Клещевой энцефалит (КЭ) — природно-очаговое заболевание, широко распространенное на территории Европы, Западной и Восточной Сибири, а также на Дальнем Востоке. В эндемичных регионах ежегодно регистрируется от 5 до 100 случаев КЭ на 100 000 населения. Наибольшее количество заболеваний приходится на лихорадочную и менингеальную формы (от 80 до 90 и более процентов). На долю очаговых форм приходится меньшая часть заболеваний (1−10%), но это наиболее тяжелая форма с летальностью от 10 до 12% и высокой степенью инвалидизации больных (до 30%).
Эффективным средством профилактики КЭ является вакцинация. Несмотря на многолетнее успешное применение инактивированных цельновирионных вакцин против КЭ, заболеваемость КЭ как в России, так и за рубежом продолжает нарастать. Наблюдается расширение ареала распространения вируса КЭ (ВКЭ), изменение пространственной структуры нозоареала КЭ, появление случаев атипичного течения заболевания с выраженным геморрагическим синдромом и увеличение числа тяжелых форм.
Тем не менее, одной из основных форм проявления инфекционного процесса при КЭ (до 95% в отдельных регионах) является инаппарантная. Клинически она не диагностируется. Факты изоляции штаммов ВКЭ от людей без клинических проявлений заболевания, но отмечавших присасывание клещей, являются прямым доказательством частой инфицированности лиц ВКЭ с проявлением довольно низкого индекса манифестности. У 45% людей, отмечавших присасывание клеща и имеющих вирусный антиген (АГ) в крови, противовирусные антитела (AT) не выявляются.
Таким образом, вирусологические и клинические наблюдения показывают, что инфицирование человека ВКЭ может иметь разные последствия — от инаппарантной формы инфекции до очаговых форм с летальным исходом. Исход и тяжесть заболевания определяются, по-видимому, как свойствами вируса, так и свойствами макроорганизма.
Основной биологической характеристикой ВКЭ, определяющей течение и исход болезни, является способность вируса преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему (ЦНС) — т. е. нейроинвазивность. Свойства вируса, определяющие его активность при периферическом попадании в организм млекопитающих, изучены недостаточно.
Достижения современной науки позволяют по-новому взглянуть на патогенез вирусных инфекций, в котором одно из ведущих мест занимают иммунологические процессы, представляющие собой сложный каскад взаимодействий вируса с различными иммунокомпетентными клетками. Механизмы развития инфекционного процесса в совокупности с данными о формировании иммунного ответа при КЭ до сих пор не исследованы. Поэтому одной из важных задач современной вирусологии является изучение особенностей взаимодействия штаммов ВКЭ с разным уровнем патогенности с иммунной системой макроорганизма.
Актуальность, своевременность и практическая значимость исследуемой проблемы связана с необходимостью получения новых знаний о развитии инфекционного процесса при заражении ВКЭ и о том, какие характеристики вируса влияют на тяжесть течения заболевания. Полученные данные могут дать новые возможности для прогнозирования течения и исхода заболевания, будут важны при разработке профилактических и лекарственных средств, в том числе — иммуномодуляторов, а также для оценки эпидемической ситуации в очагах.
Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение основных характеристик острой и инаппарантной инфекции, вызванной вариантами вируса КЭ с высокой и низкой нейроинвазивностыо при периферическом заражении мышей линии BALB/c.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить патогенез острой формы КЭ, вызванной адаптированными к мышам штаммами Абсетгаров и ЭК-328 при периферическом заражении мышей линии BALB/c.
2. Изучить патогенез инаппарантной формы КЭ, вызванной адаптированным к клещам вариантом М при периферическом заражении мышей линии BALB/c.
3. Изучить динамику накопления специфических AT и основных цитокинов в крови мышей при острой и инаппарантной формах КЭ.
4. Оценить возможность использования информации, полученной в экспериментах на мышах, для прогнозирования течения КЭ у людей.
5. Изучить протективный иммунитет, формирующийся при инаппарнтной инфекции, вызванной вариантом М ВКЭ.
6. Изучить молекулярно-биологические характеристики белка Е вариантов ВКЭ, вызывающих острую и инаппарантную формы инфекции.
7. Изучить протективные свойства бактериальной плазмиды pMV45 с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.
