Новые аспекты эффекта положения трансгенов Drosophila melanogaster

Транскрипция является одним из важнейших этапов реализации генетической информации. Транскрипция эукариот регулируется многочисленными циси трансфакторами, соответственно, регуляторными последовательностями и белками, которые осуществляют взаимодействие между дальними (энхансерами, сайленсерами) и ближними (проксимальный промотор, коровый промотор) регуляторными элементами. Для правильной работы гена необходимо, чтобы на промотор гена воздействовали только «свои» регуляторные последовательности. Однако регуляторные последовательности не являются абсолютно специфичными. Энхансеры могут активировать не только свой промотор (хотя специальные последовательности-коммуникаторы сильно повышают специфичность энхансера), но и другие доступные промоторы. Это может нарушать правильную регуляцию генов. Отчасти эту проблему помогают решить инсуляторы — последовательности, препятствующие взаимодействию промотора с энхансером. Предполагается, что они способны взаимодействовать друг с другом, образуя независимые транскрипционные домены (Geyer 1997).Неспецифичностью регуляторных элементов в значительной степени объясняется эффект положения — различный уровень экспрессии гена в разном нуклеотидном окружении. Эффект положения наблюдается как при хромосомных перестройках, так и у трансгенов. На уровень экспрессии трансгена влияют: • находящиеся рядом энхансеры и сайленсеры, • уровень конденсированное&tradeхроматина, • эндогенная транскрипция, проходящая через трансген. Принято считать, что инсуляторы способны блокировать эффект положения, так как они блокируют взаимодействие промотора с энхансерами и останавливают распространение конденсированного хроматина, однако их взаимодействие с проходящей через трансген транскрипцией практически не изучено. Неизвестно, препятствует ли взаимодействие двух инсуляторов (и как следствие, образование независимого транскрипционного домена) элонгации транскрипции, которая началась за пределами домена. В первой части данной работы мы исследовали вклад эндогенной транскрипции, проходящей через трансген на примере гена miniwhite, лишенного промотора, а также вклад транскрипции в общий эффект положения на примере гена miniwhite, содержащего функциональный промотор. Мы изучили влияние терминаторов на эффект положения на примере вирусного терминатора транскрипции SV40, а также влияние инсуляторов на примере инсулятора Su (Hw).Во второй части данной работы мы исследовали влияние эффекта положения на свойства регуляторной последовательности En (Hu). Последовательность En (Hu) является частью регуляторной области achaete-scute генного комплекса. В нашей лаборатории были получены данные о том, что эта последовательность, будучи перемещена при инверсии в район регуляторных элементов гена yellow нарушает работу и гена yellow и генов ac-sc локуса. Мы исследовали свойства последовательности En (Hu) в разных трансгенных системах.2 Цели и задачи 2.1 Целями данной работы являлось: • исследование вклада эндогенной транскрипции в эффект положения трансгенов, а также факторов, блокирующих эффект положения, • исследование эффекта положения регуляторной последовательности на примере элемента En (Hu).2.2 Задачи • Изучение влияния эндогенной транскрипции на эффект положения трансгенного гена miniwhite в отсутствие промотора. • Изучение вклада эндогенной транскрипции в эффект положения гена miniwhite, содержащего функциональный промотор. • Изучение влияния терминатора транскрипции SV40 и инсулятора Su (Hw) на эффект положения лишенного промотора гена miniwhite и гена miniwhite, содержащего функциональный промотор. • Изучение влияния эффекта положения на свойства последовательности En (Hu) в различных трансгенных системах. К транс-регуляторным факторам относятся РНК-полимеразабазовые транскрипционные факторы, входящие в состав РНК-полимеразной машиныДНК-связывающие транскрипционные факторы, специфично связывающиеся с последовательностями энхансеров, сайленсеров, проксимальных промоторовАТФ-зависимые хроматин-трансформирующие факторы, которые модифицируют нуклеосомытранскрипционные медиаторы, обеспечивающие взаимодействие между связывающимися с энхансером факторами и базальной транскрипционной машинойбелки, катализирующие ацетилирование, деацетилирование, фосфорилирование, убиквитинилирование и метилирование гистонов и других белков (Burley and Roeder, 1996; Orphanides et al., 1996; Hampsey 1998; Lefstin and Yamamoto, 1998; Myer and Young, 1998; Roeder, 1998; Strahl, 1999; Glass and Rosenfeld, 2000; Lee and Young, 2000; Lemon and Tjian, 2000; Strahl and Allis, 2000; Courey and Jia, 2001; Dvir et al., 2001; Zhang and Reinberg, 2001; Emerson, 2002; McKenna and O’Malley, 2002; Narlikar et al., 2002; Orphanides and Reinberg, 2002) Конечной целью всей регуляции является правильное функционирование промотора. Непосредственно с промотором взаимодействует РНК-полимеразный комплекс перед точкой начала транскрипции. Промотор эукариот состоит из корового промотора (минимально необходимого) и проксимального промотора (регуляторных областей).Коровый промотор обычно находится между —40 и +40 п.н. относительно старта транскрипции. Коровый промотор может содержать последовательности, узнаваемые РНК-полимеразным комплексом — ТАТА-бокс (ТАТА-промоторыBreathnach and Chambon, 1981), DPE последовательность (DPE промоторыBurke and Kadonaga, 1996), MTE последовательность (Lim et al., 2004).Проксимальный промотор содержит сайты связывания для различных транскрипционных факторов и обычно располагается от —40 до -250 п.н. относительно старта транскрипции. (Struhl, 1987; Weis and Reinberg, 1992; Smale, 1997, 2001; Blackwood and Kadonaga, 1998; Bulger and Groudine, 1999; West et al., 2002). Показано, что проксимальный промотор может содержать последовательности-коммуникаторы, отвечающие за взаимодействие промотора со своим энхансером (Костюченко, 2004). К проксимальному промотору можно также отнести цис-регуляторные последовательности у дрожжей, находящиеся на некотором (до 500 п.