Морфофункциональные характеристики митохондрий лимфоцитов у детей при различных формах недостаточности клеточного энергообмена

Актуальность проблемы. Исследования адаптационных реакций клеточной системы, их причин, проявлений, молекулярных механизмов относятся к фундаментальным проблемам цитологии. Адаптационный синдром является необходимым звеном любого патологического процесса, поэтому для постановки правильного диагноза, для контроля за эффективностью лечения и для профилактики болезней необходимо проведение исследований клеточных и молекулярных характеристик этого синдрома.

В последнее десятилетие в медицине активно развивается так называемое «метаболическое направление», формирующее представление о роли нарушений клеточного энергообмена в развитии и течении самых разнообразных патологических процессов (энцефалопатий, миопатий, кардиопатий и др.) (Вельтищев Ю.Е. 1992; 1998, Вельтищев Ю. Е. и соавт. 1999; Luft R. 1994; Scheffler I.E., 2001).

Одной из причин нарушения клеточного энергообмена является митохондриальная дисфункция. Основные биохимические процессы, происходящие в митохондриях это — окисление жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот, окислительное фосфорилирование, регуляция внутриклеточного распределения кальция, образование стероидов, регуляция апоптоза. В митохондриях интегрированы пути метаболизма белков, жиров и углеводов, осуществляются основные энергетические процессы. В связи с этим изменения митохондрий способны вызвать сложную цепь патологических процессов на уровне клетки и всего организма в целом.

Известно, что количество и биохимические характеристики митохондрий в клетках различных тканей неодинаковы и зависят от функции клеток. Например, митохондрии печени не могут образовывать ацетоацетил-КоА, в отличие от митохондрий сердца. Кроме того, митохондрии обладают выраженным полиморфизмом. Значительно варьируют их размер, форма, организация крист, состояние матрикса.

Полноценная функциональная активность митохондрий зависит от многих условий. Для её обеспечения в первую очередь необходимо наличие неповрежденных внутримитохондриальных мембран. Нарушение сопряжения дыхания с фосфорилированием характерно для адаптационных реакций.

Заболевания, связанные с нарушением митохондриальных функций чрезвычайно разнообразны. Различают наследственные заболевания, обусловленные мутациями митохондриальных или ядерных генов, кодирующих синтез митохондриальных белков — это первичная митохондриальная недостаточность, которая приводит к развитию известных тяжелых синдромов, таких как синдром Кернса — Сейра, Пирсона, MELAS, MERRF и многие другие, а также широкий круг болезней, одним из звеньев патогенеза которых является нарушение клеточной энергетики: синдром хронической усталости (Behan W.M.H. 1994; Plioplys-AV et al.1995; McArdle-A et al. 1996), мигрень (Hipolite I. 1994), кардиомиопатии, болезни соединительной ткани, сахарный диабет, тубулопатии, панцитопения, гипопаратиреоз и др. Выявлено влияние митохондриальной недостаточности на характер течения послеожогового рубцевания у детей, хронического тонзиллита, урологических заболеваний (Сухоруков, 2004).

Морфологический анализ наряду с биохимическим и молекулярно-генетическим методами традиционно занимает ведущее место в диагностике митохондриальной недостаточности. Наиболее информативным при этом считается анализ митохондрий в биоптатах скелетной мышцы. Однако, учитывая полисистемность поражения, митохондриальные изменения можно выявлять и в других тканях.

В последнее время для диагностики нарушений клеточного энергообмена используется цитохимический метод определения активности митохондриальных ферментов в лимфоцитах периферической крови (метод Р.П. Нарциссова). Достоинствами метода являются его малотравматичность, относительная простота, возможность неоднократного применения для изучения динамики изменений и низкая стоимость.

Расширяющиеся методические возможности, в частности, компьютерная фотометрия позволяют получить значительно больший объем информации. При этом остаются неясными многие вопросы. В частности, не проводится четкого разделения между изменениями, связанными с полисистемными нарушениями клеточного энергообмена (первичными и вторичными) и возможными изменениями при воспалительных процессах.

Кроме того, не существует четких алгоритмов выбора конкретных диагностических маркеров среди большого количества потенциально выявляемых морфо-функциональных характеристик митохондрий лимфоцитов, поэтому актуальной является проблема сравнительного анализа диагностической значимости этих показателей.

Исходя из вышеизложенного, была обоснована цель исследования;

Выявить морфо-функциональные характеристики адаптационных и патологических реакций митохондрий в лимфоцитах при различных формах полисистемного нарушения клеточного энергообмена у детей и определить возможность использования изученных параметров для диагностики митохондриальных болезней.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1. Определить цитохимические и ультраструктурные характеристики митохондрий лимфоцитов периферической крови у детей с митохондриальными энцефаломиопатиями.

2. Определить изменения цитоферментативной активности и особенности ультраструктуры митохондрий лимфоцитов периферической крови у детей с митохондриальной недостаточностью, сопутствующей наследственным заболеваниям, первично не связанным с нарушениями клеточного энергообмена.

