Дополнение 1.1. Молекулярная организация и функциональные особенности ионных каналов, насосов и транспортеров, участвующих в формировании потенциала покоя

Наличие у клеточной мембраны в состоянии покоя избирательной проницаемости к ионам калия, натрия и хлора неизбежно порождает вопрос о ее природе. В настоящее время известно, что избирательная проницаемость мембраны к калию и хлору в покое обеспечивается работой специальных ионных каналов — каналов калиевой и хлорной утечки. Именно эти каналы обладают избирательной проницаемостью к соответствующему иону и всегда находятся в открытом состоянии.

К⁺-каналы утечки были открыты и изучены лишь на рубеже XX— XXI вв. Благодаря молекулярному клонированию генов мембранных белков и использованию электрофизиологического метода пэтч-клампа для анализа активности одиночных каналов были выделены мембранные белки, выполняющие роль К⁺-каналов утечки, описаны их структура и свойства. Оказалось, что молекулы субъединиц К⁺-каналов утечки, каждая из которых образована одной белковой цепью, формируют в мембране димер. Белковая цепь каждой субъединицы К⁺-канала утечки четыре раза пересекает мембрану, образуя четыре а-спирализованных домена, или сиквенса. Между первым и вторым, а также третьим и четвертым доменами имеются внутримембранные неспирализованные петли (Р-петли), выстилающие пору канала (рис. 1.10). Именно поэтому К~-каналы утечки получили название 2Р-доменные К⁺-каналы, или 2Р/45-К⁺-капалы.

Рис. 1.10. Структура К⁺-канала утечки 2Р/45типа:

а — схема устройства субъединицы; 6 — димер К*-канала утечки;

 — а-спирализованныс трансмсмбранныс домены В настоящее время экспрессия мРНК К⁺-каналов утечки 2P/4S- типа обнаружена в различных нейронах центральной нервной системы (ЦНС) и других клетках млекопитающих. Функциональные особенности К⁺-каналов утечки выражаются в их чувствительности к действию pH среды, температуры, летучих анестетиков, медиаторов, пептидов, G-белок-сцепленных рецепторов и некоторых других метаболитов. Одни каналы мало зависят от изменений pH, другие — высокочувствительны к ацидозу и при закислении наружной среды способны инактивироваться, т. е. закрываться. Это приводит к деполяризации мембраны и снижению потенциала покоя. Следовательно, проводимость К⁺-каналов утечки является регулируемой величиной, хотя и поддерживается достаточно высокой в физиологическом диапазоне изменений потенциала на мембране (от -90 до +50 мВ).

Таким образом, калиевая утечка стабилизирует потенциал покоя, предотвращая его значительные сдвиги в область гиперполяризации. Подавление К⁺-утечки приводит к деполяризации мембраны, повышению входного сопротивления мембраны и развитию возбуждения. Недавно установлено, что структурные (обусловленные генетически) либо функциональные нарушения К⁺-каналов утечки у нейронов и других клеток приводят к неконтролируемой деполяризации клеток и являются причиной целого ряда серьезных патологий, таких как апоптотическая гибель клеток, эпилепсия и др.

С1 -каналы утечки обеспечивают достаточно высокую проводимость для анионов С1 мембран возбудимых клеток. Отношение хлорной проводимости к пассивной калиевой проводимости у разных типов клеток в покое может варьировать от ½ до 20/1. Максимальный уровень экспрессии генов С1 -каналов утечки, постоянно открытых при потенциале покоя, наблюдается в волокнах скелетной мускулатуры позвоночных животных. Уровень экспрессии генов и плотность хлорных каналов на мембране намного превышают таковые для калиевых каналов утечки. Соответственно, 80% величины общей мембранной проводимости, наблюдаемой у скелетных мышечных волокон при потенциале покоя, обеспечивается хлорной, а не калиевой проводимостью.