н.) расстоянии от промотора, выполняющие, скорее, энхансерную функцию (Ruzzi М. et al. 1987).Более удаленные цис-регуляторные элементы — энхансеры (последовательности ДНК, способные активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции) и сайленсеры (последовательности, подавляющие транскрипцию) • могут находиться на расстоянии до десятков тысяч пар нуклеотидов как впереди, так и позади кодирующей части гена (например, 85 т.п.н. между энхансером и промотором гена wing margin локуса cut) (Jack et al. 1991). Впрочем, большие расстояния не являются необходимым условием функционирования этих элементов. И, например, один из энхансеров гена yellow находится в его интроне (Nash and Yarkin, 1974).В настоящее время предложено три модели взаимодействия энхансера с промотором. Все эти модели предполагают, что активаторный белковый комплекс, собирающийся на энхансере, взаимодействует с белковыми компонентами РНК-полимеразной машины. Модель выпетливания (looping) представлена на рисунке 4−1.Модель выпетливания. С энхансер Л С промотор .•,. л: * * * Рисунок 4−1. Модель выпетливания (looping).Согласно этой модели, активаторный комплекс образуется на энхансере, без участия последовательностей промотора. Затем сформированный комплекс сканирует (все последовательности подряд — сканирование, или некоторые точки — скакание) окружающую ДНК в поисках промотора. После связывания активаторного комплекса с промотором ДНК, находящаяся между промотором и энхансером, образует петлю (Ptashne 1986). Эти механизмы не являются обязательными для работы энхансера, но они могут сильно облегчить работу этого элемента, удерживая его рядом с промотором (Blackwood and Kadonaga 1998).Модель выслеживания (tracking) похожа на модель выпетливания (см. рис 4−2). Также как и в модели выпетливания, активаторный комплекс образуется на энхансере, а затем сканирует ДНК в поисках промотора. Однако, в отличие от модели выпетливания, согласно данной модели активаторныи комплекс в процессе сканирования утрачивает связь с энхансером (Bondarenko et al., 2003).Модель выслеживания, а «энхансер промотор и И •*а Д Рисунок 4−2. Модель выслеживания (tracking).Последняя модель — распространяющихся петель (spreading-looping) — предполагает формирование множества маленьких петелек между энхансером и промотором (см. рис. 4−3). Взаимодействие активаторного комплекса с энхансером индуцирует кооперативное связывание и дальнейшую полимеризацию белков на ДНК (это может быть белок, связывающийся с энхансером, или белок, не взаимодействующий с энхансером непосредственно).Модель распространяющихся петель Q «энхансер промотор Рисунок 4−3. Модель распространяющихся петель (spreading-Iooping).Специфичное узнавание энхансером своего промотора обеспечивается различными механизмами. С одной стороны, для связывания с энхансером в проксимальной области промотора находятся специальные последовательности-коммуникаторы (Костюченко, 2004, Костюченко, 2005). Они значительно повышают сродство энхансера к своему промотору. Это позволяет энхансеру избирательно активировать именно свой промотор, а не ближайший. С другой стороны, очень часто в сложно устроенных локусах присутствуют инсуляторы. Инсуляторы — это последовательности, препятствующие взаимодействию промотора и энхансера, когда находятся между ними (Dorsett 1999; Bell et al. 2001). При этом и промотор, и энхансер сохраняют свою активность (Cai and Levine 1995; Scott and Geyer 1995) (см. рис. 4−4A). Также инсуляторы способны определять границы между активным и неактивным хроматином (Bell et al. 2001; Udvardy 1999; Geyer 1997) (см. рис. 4−4B). По современным представлениям неактивный хроматин отличается от активного степенью упаковки ДНК в нуклеосомах. Неактивный хроматин менее чувствителен к обработке эндонуклеазами. Также у него снижен уровень ацетилирования коровых гистонов. Предполагается, что компактная структура хроматина распространяется кооперативно, а для разделения активного и неактивного хроматина должны существовать специальные регуляторные элементы (Farkas et al. 2000).Конденсированный тлП р о м хроматин Инсулетор о т о р К, А X Л, А А а. Энхансер Промотор в Инсулятор • ^ ^ «г—л Рисунок 4−4. Схема работы инсуляторов. А — инсуляторы препятствуют распространению конденсированного хроматина. В — инсуляторы блокируют взаимодействие энхансера и промотора. Еще одним важным фактором, влияющим на экспрессию гена, является его расположение в ядре. Ядро структурно и функционально компартментализовано. Уровень экспрессии гена зависит от того, в каком компартменте ядра он находится (Guasconi et al., 2005).4.2 Инсуляторы В настоящее время достаточное количество инсуляторов описано у позвоночных и, у беспозвоночных животных, а также у грибов. Примеры некоторых инсуляторов, обнаруженных у различных групп организмов представлены в таблице 4-Г. Таблица 4−1. Примеры инсуляторов различных организмов. Название Su (Hw) SCS scs' Fab-7 Fab-8 fcTb UAorpg X-STAR Y'-STAR HMRtKNAlM RO Lys5'A HS4 3'HS HI9 ICR DM1 ароВЗ* apoB5' Организм Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Saccharamyces cerevisiae Saccharamyces cerevisiae Saccharamyces cerevisiae Xenopus laevis Gallus gallus Gallus gallus Gallus gallus Mus musculus Homo sapiens Homo sapiens Размер (т.п.н.) 0.35 0.90 0.50 1.20 0.59 1.30 0.10 0.30 0.14 0.30 1.3 2.9 0.25 0.40 2.0 0.40 0.79 1.80 Местоположение в геноме ретротранспозон gypsy на границах 87А7 hsp70 локуса 3' -регуляторная область abdominal-B локуса 5' - область гена Notch область промотора рибосомальных генов между X и Y субтеломерными повторами на границе HMR локуса в 40S rRNA гене 5' - область гена лизоцима рядом с кластером р-глобиновых генов между Р-глоби-новым кластером и OR геном 5' - область HI9 гена между DMPK и S1X5 генами в 5' и З1 области гена аполипопротеин В Авторы Geyer and Corces 1992 Kellum and Schedl 1992 Zhaoetal. 