае, если молекулы заметно вращаются, их ориентация меняется до начала флюоресцентного излучения и интенсивность поляризованного света уменьшается. Поляризация светорассеяния используется в специальной технологии МАРSS (поляризация многоуглового светорассеяния), примененной в гематологических анализаторах фирмы «Abbott» для дифференцировки эозинофилов и базофилов.
• 5. Анализ сигнала волновой формы можно использовать для измерения ядерного и цитоплазматического диаметра. При этом применяется «щелевой» анализ — лазерный луч фокусируют до диаметра 1 мкм, а измеряемые клетки пересекают его с постоянной скоростью. Регистрируемые флюоресцентные сигналы имеют волновую форму, которая отражает структуру и размеры объекта вдоль оси, перпендикулярной к щели. Такой подход использовался для анализа структуры хромосом млекопитающих.