Научная новизна. В результате проделанной работы впервые получена подробная характеристика инаппарантной формы инфекции КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью, характеризующаяся отсутствием 6 вирусемии и инфекционного вируса в ЦНС, синтезом AT к неструктурному белку NS1 при отсутствии синтеза AT к белку Е и формированием длительного протективного иммунитета.
Впервые показано, что отсутствие вирусемии при инаппарантной инфекции, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ, связано с быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови.
Впервые изучены особенности формирования иммунного ответа при инаппарантной форме инфекции КЭ у мышей, вызванной адаптированным к клещам вариантом ВКЭ.
Впервые показана возможность формирования длительного протективного иммунитета при иммунизации мышей адаптированным к клещам вариантом ВКЭ с низкой нейроинвазивностью без участия AT к поверхностному гликопротеину Е.
Впервые изучены молекулярные механизмы, лежащие в основе низкой нейроинвазивности варианта ВКЭ, полученного при адаптации к клещам. Показано, что при адаптации к клещам ВКЭ происходит селекция вариантов вируса с мутациями в геноме, приводящими к изменению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах (ГАГ).
Научно-практическая ценность. В процессе данной работы было показано, что экспериментальная инфекция у мышей является хорошей моделью не только для изучения патогенеза, но и для изучения механизмов формирования иммунного ответа и протективного иммунитета при КЭ у людей.
Получены предварительные данные, указывающие на то, что повышение концентрации сыворотчного ИЛ-6 при КЭ является признаком повреждения клеток ЦНС вирусом и свидетельствует о тяжелом течении инфекционного процесса.
На мышиной модели показано, что для иммунизации неструктурным белком NS1 перспективной биологической системой синтеза и доставки АГ является бактериальная плазмида, с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ.
Полученная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в организме клеща может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза AT к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей. Сведения о распространении подобных вариантов в природе могут дать новую информацию о микроэволюции ВКЭ и о связи свойств циркулирующих в очаге штаммов ВКЭ с частотой и тяжестью заболевания.
Выводы.
1. Получена модель инаппарантной инфекции КЭ: при периферическом заражении: мышей линии BALBc адаптированным к клещам вариантом М, которая характеризуетсяотсутствием клинических симптомов заболевания, вирусемииинфекционного вируса и морфологических повреждении в ЦНС, отсутствием персистенции вируса, а также отсутствием AT к белку Е вкрови зараженных животных при наличии^ размножения вируса в органах иммунной системы ¦ и формирования длительного протективного иммунитета против высоковирулентного штамма ВКЭ.
2. Бессимптомное течение инфекции, .вызываемой адаптированным к клещам вариантом М, определяется быстрым удалением вируса-из кровотока’за счет повышенной сорбции вирионов наклетках крови, ранней активацией5 неспецифического иммунитета, а также активацией Th 1 -лимфоцитов.
3. Повышение концентрации сывороточного ИЛ-6 в ходе инфекции при клещевом энцефалите указывает на повреждение клеток ЦНС вирусом, что сопровождается тяжелым течением инфекционного, процесса.
4. Протективный иммунитет при иммунизации мышей вариантом М формируется засчет активации как клеточного, так и гуморального иммунитета с образованием? антител к неструктурному белку NS1 ВКЭ при отсутствии антител к белку Е.
5: Иммунизация мышей бактериальной, плазмидой с клонированным под контроль промотора ранних генов цитомегаловируса белком NS1 ВКЭ обеспечивает защиту мышей от выраженногоинфекционного процессапри последующем введении высоковирулентного гомологичного вируса.
6. Снижение нейроинвазивности адаптированного к клещам варианта М по сравнению с родительским штаммом ЭК-328 сопровождается • появлением двух замен в оболочечном белке Е, одна из которых может приводить к увеличению заряда вирионов и повышению их сорбции на гликозаминогликанах клетки.
БЛАГОДАРНОСТИ.
Выражаю глубокую благодарность дирекции ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (директор — академик РАМН С.Г. Дроздов) и дирекции ФГУП «ПИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН» (директор — Г. А. Белова) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я искренне благодарна кбн Г. Г. Каргановой и дмн А. В. Тимофееву за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН Т. И. Дживанян, А. П. Гмыля, JI.B. Гмыль, Л. Ю. Романову и сотрудника ГИСК им. Л. А. Тарасевича Н.В. Терешкину за помощь и участие в настоящей работе. Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении данных исследований.