В последнее десятилетие установлено, что собой представляют С~- каналы, обеспечивающие столь высокую хлорную проводимость клеточных мембран, в особенности — у волокон скелетной мускулатуры. Хлорный канал утечки представляет собой димер, образованный двумя белковыми субъединицами. При этом формируются два канала, которые могут находиться в открытом состоянии и пропускать анионы СП как одновременно, так и по отдельности. Каждая отдельная субъединица СН-канала утечки имеет 17 доменов, пересекающих мембрану. Имеются более липофильные и более гидрофильные домены, по этой причине не все они пронизывают мембрану полностью. Большинство доменов лишь частично погружены в мембрану, причем как с наружной, так и с внутренней стороны канала. Потоки анионов хлора через клеточную мембрану по хлорным каналам утечки в покое выровнены, поскольку равновесный потенциал для СП близок по величине к потенциалу покоя, создаваемому токами калия и натрия. В этом случае изменение градиента концентрации хлора либо хлорной проводимости хотя и приведет к сдвигу потенциала покоя, но он будет носить временный характер. Это происходит в силу способности анионов хлора к перераспределению своей концентрации внутри и снаружи клетки. Это, в свою очередь, вызывает постепенное изменение равновесного потенциала для хлора, «подстраивание» его к величине, определяемой соотношением калиевого и натриевого компонентов.

Но даже если хлорные токи уравновешены и не принимают участие в создании потенциала покоя, пассивная хлорная утечка через мембрану клетки тем не менее весьма важна для его стабилизации. Она играет роль своеобразной шунтирующей проводимости, предотвращающей отклонения мембранного потенциала от уровня потенциала покоя.

Натриевая утечка при потенциале покоя, несмотря на свою небольшую величину, обусловливает неравновесное электрохимическое состояние мембраны покоящейся клетки. Чем обусловлена эта натриевая проницаемость мембраны в покое? В настоящее время специальные Na⁺— каналы утечки не обнаружены. Проницаемость калиевых каналов утечки для катионов натрия очень мала, но все-таки составляет 1—3% от проницаемости для калия. Возможно, натрий проникает в клетку через них. На мембранах клеток могут присутствовать и неселективные катионные каналы, проводящие наряду с другими ионами и катионы натрия. Наконец, существуют низкоселективные катионные каналы, которые способны пропускать и Na⁺, и К⁺. В силу значительно большей электродвижущей силы, характерной при потенциале покоя именно для токов натрия, такие неселективные каналы иногда называют натриевыми каналами пассивной утечки. Кроме того, у электровозбудимых клеток в покое вероятность нахождения в открытом состоянии потеициал-зависимых Ыа⁺-каналов хотя и очень мала, но не равна нулю. Поэтому такие, крайне редко открывающиеся в покое, Иа^-каналы также могут быть причиной натриевой утечки. В пользу такой возможности говорит тот факт, что обработка возбудимых клеток тетродотоксином, избирательным блокатором потенциал-зависимых №⁺-каналов, приводит к небольшому увеличению электронегативности потенциала покоя.

Молекулярная организация и функциональные особенности Na'/ Кнасоса. Молекула NaVK⁺-Hacoca представляет собой белковый комплекс, встроенный в мембрану клетки, обладающий свойствами и фермента, и ионофора. Комплекс состоит из двух субъединиц — аир (см. рис. 1.6). Будучи встроенной в мембрану, а-субъединица способна формировать ионные каналы для транспортировки катионов Na⁺ и К" через мембрану против их концентрационного градиента, р-субъедипица обеспечивает правильную ориентацию а-субъединицы в мембране, и ее присутствие является обязательным для активности а-субъединицы. В составе мембраны Na⁺/K⁺«^Haa> присутствует в виде димерного комплекса (ар)₂ или более высокомолекулярных кластеров.