1995 Hagstrom et al. 1996 Mihalyetal. 1997 Vazquez and Schedl 2000 Bi and Broach 1999 Foureletal. 1999 Donzeetal. 1999 Robinett et al. 1997 Bell etal. 1999 Belletal. 1999 Chung etal. 1993 Pikaartetal. 1998 Belletal. 1999 Chung etal, 1993 Bell and Felsenfeld 2000 Hark et al. 2000 Fillipovaetal. 2001 Antes etal. 2001 4.2.1 Инсуляторы позвоночных Наиболее изученным инсулятором позвоночных является инсулятор [3-глобинового кластера курицы. Р-глобиновый кластер курицы на 5'-конце содержит последовательности различных Р-глобиновых генов и энхансеры, регулирующие функционирование этих генов, и отгорожен от гетерохроматина 5'HS4 инсулятором, а с З'-конца инсулятором 3'HS — от генов обонятельных рецепторов (COR гены) (см. рис. 4−5) (Gaszner and Felsenfeld, 2006).5'HS4 предотвращает распространение гетерохроматина на район Р-глобинового кластера. Также он обладает энхансер-блокирующими свойствами (Chung et al., 1993) В глобиновые гены Р 6h 6а С _ _ CORs —• i—"• i—*• |—*• Д |—*» |—> CTCF Рисунок 4−5. Строение Р-глобинового локуса. Энхансер-блокирующая и барьерная активность 5'HS4 инсулятора зависит от разных белков и состояния хроматина. Так, на энхансер-блокирующую активность влияет связывание белка CTCF, а барьерные функции зависят от ацетилирования окружающих гистонов (Burgess-Beusse et al., 2002). Белки USF1 и USF2, сайты связывания для которых не пересекаются с сайтами связывания для белка CTCF (Mutskov et al., 2002; West et al., 2004) привлекают ацетилазы к FIV сайту инсулятора. Второй пример инсулятора позвоночных — еще один CTCF-зависимый инсулятор 1CR/DMR находится между hl9 и igf2 генами мыши. Подобный инсулятор был обнаружен и у человека (Engel, Bartolomei, 2003) (рис 4−6).Конденсир ов энный хроматин т т Инсулятор CTCF DMR DMR2 DMR1 CTCF — [ DMR1 ] — I g f 2 — [ DMR2 ]•(DMR ]•[ H19 Энхансер Материнская хромосома CHo CHg CHg CH3 CHg CH3 Энхансер Отцовская хромосома Рисунок 4−6. Схема строения Iil9ligf2 локуса. Ген ig/2 находится на расстоянии 90 т.п.н. от гена hl9. Ген hl9 экспрессируется только на материнской хромосоме, а ген ig/2 только на отцовской. Оба гена активируются с помощью одного общего энхансера, который находится за геном hl9 (Verona et al., 2003).Работа энхансера регулируется элементом ICR/DMR, который содержит множество сайтов связывания для белка CTCF и выполняет функции инсулятора. Помимо элемента ICR/DMR, располагающегося между энхансером и промоторами генов, существуют еще несколько элементов ICR/DMR (DMR1 и DMR2), наличие которых необходимо для правильного функционирования гена ig/2 (Lopes et al., 2003). ICR/DMR взаимодействует с DMR последовательностью в зависимости от степени метилирования последовательности DMR. В аллеле, унаследованном от матери, сайт СССТС неметилирован, с ним связывается CTCF и блокирует промотор гена Ig/2 от удаленного энхансера, экспрессии гена не происходит. В отцовском варианте аллеля, наоборот, метилированое состояние сайта не позволяет белку CTCF взаимодействовать с ДНК, что приводит к активации транскрипции энхансером (Brasset et al., 2005; Bell, Felsenfeld, 2000; Engel et al., 2004; Hark et al., 2000; Holmgren et al., 2001; Kanduri et al., 2000; Szabo et al., 2000).Элементы ICR/DMR, DMR1 и DMR2 взаимодействуют друг с другом и образуют петли, которые отличаются друг от друга на отцовской и материнской хромосоме (Kato, Sasaki, 2005; Murrell et al., 2004). На отцовской хромосоме элемент DMR2 взаимодействует с элементом ICR/DMR, облегчая тем самым взаимодействие промотора гена igf2 с энхансером. На материнской хромосоме элемент DMR1 взаимодействует с неметилированным ICR/DMR элементом, формируя петлю, которая изолирует ген igf2 от энхансера (рис. 4−7).Отцовская хромосома Энхансер Материнская хромосома Энхансер Рисунок 4−7. Схема образования петель на материнской и отцовской хромосомах hl9ligf2 локуса.4.2.2 Инсуляторы дрозофилы Инсуляторы генов теплового шока Дрозофила — наиболее изученный из всех беспозвоночных организм, поэтому у нее обнаружено наибольшее количество инсуляторов. Первые два инсулятора — scs и scs'-были описаны в 1991 году у Drosophila melanogaster (Kellum and Shedl, 1991). Эти инсуляторы окружают локус 87А7, содержащий гены теплового шока, scs и scs' находятся на границе эуи гетерохроматина, а также обладают энхансер-блокирующими свойствами (Kellum and Shedl, 1991). Также эти инсуляторы содержат в себе промоторы генов. Так, scs-инсулятор содержит промотор гена cg31211, scs' - промоторы двух разнонаправленных генов (cg3281 и aurora) (Avramova and Tikhonov, 1999; Glover et al., 1995).Известны белки, которые взаимодействуют с инсуляторами scs и scs'. С инсулятором scs взаимодействует белок Zeste-white 5 (Zw5). Он содержит 8 доменов типа цинковые пальцы и взаимодействует с 24-нуклеотидной последовательностью в инсуляторе scs in vitro. Мультимеризация сайтов связывания для белка Zw5 позволяет получить искусственный инсулятор. Мутация в гене zw5 приводит к частичной инактивации инсуляторной активности данной последовательности и вызывает нарушения в развитии глаз (Gazner et al., 1999).Белок BEAF-32 взаимодействует с инсулятором scs' (Hart et al., 1997), связываясь с последовательностью CGATA (Cuvier et al., 1998). Этот белок существует в двух изоформах, которые отличаются ДНК-связывающими N-концевыми доменами. С-концевые домены, отвечающие за связывание этого белка с другими белками, у них одинаковые. С теми же сайтами, что и BEAF-32, и по всей вероятности конкурентно, связывается белок DREF (Hart et al, 1999).Сайты связывания всех перечисленных белков находятся очень близко от промоторов, которые находятся внутри инсуляторов scs и scs'. Вероятно, это расположение связано с участием этих белков в регуляции работы промоторов. (Geyer and Clark, 2002).