Кроссинговер на стадии четырех хроматид

Теоретически допустимо, что кроссинговер происходит как до репликации хромосом — на стадии двух нитей, так и после — на стадии четырех нитей. Это подтверждает тетрадный анализ, поскольку при этом подходе возможно исследование всех четырех продуктов каждого мейоза. Одним из наиболее удобных объектов для тетрадного анализа является гаплобионт хлебная плесень {Neurospora crassa) (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Жизненный цикл хлебной плесени (Neurospora crassa).

Особенность мейоза у хлебной плесени в совпадении направления веретена I и II деления мейоза с длинной осью аска, или сумки, в которой располагаются затем гаплоидные аскоспоры. Четыре гаплоидных ядра после мейоза еще раз делятся митотически, в результате чего в аске в ряд располагаются четыре пары гаплоидных спор, а генотип каждой пары спор идентичен.

При тесном сцеплении генов крайне редок кроссинговер на стадии двух нитей в тетрадах (октадах) нейроспоры (рис. 6.3, а, б). Причина их появления связана с определенными типами двойных обменов.

Рис. 6.3. Возможные последствия кроссинговера у хлебной плесени {Neurospora crassa) при дигибридном скрещивании: а — на стадии двух нитей; б — на стадии четырех нитей. Кружки — центромеры Как правило, кроссоверные аскоспоры содержатся в тетрадах (октадах). Последствия кроссинговера на стадии четырех нитей рассмотрены на рис. 6.3. Расхождение центромер у N. crassa ориентировано по длине аска, у которого различают базальный и апикальный концы. Доказательство того, что кроссинговер идет на стадии четырех нитей, можно получить и при рассмотрении моногибридного скрещивания. При скрещивании штаммов, различающихся по аллелям только одного гена В/b, всегда имеется еще один маркер, в качестве которого служит направление расхождения центромер при двух делениях мейоза. Порядок расположения аскоспор, возникающий вследствие кроссинговера на участке ген-центромера, подтверждает вывод о том, что рекомбинация происходи на стадии четырех хроматид.

В этом можно убедиться, если рассматривать только расщепление по гену В/b, дистальному от центромеры. В случае кроссинговера на участке ген В-центромера не совпадают редукция по центромере и редукция по гену В/b. Редукция по центромере происходит при мейозе I, а редукция по генетическому фактору — при мейозе II. Редукция по центромере и по гену В/b совпадает только тогда, когда на участке ген-центромера нет кроссинговера. Таким образом, благодаря особенностям жизненного цикла нейроспоры у нее можно картировать гены по отношению к центромерам. Для этого нужно учитывать частоту редукции (расщепления) по данному гену при мейозе II, о которой можно судить по расположению аскоспор в асках.

В том, что кроссинговер происходит после репликации хромосом, можно убедиться не только на примере нейроспоры и других организмов, у которых возможен тетрадный анализ. В 1925 г. К. Бриджес и И. Андерсон продемонстрировали хроматидный кроссинговер у дрозофилы. Для этого они использовали линию со сцепленными А-хромосомами, несущую также У-хромосому (А х ХУ), аналогичную линии double yellow. Мухи в опытах К. Бриджеса и И. Андерсона были гетерозиготны по генам А-хромосомы: f (forked) — раздвоенные, вильчатые щетинки, g (garnet) — ярко-красные глаза, v (vermilion) — также ярко-красные глаза. При скрещивании самок с таким набором хромосом с обычными самцами они непосредственно передают две свои А-хромосомы дочерям, и выживает только половина их потомства. При этом часть самок в потомстве от такого скрещивания оказываются гомозиготными по рецессивным генам А-хромосомы. Очевидно, такие гомозиготы могут появляться только в результате кроссинговера на стадии четырех хроматид на участке ген-центромера. Исследовав гомозиготизацию по трем разным генам А-хромосомы, ученые убедились, что ее частота пропорциональна их расстоянию от центромеры, которая находится на самом конце А-хромосомы (для/- 5,5%, для g — 10%, для v — 16,1%). Этот способ анализа у дрозофилы получил название полутетрадного, поскольку каждая учитываемая в эксперименте самка (А х XY) несет две из четырех хроматид бивалента, образующегося в профазе I мейоза.