а-субъединица (113 кДа) является АТФ-фосфогидролазой (АТФазой), имеет специфические сайты связывания АТФ, а также катионов Na⁺ и К⁺. В составе этой субъединицы имеется 10 а-спирализованных фрагментов, образующих 10 трансмембранных доменов, выполняющих разные функции (рис. 1.11). Между четвертым и пятым доменом имеется большая цитоплазматическая петля. Именно здесь находится сайт связывания АТФ.

Исходя из данных кристаллизации белка и его рентгеноструктурного анализа в а-субъединице имеется один связывающий ионы центр, в состав которого входят аминокислотные остатки из нескольких трансмембранных доменов. Этот центр способен в зависимости от конформации белка поочередно связывать и катионы натрия, и катионы калия. Причем срод;

Рис. 1.11. Расположение субъединиц молекулярного комплекса Na⁺/K⁺-ATa:sbi в мембране:

черными кружками выделены трансмембранные домены а-субъединицы, образующие центр связывания катионов Na⁺ и К⁺ и ионофорную структуру, последовательно пропускающую Na⁺ наружу и К⁺ внутрь клетки ство к натрию и калию, а также размер поры ион-транспортирующего канала могут меняться в зависимости от конформации белковой молекулы и вида транспортируемого катиона. Взаимодействие катионов Na⁺ и К⁺ со специфическими сайтами внутри а-субъединицы обеспечивается координационными связями с атомами кислорода аспарагиновой и глутаминовой аминокислот в составе трапсмембранных доменов 4, 5, 6 и 8. Благодаря специфической третичной укладке этих доменов а-субъединицы создается ионофорная структура, т. е. «канал» с «воротами», пропускающими в одну сторону ионы натрия, а в другую — калия. Модель предполагает работу молекулы насоса по принципу последовательного «шлюзования» катионов натрия и калия и их поочередную «переброску» через мембрану.

На рис. 1.12 представлена схема этой модели. Работу насоса согласно модели можно разбить на пять стадий:

• 1) молекула Na'/K'-ЛТФазы в исходном конформационном состоянии (Е,) имеет высокое сродство к катионам Na⁺;
• 2) фермент связывает три катиона Na⁺ внутри канала и одновременно организуется в присутствии 2Mg²⁺ и АТФ в М§²⁺-АТФ-комплекс. Далее происходит фосфорилирование фермента и образование комплекса, содержащего макроэргическую фосфатную связь Mg²⁺-E₁-P + АДФ;
• 3) молекула тратит энергию макроэргической связи для перехода в конформационное состояние (Е₂), при этом теряет сродство к катионам натрия, они отсоединяются от молекулы насоса и уходят в наружную среду, т. е. происходит перенос катионов натрия наружу;
• 4) молекула белка в конформации Е₂, теряя сродство к катионам Na⁺ приобретает сродство к катионам К⁺. Связывание катионов К⁺ приводит к дефосфорилированию молекулы;
• 5) белок в результате дефосфорилирования возвращается в первоначальную конформацию Е], при этом он теряет сродство к катионам К⁺, которые переносятся внутрь клетки. В данной модели у Ка⁺/К⁺-АТФазы один катионный центр, который при одном состоянии конформации энзима (БД имеет большее сродство к катионам Na⁺, а в другом состоянии (Е₂) — к катионам К⁺.

Рис. 1.12. Схема модели работы Ка⁺/К⁺-АТФазы по принципу шлюзования и поочередной «переброски» катионов Na⁺ и К⁺ за счет изменяющегося сродства к катионам Na⁺ и К⁺ внутри канала, обусловленного энергозависимым (за счет АТФ) изменением конформации молекулы насоса (Ej и Е₂)

Молекулярная организация и функциональные особенности хлорных транспортеров. В нейронах представлены две противоположно работающие транспортные системы — это Ша⁺/1К⁺/2С1 транспортер 1-го типа.

(сокращенно NKCC1) и 1К⁺/1 Cl — транспортер 2-го типа (сокращенно КСС2).