Инсуляторы Bithorax комплекса Гомеозисные гены важны для правильного образования парасегментов личинки дрозофилы. Эти гены собраны в два локуса Antennappedia и Bithorax. Комплекс Bithorax длиной около 300 т.п.н. состоит из трех генов ultraBithorax, abdominal-A и abdominal-B (Duncan, 1987), а также протяженной регуляторной области, содержащей регуляторные элементы, обеспечивающие активацию этих генов в правильных сегментах. Регуляторная область содержит тканеспецифичные энхансеры (iab) — последовательности-коммуникаторы, облегчающие энхансеру взаимодействие с промотором (PTS) — последовательности, узнаваемые белками группы Polycomb (PRE Polycomb responsible elements) — последовательности, узнаваемые белками группы Trithorax (TRE — Trithorax response element) — инсуляторы (Sipos, Gyurkovics, 2005) (см. рис. 4−8).В регуляторной области гена abdominal-B были найдены инсуляторы Fab-7, Fab-8 и МСР, которые разделяют энхансеры и сайленсеры, обеспечивающие правильную активацию гена (рис.6) (Mihaly et al. 1998).М (Р Fab-6? Fab-7 FaD-8 Р и с у н о к 4−8. С х е м, а строения регуляторной о б л, а с т и abdominal-B. Р е г у л я т о р н, а я о б л, а с т ь состоит из 4 энхансеров iab-5, iab-6, iab-7, iab-8, которые отделены друг от друга граничными элементами МСР, Fab-7, Fab-8, к ним примыкают последовательности, взаимодействующие с белковым комплексом Polycomb (PRE) и последовательности, облегчающие взаимодействие энхансеров со своим промотором. Исследованная последовательность МСР (800 п.н.) проявляет свойства инсулятора и сайленсера (Karch et al., 1994; Mihaly et al., 1998). Внутри этой последовательности был выделен фрагмент 138 п.н., проявляющий только свойства сайленсера. Сайленсерный элемент включает четыре сайта для связывания для белка РНО и два сайта связывания для белка GAGA. Оба этих белка необходимы для проявления последовательностью сайленсерной активности (Busturia et al., 2001).К сайленсерной последовательности примыкает последовательность, проявляющая только инсуляторные свойства (340 п.н.) (Gruzdeva et al., 2005). Для обеспечения инсуляторной активности необходимы сайты связывания для белка GAF. Последовательность 210 п.н. внутри 340 п.н. элемента МСР, проявляет себя как слабый энхансер. Эта же последовательность необходима для ориентационно-зависимого спаривания МСР элементов (Kyrchanova et al., 2007).Инсулятор Su (Hw) Инсулятор Su (Hw) был обнаружен в регуляторном районе ретротранспозона МДГ4 (Geyer and Corces, 1992). Последовательность этого инсулятора состоит из 12 повторов — сайтов связывания белка Su (Hw), необходимого для инсуляции (Mazo et al. 1989). Структура белка Su (Hw) представлена на рисунке 4−9. N-концевой домен Цинковые пальцы Глутамин-богатый домен Рисунок 4−9. Схема доменной структуры белка su (Hw).12 «цинковых пальцев» необходимы для связывания ДНК. Причем они отличаются по силе взаимодействия, поэтому их условно можно разделить на необходимые для связывания, стабилизирующие, ненужные и ингибирующие (Kim et al., 1996). Домен «лейциновая молния» на С-конце белка необходим для блокирования энхансера (Harrison e ta l, 1993; Kim etal., 1996).На политенных хромосомах для белка Su (Hw) практически везде показана колокализация с белком Mod (mdg4)-67.2 (Gerasimova, 1998), что предполагает ключевую роль белка Mod (mdg4)-67.2 в формировании инсуляторного комплекса. Третьим, недавно открытым компонентом Su (IIw) инсулятора, является белок СР190 (Centrosomal Protein 190). На политенных хромосомах белок СР190 колокализуется с белком Su (Hw). СР190 способен непосредственно взаимодействовать с белками Su (Hw) и Mod (mdg4)-67.2 (Pai et al., 2004).Кроме инсулятора gypsy в геноме были охарактеризованы другие элементы, связывающие белок Su (Hw). Так, первый эндогенный 8и (Ну)-зависимый инсулятор — 1А2 — был идентифицирован между геном yellow, ответственным за пигментацию кутикулярных структур дрозофилы, и achaete-scute генным комплексом, участвующим в регуляции развития нервной системы (Parnell et al., 2003). Этот инсулятор содержит два сайта связывания для белка Su (Hw). При этом для инсуляции необходимы как сами сайты связывания белка Su (Hw), так и окружающие их последовательности, что можно объяснить тем, что для активности 1А2 инсулятора требуется кооперация Su (Hw) с другими, пока не идентифицированными, ДНК-связывающими белками.4.3 Терминация транскрипции Терминация транскрпиции играет важную роль в экспрессии генов. С одной стороны правильная терминация не позволяет транскрипции распространяться на соседние районы, и тем самым нарушать регуляцию ниже лежащих генов (Greger and Proudfoot, 1998). С другой стороны, она дает возможность РНК-полимеразе II диссоциировать с ДНК для нового акта транскрипции.3' концевые области генов, кодирующих белки, за исключением гистоновых генов, содержат сигнал полиаденилирования, необходимый для последующего формирования 3' конца. Сигнал полиаденилирования состоит из консервативной последовательности с 5' стороны от точки полиаденилирования — гексамера AAUAAA и вариабельного GU-богатого района с 3' стороны. Место разрезания транскрипта находится между гексамером AAUAAA и GU-богатой областью обычно после динуклеотида С А. К образовавшемуся 3' концу присоединяется поли-А последовательность, которая во многих случаях предохраняет РИК от расщепления экзонуклеазами, помогает экспорту РНК в цитоплазму (Huang and Carmichael, 1996) и оптимизирует трансляцию (Kahvejian et al., 2005).Многократно было показано, что поли-А последовательность необходима для нормальной терминации транскрипции. (Connelly and Manley, 1988; Edwalds-Gilbert et al., 1993; Birse et al, 1998; Proudfoot, 2004).У дрожжей термннация транскрипции полимеразы II происходит сразу за сигналом полиаденилирования (Hyman and Moore, 1993; Birse et al., 1998). Однако у высших эукариот транскрипция заканчивается на разных расстояниях от точки полиаденилирования (Proudfoot, 1989).