Убедившись, что кроссинговер происходит на стадии четырех нитей, обратимся к эксперименту Дж. Тэйлора (1967), доказывающему справедливость гипотезы «разрыввоссоединение». Проведенный им эксперимент — своеобразный вариант тетрадного анализа с использованием цитологического метода. Нимфам кузнечика вводили тимидин, меченный тритием так, чтобы он включался в хромосомы в последнем митотическом цикле перед мейозом. Благодаря этому в результате последующей премейотической репликации каждая хромосома бивалента состояла из меченой и немеченой хроматид. Результаты реципрокных обменов между мечеными и немечеными хроматинами были четко видны на радиоавтографах. Такие обмены представляют лишь половину всех происходящих, т. к. обмены только между мечеными или только между немечеными хроматинами не регистрируются.

Частота наблюдаемых обменов соответствовала предсказанной исходя из числа хиазм и отсутствия сестринских обменов. Например, среднее число хиазм, приходящихся на самую длинную хромосому, равно 3,67. Поскольку обмены осуществляются на стадии четырех хроматид, каждая хиазма дает только две рекомбинантные хроматиды (3,67: 2 = 1,88). Регистрируется половина всех обменов (1,88:2 = 0,94). Для этой хромосомы Дж. Тэйлор наблюдал рекомбинантные хроматиды с частотой 0,89.

Тетрадный анализ незаменим при изучении множественных обменов и интерференции между ними. Для этого рассматривают тригибридное скрещивание (ЛВС х abc) по сцепленным генам. Учитывая, что кроссинговер происходит на стадии четырех хроматид, возможны три типа двойных обменов. Это двойные двуххроматидные обмены, двойные треххроматидные обмены и двойные четыреххроматидные обмены только между не сестринскими хроматидами, последствия которых генетически различимы (рис. 6.4).

Рис. 6.4. Типы двойных обменов, регистрируемые при тетрадном анализе тригнбридного скрещивания у грибов.

Внизу — ожидаемое соотношение типов тетрад; порядок спор не фиксирован Можно идентифицировать последствия двух-, трехи четыреххроматидных обменов по присутствию в тетрадах аскоспор без обменов (АВС и abc), с одним обменом (АВс и аЬС или Abc и аВС) и с двумя обменами: (АЬС и аВс).

Расположение аскоспор в данном случае несущественно. Если предположить, что все типы обменов равновероятны, то следует ожидать появления указанных трех типов тетрад в соотношении 1:2:1.

В 1963 г. С. Эмерсон статистически обработал представленные многими авторами данные по тетрадному анализу двойного кроссинговера и получил общее соотношение двух-, трехи четыреххроматидных обменов — 0,29: 0,48: 0,23. Это соотношение близко к 1: 2: 1. Следовательно, различные типы двойных обменов происходят практически случайно, т. е. хроматиды, вступившие или не вступившие в один акт рекомбинации, с одинаковой вероятностью участвуют в повторном акте рекомбинации.

Приведенные данные показывают, что хроматидная интерференция отсутствует. Ее отсутствие не противоречит существованию хромосомной, или хиазменной, интерференции. Это значит, что один обмен затрудняет второй и последующие обмены на соседних участках, но если двойной кроссинговер все же происходит, то все четыре хроматиды вовлекаются в него равновероятно.

По-видимому, важную, но до конца не выясненную роль в мейотическом кроссинговере играет синаптонемный комплекс (СК). У разных организмов способность к кроссинговеру коррелирует с образованием СК. Например, он формируется у самок D. melanogaster с нормальным кроссинговером, но не у самцов, у которых кроссинговер подавлен. При образовании СК небольшие участки ДНК конъюгирующих хромосом вовлекаются внутрь центральной зоны СК. Предполагается, что именно на этих участках инициируются межхроматидные обмены. У растений известны ахиазматические мутанты, у которых изменение одного гена приводит к утрате СК, отсутствию хиазм и подавлению кроссинговера.

Нами рассмотрены обмены только между не сестринскими хроматинами. Для выяснения вопроса о возможности и частоте обменов между сестринскими хроматинами в мейозе требуются специальные генетические подходы.

Таким образом, кроссинговер происходит на стадии четырех нитей — в профазе мейоза. В результате этого образуются хиазмы, которые удобнее всего наблюдать на стадиях диплотены и диакинеза.