Молекула транспортера NKCC1 осуществляет захват двух анионов хлора вместе с транспортом внутрь одного катиона Na⁺ и одного катиона К⁺. Транспортер типа КСС2 выкачивает один ион CI сопряженно с одним катионом К⁺ (рис. 1.13). В обоих случаях стехиометрия котранспорта хлора и катионов такова, что транспортеры работают в электронейтральном режиме. Важно отметить, что молекулы-транспортеры хлора — NKCC1 и КСС2 — не являются АТФазами, но используют энергию электрохимического градиента для катионов Na⁺ и К⁺, создаваемого работой Na⁺/ К⁺-АТФазы. В результате транспорт натрия и калия молекулой-транспортером хлора корректируется работой №⁺/К⁺-АТФазы, а фактический, реальный перенос касается только ионов хлора. Такой сопряженный, зависящий от натрий-калиевого концентрационного градиента и активности №⁺/К⁺-АТФазы транспорт С1~ широко распространен в биологических мембранах и носит название вторично-активного.

Рис. 1.13. Схема работы нейрональных хлорных транспортеров в сочетании с хлорной утечкой:

активность транспортеров определяет концентрационный градиент и равновесный потенциал для хлора (Е_{с (раШ1}), который может быть больше или меньше значения потенциала покоя (V,") это определяет возможность как входящего, так и выходящего С1 -тока при активации ГАМК_л-рецепторов Необходимо иметь в виду, что из-за очень низкого содержания хлора в клетке (порядка 10 мМ) любой его однонаправленный (не сбалансированный) транспорт через мембрану приводит к значимому для клетки увеличению или снижению его внутриклеточной концентрации. Поэтому возникающий ток хлора (внутрь или наружу) всегда сопряжен не только с изменением его содержания внутри клетки, но и — по законам осмоса — с трансмембранным переносом воды в клетку или из клетки.

Реально существующий градиент концентраций хлора снаружи и внутри клетки указывает на то, что в мембранах преобладает активность транспортеров КСС2, выводящих хлор наружу из клетки. Поэтому КСС2- транспортер, выкачивающий хлор из клетки против его градиента концентраций, часто называют хлорным насосом. Следует, однако, помнить, что КСС2-транспортер осуществляет вторично активный транспорт хлора наружу. При этом молекулы хлорных КСС2-транспортеров бывают не только функционально, но и структурно связаны (сцеплены) с молекулами Na⁺/K ?-ЛТФазы (с а-субъединицей насоса) на мембране.

В зрелых нейронах активность КСС2-транспортеров по сравнению с активностью NKCCl-транспортеров столь высока, что градиент концентраций и значение равновесного потенциала для хлора (рассчитываемого по уравнению Нернста) выше, т. е. имеет более электронегативное значение, чем величина мембранного потенциала покоя (Е_с > ПП). В этом случае действие тормозного медиатора гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) на ГАМКд-рецепторы и открытие хлорных каналов приведут к току хлора внутрь нейрона и развитию гиперполяризационного потенциала. В незрелых (эмбриональных и неонатальных) нейронах, напротив, активность NKCCl-транспортеров по сравнению с активностью КСС2-транспортеров столь высока, что трансмембранный градиент ионов хлора снижен до величины, при которой ?_С| < ПП. По этой причине в незрелых развивающихся нейронах при активации ГАМКд-рецепторов анионы хлора, выходя по каналам этих рецепторов из нейронов, вызывают развитие деполяризации (рис. 1.14).

Рис. 1.14. Примеры генерации возбуждающих (деполяризующих) или тормозных (гипериоляризующих) постсинаптических потенциалов в ответ на действие ГАМК при разных сооотношениях потенциала

покоя и Е_с, _рав1|

Сейчас клонированы гены, кодирующие белковые молекулы хлорных NKCC1- и КСС2-трансиортеров. Они представляют собой белки с молекулярной массой около 120—130 кДа. Белковая цепь молекулы транспортера включает порядка 1100—1200 аминокислот и 12 раз пересекает мембрану.