Например, термннация транскрипцип человеческого гена белка С2 системы комплемента происходит практически сразу за сигналом полиаденилирования (Ashfield et al. 1991). И наоборот, транскрипция ри еглобиновых генов заканчивается на расстоянии нескольких сотен пар нуклеотидов от сайта полиаденилирования (Dye and Proudfoot, 2001).Наиболее известны две модели механизма терминации — анти-терминатор и торпедо. Модель анти-терминатор (см. рис 4−10) предполагает существование белков, предотвращающих терминацию за счет взаимодействия с РНК полимеразным комплексом во время элонгации транскрипции. (J РНК-полимераза II I I Cap-присоединяющий фактор (^ D Фактор элонгации Фактор терминации Рисунок 4−10. Анти-терминаторная модель терминации транскрипции. Диссоциация анти-терминаторных белков происходит сразу после прохождения полимеразой сигнала полиаденилирования. Она приводит к дестабилизации связи полимеразы II с ДНК и, как следствие, последующей терминации (Logan et al., 1987). Или наоборот, дестабилизацию комплекса ДНК-полимераза вызывает присоединение фактора терминации после прохождения полимеразой сигнала полиаденилирования. Самым известным примером такой схемы является р-зависимая терминация у прокариот, однако и у эукариот известно множество примеров реализации этой модели. Например, человеческий белок РС4 действует как антитерминатор (Calvo and Manley, 2001).Диссоциация этого белка из комплекса элонгации в районе сайта полиаденилирования увеличивает вероятность терминации транскрипции (Ann et al., 2004; Kim et al., 2004a).Более того, многочисленные исследования показывают, что состав комплекса элонгации до и после сайта полиаденилирования сильно отличается (Ahn et al., 2004; Kim et al., 2004a).Вторая модель — Торпедо — предполагает, что после расщепления мРНК факторами полиаденилирования полимеразный комплекс продолжает транскрипцию. Образующаяся при этом РНК деградирует под действием экзонуклеазы. После того, как экзонуклеаза приблизится к полимеразному комплексу, происходит диссоциация последнего (см. рис. РА RNApll Факторы полиаденилирования Расщепление факторами полиаденилирования Образование мРНК Rat1/Xrn2 РА 5'-3» деградация РНК • ч • • / «• Д RNApll) *Ш ^-^__^^ Диссоциация РНК-полимеразы Рисунок 4−11. Модель терминации Торпедо. После расщепления РНК факторами полиаденилирования транскрипция продолжается. Специфические экзонуклеазы расщепляют оставшуюся РНК и способствуют диссоциации РНК-полимеразы П. Приближение экзонуклеазы к элонгационному комплексу вызывает конформационные изменения, которые приводят к освобождению полимеразы II с матрицы ДНК (Connelly and Manley, 1988; Proudfoot, 1989). Белки — компоненты модели Торпедо были обнаружены у дрожжей и у человека. Известная у человека 5'-3' экзонуклеаза Хгп2 необходима для эффективной терминации транскрипции Р-глобинового гена (Teixeira et al., 2004). Новосинтезированная РНК в этом районе образует третичную структуру с рибозимными свойствами. Этот рибозим разрезает РНК по сайту котранскрипционного расщепления, а образовавшийся конец подвергается расщеплению с помощью Хгп2. Более типичный пример — дрожжевая экзонуклеаза Rati.-Для нее также необходим вспомогательный белок Rttl03, способный связывать регуляторный домен полимеразы II и привлекать к нему Rati (Kim et al., 2004b).Многочисленные экспериментальные данные показывают, что в действительности механизм терминации, скорее всего, объединяет обе модели. Для обеих моделей важным условием эффективной терминации является прохождения транскрипции через сайт полиаденилирования. Не менее существенную роль играют последовательности ниже сигнала полиаденилирования. У высших эукариот таких последовательностей в настоящее время охарактеризовано не очень много в силу их значительной вырожденности. Тем не менее, они, вероятно, присутствуют у большинства генов. (Citron et al., 1984; Hagenbuchle et al, 1984; Ashfield et al., 1991; Enriquez-Harris et al., 1991; Dye and Proudfoot, 2001).4.4 Эффект положения Уровень экспрессии эукариотических генов в значительной степени зависит от irx положения на хромосоме. Это явление получило название «эффект положения» '— различная активация гена в различном нуклеотидном окружении (Sturtevant 1925; Dobzhansky 1936; Lewis 1950). Изменение положения гена может происходить как в результате хромосомных перестроек, так и при образовании трансгенов. Выделяют два вида этого явления — стабильный и соматически вариабельный. Соматически вариабельный эффект положения (в англоязычной литературе position effect variegation или PEV) наблюдается в том случае, когда ген оказывается в гетерохроматине рядом с границей между эуи гетерохроматином. Фенотипическое проявление гена в этом случае оказывается мозаичным, то есть он будет активироваться только в части клеток. В настоящее время предложено несколько моделей, объясняющих это явление (Henikoff, 1994), однако к нашей работе этот вид эффекта положения отношения не имеет, поэтому мы не будет останавливаться на нем подробно. Соматически стабильный эффект положения не приводит к образованию мозаичного фенотипа, и обычно ген одинаково активирован во всех клетках ткани.4.4.1 Генетически запрограммированные хромосомные перестройки Как было уже сказано, эффект положения может проявляться в результате хромосомных перестроек или у трансгенов. Давно известно, что хромосомные перестройки часто приводят к изменению уровня экспрессии генов рядом с ними (Pays and Steinert, 1988; Schneuwly et al., 1987). Эти перестройки могут быть не только случайными, но и происходить в результате генетически запрограммированных процессов. Известные тому примеры — перестройки, приводящие к образованию генов иммуноглобулинов (Gillies et al 1983) и гомологичная рекомбинация в МАТ-локусе дрожжей (Sprague et al, 1983).