3. Выявить морфо-функциональные особенности митохондрий лимфоцитов у детей с хроническими воспалительными заболеваниями (на примере болезней верхних дыхательных путей) и сопоставить эти параметры с соответствующими показателями при митохондриальных болезнях.

4. Определить биохимические и иммунологические показатели, сопутствующие полисистемной митохондриальной недостаточности, а также морфологические показатели дизэнергетических состояний, полученные при биопсии мышечной ткани у обследуемых детей.

5. Выявить среди изученных лабораторных показателей значимые для диагностики митохондриальных болезней у детей.

Научная новизна работы.

Впервые на основании комплексного морфо-функционального исследования митохондрий лимфоцитов периферической крови как на световом, так и на электронно-микроскопическом уровнях, выявлены их структурно-функциональные отличия при первичных и вторичных формах дизэнергетических состояний. Впервые проведена комплексная морфологическая оценка митохондрий лимфоцитов при хроническом воспалительном процессе. При сопоставлении полученных данных определены варианты адаптационных и патологических изменений митохондрий лимфоцитов.

Практическая значимость.

В комплексе изучаемых морфо-функциональных параметров митохондрий лимфоцитов периферической крови определены диагностически наиболее значимые показатели полисистемных митохондриальных нарушений. Выявлены маркеры адаптационных и патологических изменений митохондрий лимфоцитов, что необходимо для повышения эффективности дифференциальной лабораторной диагностики заболеваний, связанных с нарушениями клеточного энергообмена.

Решение поставленных задач осуществлялось в Научно-исследовательской лаборатории общей патологии (руководитель — профессор, доктор медицинских наук В.С.Сухоруков) Федерального государственного учреждения Московского НИИ педиатрии и детской хирургии (директор — профессор, доктор медицинских наук А.Д.Царегородцев) Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Внедрение в практику. Разработанный способ дифференциальной диагностики полисистемной митохондриальной недостаточности у детей апробирован и внедрен в практическую работу Научно-исследовательской лаборатории общей патологии ФГУ Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на совместном методическом совещании Научно-исследовательской лаборатории общей патологии и отдела наследственных и врожденных заболеваний МНИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава, а также кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии лечебного факультета РГМУ. Основные положения диссертации доложены на I, II и III Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» 2002, 2003 и 2004 года, на Международной научной конференции, посвященной проблемам туберозного склероза 16−18 сентября 2004 года, Кембридж, Англия.

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 8 — в зарубежной печати.

выводы.

1. Цитохимические методы исследования митохондрий лимфоцитов периферической крови достоверно отражают полисистемные нарушения клеточного энергообмена, что подтверждается корреляцией цитохимических параметров с показателями ультраструктурного исследования митохондрий, с данными гистологического исследования биоптатов скелетной мышечной ткани, а также с биохимическими параметрами полисистемной митохондриальной недостаточности.

2. При первичных нарушениях клеточного энергообмена (митохондриальные энцефаломиопатии, синдром Кернса-Сейра, синдром MELAS) митохондрии лимфоцитов периферической крови характеризуются: снижением количества органелл, их набуханием, значительной вытянутостью формы, образованием своеобразных комплексов и кластеризацией органелл, наличием тотальных или очаговых признаков разрушения ультраструктуры, нарушением показателей оптической плотности при цитохимической оценке, ферментативной активности.

3. При полисистемных митохондриальных нарушениях, не носящих первичного этиопатогенетического характера (синдром Элерса-Данло, синдром Марфана, туберозный склероз), морфо-функциональные изменения митохондрий лимфоцитов отличаются очаговостью и умеренностью ультраструктурных изменений, а также специфичными цитохимическими нарушениями.

4. При хроническом воспалительном процессе дифференциально-диагностические лабораторные показатели адаптивных изменений клеточного энергообмена отличаются признаками активизации, гипертрофии и пролиферации митохондрий, а также увеличением размеров гранул формазана при цитохимическом выявлении активности лактатдегидрогеназы.

Практические рекомендации:

1. При диагностике полисистемных нарушений клеточного энергообмена (митохондриальные энцефаломиопатии, синдром Кернса-Сейра и др.) следует использовать полученные в работе клинико-лабораторные цитохимические критерии, позволяющие значительно уменьшить число проводимых с этой целью биопсий мышечной ткани.

2. В целях дифференциальной лабораторной диагностики «первичных» и «вторичных» полисистемных митохондриальных нарушений может быть применен предложенный в работе способ морфометрического анализа.

3. Полученные данные могут быть использованы для дифференциальной диагностики патологических и адаптивных (при функциональном напряжении иммунокомпетентных клеток) изменений митохондрий лимфоцитов периферической крови.

4. Материалы исследования могут быть включены в лекционные курсы для студентов на кафедрах: гистологии, цитологии и эмбриологии и клинической лабораторной диагностики высших медицинских учебных заведений.