Активные иммуноглобулиновые гены образуются в результате рекомбинации, по механизму сходной с вырезанием транспозонов. В процессе рекомбинации фрагменты кодирующей части такого гена объединяются и приближаются к промотору. По окончании этого процесса промотор становится активным. Образование двух типов гамет у дрожжей (а и а) определяется соответствующим состоянием локуса МАТ. В локусе МАТ находится в активном состоянии один из генов — а или а. Замещение гена, а на, а и наоборот происходит с помощью гомологичной рекомбинации между МАТ локусом и одним из двух локусов HMR или HML. Локусы HMR и HML представляют собой неактивный хроматин, отграниченный от остального хроматина инсуляторами (Donze et al., 1999; Bi and Broach, 2001) В результате такой рекомбинации в МАТ локус переносится и активируется ранее неактивный ген.4.4.2 Спонтанные хромосомные перестройки Спонтанные хромосомные перестройки часто связаны с активацией мобильных элементов. Перемещения мобильных элементов способны довольно сильно изменять активность генов. Во-первых, инсерции и вырезания транспозонов могут изменять расстояния между геном и его регуляторными последовательностями. Во-вторых, индуцируемые мобильными элементами транслокации, инверсии и делеции различной длины могут в значительной степени изменить нуклеотидное окружение гена. В результате этого значительное количество регуляторных последовательностей может утратить контакт со своим геном (Головнин и др., 2000). В-третьих, внутренние последовательности транспозонов могут обладать энхансерными или инсуляторными свойствами и таким образом активировать или репрессировать находящиеся рядом гены (Errede et al, 1987;Geyer and Corces, 1987;Geyer et al, 1988).4.4.3 Трансгены Если на активность генов при хромосомных перестройках влияет множество факторов, и не всегда можно выделить определяющий, то влияние различных условий на активность трансгенов легче поддается изучению. Уровень экспрессии трансгена в большой степени зависит от его положения на хромосоме и нуклеотидного окружения, даже если трансген содержит полноценный промотор, энхансер и другие необходимые регуляторные элементы. Эффект положения был обнаружен и в культурах клеток, и у трансгенных животных (Kucherlapati and Skoultchi, 1984; Palmiter and Brinster, 1986; Nagy et al, 1985; Jones et al, 1985; Scholnick et al, 1983; Spradling and Rubin, 1983; Goldberg et al, 1983).4.4.4 Последовательности, влияющие на эффект положения На уровень экспрессии трансгена могут влиять находящиеся вблизи различные регуляторные последовательности — сайленсеры и энхансеры, а также состояние хроматина (Winoto and Baltimore, 1989; Atchison, 1988). Однако следует учитывать, что многие регуляторные элементы более или менее специфичны по отношению к своему промотору, и с гетерологичньш промотором могут взаимодействовать менее эффективно (Костюченко и др., 2004).Таким образом последовательности, препятствующие взаимодействию промотора с энхансером, должны нивелировать эффект положения трансгенов. Также эффект положения должны подавлять последовательности, останавливающие распространение гетерохроматина (Henikoff, 1994). Такими последовательностями являются инсуляторы. Действительно, для некоторых пнсуляторов была показана способность предотвращать появление эффекта положения. Например, было показано, что дрозофилиные инсуляторы scs и scs' способны устранять эффект положения трансгенного miniwhite, если расположены вокруг него (Kellum and Schedl, 1991). Похожие данные были получены для инсулятора р-глобинового локуса кур 5'HS4. Также 5'HS4 инсулятор эффективно блокирует эффект положения в различных частях генома, однако эта способность связана не только с сайтами связывания белка CTCF. Для него необходимы другие последовательности этого инсулятора. Частичное удаление их приводит к значительной потере способности блокировать эффект положения (Recillas-Targa et al, 2002; Rincon-Arano et al, 2007). Сходными свойствами обладают последовательности MAR (matrix-associated regions) у различных организмов (2007; Van Leeuwen et al, 2001; Nowak et al 2001; Attaletal, 1995;1996).Инсулятор Su (Hw) из ретротранспозона gypsy способен блокировать эффект положения, а также препятствовать распространению гетерохроматина, на границе с которым находится трансген. Это было показано на трансгенной системе, состоящей из гена miniwhite и двух пнсуляторов Su (Hw), находящихся справа и слева вокруг него (Roseman R.R. etal, 1993).Описанные последовательности в геноме окружают локус с находящимися внутри генами и их регуляторными последовательностями и отгораживают его и от других регуляторных элементов, и от гетерохроматина. Таким образом, образуются домены, транскрибирующиеся независимо от соседних областей (Глазков 1998, Udvardy 1999; Mongelard and Corces 2001).По всей видимости, белки инсулятора связываются с белками ядерной оболочки или белками ядерного матрикса, при этом ДНК между инсуляторами образует петли, составляющие независимые домены транскрипции (Gerasimova and Corces 1998; Gerasimova et al. 2000). Например, белок Su (Hw) локализуется в ядре вместе с белком ламины, являющимся структурным компонентом ядерного матрикса. При этом наблюдается большая агрегация белка Su (Hw) на периферии ядра, что было интерпретировано, как объединение большого количества Su (Hw) инсуляторов (Gerasimova et al. 2000). Предпогагается, что взаимодействия между энхансерами и промоторами, находящимися в разных петлях, затруднены. Таким образом, возможно, инсуляторы способны образовывать независимо транскрибирующиеся домены, внутри которых на промотор не действуют находящиеся снаружи регуляторные элементы. По мнению ряда авторов, этого достаточно для блокирования эффекта положения у трансгенов.5 Материалы и методы 5.1 Характеристика объекта исследования Плодовая мушка Drosophila meianogaster — удобный объект для изучения регуляции транскрипции генов. Геном Drosophila meianogaster полностью отсеквенирован. Помимо этого, Drosophila meianogaster является хорошо разработанным генетическим модельным организмом, у которого обнаружено огромное количество мутаций и разработана система балансерных хромосом, значительно упрощающих генетические скрещивания. Таким образом, хорошая изученность объекта в сочетании с коротким жизненным циклом предоставляют широкие возможности для использования его в изучении регуляции экспрессии генов. Свойства Drosophila meianogaster, использованные в работе: 1. Уровень экспрессии ряда генов Drosophila meianogaster можно оценивать визуально. Эти данные легко сравнивать с результатами, полученными ранее в нашей или в других лабораториях. Стандартами могут служить аллели гена с известными фенотипами или фотографии мух, которые современная техника позволяет делать достаточно качественными.2. Достаточно хорошо разработана система получения мутаций в определенных генах, что позволяет установить функцию белка, который кодируется данным геном.3. В геном Drosophila meianogaster можно встраивать генетические конструкции, несущие исследуемые регуляторные элементы. Так, можно выяснить влияние определенного гена на функционирование регуляторного элемента в зависимости от расположения его в геноме. При помощи сайт специфических рекомбиназ можно вырезать регуляторные элементы из генетических конструкций in vivo. Это позволяет изучить влияние этих регуляторных элементов на эффект положения.5.2.1 Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе Обозначения аллелей даны согласно принятой символике (Lindsley and Zimm, 1992).Линии Drosophila melanogaster: 1. у 1wu — лабораторная линия, несущая мутацию гена yellow с нарушенным инициаторным кодоном и мутацию гена white, представляющую собой делецию значительной его части.2- у''wйСуо, Р/w4 CreJ/Sco — линия — источник сайт-специфической рекомбиназы CRE.3. у ас — лабораторная линия, несущая большую делецию, включающую в себя ген yellow и значительный район ac-sc комплекса.4. у 'w1118, GAL4/Tm6 — линия — источник белка транскрипционного активатора GAL4 5.2.2 Фенотипический анализ экспрессии генов Ген yellow определяет пигментацию тела, крыльев и щетинок. Экспрессия этого гена контролируется тремя тканеспецифичными энхансерами (Geyer and Corces, 1987).Энхансеры, которые определяют экспрессию гена в кутикуле тела и крыловых пластинах, расположены перед промотором гена. Энхансер, который определяет экспрессию гена yellow в щетинках, расположен в интроне гена yellow, ниже точки начала транскрипции. Уровень экспрессии гена yellow прямо коррелирует с интенсивностью пигментации. Так, можно определять степень экспрессии гена yellow с помощью визуального анализа фенотипа. Для анализа фенотипов трансгенных мух использовали 3−5 дневных самцов, результаты сравнивали с мухами контрольных линий с известным фенотипом. Уровень пигментации тела и крыльев оценивался визуально согласно работе Gause et al., 1998 по пятибальной шкале, где 1 соответствует отсутствию пигмента (у1 аллель — полная инактивация гена yellow), 5 — уровню пигментации мух дикого типа (линия Oregon).Ген white определяет пигментацию глаз и семенников мухи (Pirrotta et al., 1985).Пигментацию глаз оценивали в соответствии со следующей шкалой: белые (аллель w — полная инактивация гена white), светло-желтые, желтые, темно-желтые, оранжевые, ярко-оранжевые, коричневые, коричнево-красные, красные (уровень пигментации дикого типа).Генетическая конструкция совместно с плазмидой-источником транспозазы инъецировались в линию y’w11 на стадии пребластодермального эмбриона (Rubin and Sprandling, 1982). Выжившие мухи были скрещены с линией y! wI!I8. Трансгенные мухи были отобраны на основе фенотипического проявления экспрессии маркерного гена white или yellow. Количество копий было определено методом Саузерн-блот-гибридизации, с использованием в качестве проб фрагментов генов yellow и white. Для исследования брались только линии, содержащие одну копию конструкции на геном.5.4 Биохимические методы 5.4.1 Полимеразная цепная реакция Для получения амплифицированных последовательностей ДНК был использован метод ПЦР (Erlich, 1989). Для ПЦР использовали 10х PCR-буфер следующего состава: 0.1 М Tris-HCl, рН 8,6, 0,5 М КС1, 25 мМ MgCl2, 1% Triton Х-100. Реакцию проводили в lx PCR-буфере с добавлением dNTPs до 0,1 мМ, праймеров до 0,2 мкМ, полимеразы Taq до 0.05 ед/мкл, 50нг ДНК. В работе были использованы следующие праймеры: Название праймера mw-ATG mw-rev 2 mw-33 № 401 № 395 y-Bam U5 Последовательность 5'-3' ggcaatgggccaagaggatc gttcctatagatcaagtg ctccaagcggtttacgcc aagattcgcagtggaaggctgcac tccgcacacaacctttcctctcaac tccaggacaaagggtggatcc gcctatatccacggcaatgttagc 5.4.2 Приготовление компетентных клеток и трансформация. Выделение плазмидной ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез Использовали методики, описанные в Sambrook et al., 2001 и на сайте www.molbiol.edu.ru.Элюциго ДНК из геля проводили с использованием GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) по протоколу производителя. Использовались ферменты фирм Fermentas с соответствующими буферами.5.4.3 Получение генноинженерных конструкций Конструкция А271 Делеция А271 была получена с помощью обработки плазмиды pCaSPeW15 рестриктазами Aflll и EcoRI. Полученный фрагмент был клонирован по сайту Smal в вектор pCt, содержащий маркерный ген yellow. Конструкция А171 Делеция А171 была получена с помощью амплификации 5'-области гена miniwhite с использованием праймеров mw-ATG и mw-rev 2. Полученный фрагмент заклонировали в pSK по сайту узнавания рестрнктазой EcoRV, затем переклонировали в pCaSPeW15 по сайтам PstI и Aflll. Полноразмерный ген miniwhite (bAlY) был обработан рестрнктазой EcoRI и клонирован по сайту Smal в вектор pCt. Конструкции АЗЗ и Su («Hw)-A33 Делеция АЗЗ была получена с помощью амплификации 5'-области гена miniwhite с использованием праймеров mw-ЗЗ и mw-rev 2. Полученный фрагмент заклонировали в pSK по сайту узнавания рестрнктазой EcoRV, затем переклонировали в pCaSPeW15 по сайтам PstI и Aflll. Полноразмерный ген miniwhite (A33) был обработан рестрнктазой EcoRI и клонирован по сайту Smal в вектор pCt. Конструкция Su (Hw)-A33 была получена из конструкции АЗЗ путем клонирования в нее по сайту Xbal последовательности Su (Hw), окруженной 1ох-сайтами.Конструкции GAL4-A33. GAL4-A33-Su (Hw GAL4-A33-SV40. GAL4-A33-EnffluVdir и GAL4-A33-EnfHu)-rev Для получения конструкции GAL4-A33, UAS промотор был вырезан из плазмиды pPUAST по сайтам BamHI и Hpal и заклонирован в pSK-lacZ по сайтам BamHI и EcoRV. Затем ген mwA33 был вырезан из pGEM по сайтам BamHI и Xbal и заклонирован в плазмиду yellow-рСТ по сайтам Xbal и Аог. Затем UAS промотор-lacZ был вырезан по сайтам BamHI и Hindi и клонирован в плазмиду mwA33- yellow-pCT по сайту Xbal. Конструкции GAL4-A33-Su (Hw), GAL4-A33-SV40, GAL4-A33-En (Hu)-dir и GAL4-A33En (Hu)-rev были получены путем клонирования в конструкцию GAL4-A33 по сайту Xhol последовалельностей Su (Hw)-lox, SV40-lox, En (Hu)-lox (в двух ориенациях).Конструкция mw, Su (Hw)-mw и SV40-mw В качестве конструкции mw был использован pCaSPeR3. Для получения конструкции Su (Hw)-mw в pCaSPeR3 по сайту ХЬаТ была заклонирована последовательность Su (Hw), окруженная lox-сайтами.Конструкция SV40-mw была создана аналогично. Конструкция En (w)-En (Hu)-mw Регуляторная последовательность гена white длиной 700 п.н., содержащая энхансер гена white, была любезно предоставлена доктором V.Pirrotta. Эта последовательность была заклонирована в pCaSPeR3 по сайту Xbal (pCaSPeR3-En). Последовательность En (Hu), окруженная lox-сайтами, была заклонирована в pCaSPeR3-En по сайту узнавания рестриктазой BamHI. Конструкции EnfHu)-y-dir и En (Hu)-y-rev Для получения конструкций En (Hu)-y-dir и En (Hu)-y-rev в вектор pCaSPeR2K4y, содержащий кодирующую часть гена yellow по сайту узнавания рестриктазой Spel, была заклонирована в двух ориентациях последовательность En (Hu), окруженная lox-сайтами (pCaSPeR2i<4yEn (Hu)). Затем, в полученную плазмиду по сайтам BamHI и Xbal была заклонирована регуляторная последовательность гена yellow, содержащая промотор и энхансеры, активирующие ген в теле и крыльях. Полученный ДНК фрагмент секвенировали с использованием одного из праймеров, участвующего в амплификации. После определения нуклеотидной последовательности ДНК фрагмента, её вносили в программу поиска нуклеотидных последовательностей в геноме Drosophila melanogaster и, таким образом, определяли место встройки трансгенной конструкции в геном.5.4.6 Получение последовательностей кДНК генов Для получения последовательностей кДНК гена yellow была выделена тотальная РНК из линий En (Hu)-y-dir, En (Hu)-y-dir dCre и En (Hu)-y-rev при помощи реагента TRIZOL по рекомендациям производителя (Invitrogene). Получение кДНК производили с помощью набора реактивов фирмы Fermentas (RevertAid Н minus first strand cDNA synthesis kit) no рекомендациям производителя. Для реакции брали 1мкг тотальной РНК и 0.5 мкг праймера олиго-dT.5.4.7 Саузерн-блот анализ Выделенную геномную ДНК дрозофилы обрабатывали рестрицирующими эндонуклеазами в стандартных условиях, потом разделяли в горизонтальном 0,7% агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере (ТАЕ: 40 мМ трис-HCl, рН 7.6- 5 мМ ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА). В качестве маркера молекулярного веса фрагментов ДНК использовался GeneRuller м Ladder Mix (Fermentas). Затем гель депуринизировался экспозицией на трансиллюминаторе втечение 3−5 мин. при коротковолновом (длина волны 254 нм) UV-освещении. Капиллярный перенос проводился в течение 12−18 ч. на мембрану Hybond-N+, для переноса использовался 0.4 н NaOH. Затем фильтр нейтрализовался ополаскиванием в 5х SSC в течение 1−3 мин.5.4.7 Секвенирование Секвенирование проводилось с помощью автоматического секвенатора ЦКП «Геном».6 Результаты 6.1 Влияние эндогенной транскрипции на эффект положения Для изучения эффекта положения мы использовали ген miniwhite Drosophiia melanogaster. Ген white Drosophiia melanogaster отвечает за пигментацию глаз и семенников. Он контролируется тканеспецифичными энхансерами, обеспечивающими экспрессию гена в глазах и семенниках мух. Ген white начинает экспрессироваться на личиночной стадии (Hiebert and Birchler, 1992; Davison et al, 1985). В присутствии энхансера глаза мух окрашены в ярко-красный цвет, в отсутствие — темно-желтый или оранжевый (Pirrotta et al, 1985). В нашей лаборатории были получены данные, указывающие на то, что ген miniwhite способен экспрессироваться в генноинженерных конструкциях в отсутствие промотора, хотя и с небольшой вероятностью. Ген miniwhite был получен in vitro путем делеции значителыюй части первого интрона гена white и также как и ген white отвечает за пигментацию глаз. Ген miniwhite также способен активироваться энхансером white (Qian and Pirrotta, 1995). Мы предположили, что такая активация связана с эндогенной транскрипцией и исследовали это явление.

1. Было показано, что трансгенный ген miniwhite, лишенный промотора, может активироваться за счет эндогенной транскрипции, сонаправленно проходящей через него.2. Бьшо показано, что инсулятор Su (Hw) в составе генно-инженерных конструкций не препятствует активации трансгена miniwhite за счет эндогенной транскрипции.3. Было показано, что эндогенная транскрипция вносит значительный вклад в эффект положения трансгенного гена miniwhite.4. Было показано влияние эффекта положения на регуляторную последовательность En (Hu), которое выражается в том, что En (Hu) в разных трансгенных системах проявляет различные свойства — энхансера, терминатора и источника сайтов сплайсинга.