Изменчивость гена pol вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) подтипа А, циркулирующих в России

Актуальность проблемы.

Угроза, которую представляет инфекция вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) здоровью человечества, выражена тремя аспектами: неизбежностью летального исхода заболевания, глобальным масштабом эпидемии и отсутствием средств специфической профилактики инфекции. По данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД, в России на 10.04.2006 официально зарегистрировано 354 031 случаев ВИЧ-инфекцииежегодно увеличивается количество больных и умирающих от СПИДа (Покровский и соавт., 2005). Единственным известным на сегодняшний день средством, препятствующим прогрессии заболевания, является комбинированная антиретровирусная (АРВ) терапия, которая заключается в одновременном применении нескольких ингибиторов вирусных ферментов — протеазы и/или обратной транскриптазы (ОТ). Однако, основная проблема, осложняющая этиотропную терапию ВИЧ-инфекции, заключается в развитии устойчивости, или резистентности, вируса к действию лекарственных средств. Резистентные варианты вируса чаще всего возникают в популяции de novo как результат неоптималыюго подбора АРВ-препаратов или нарушения режима их приема, однако известны и случаи заражения устойчивыми штаммами ВИЧ-1 (Lukashov et al., 2000; Ammaranond et al., 2003). В условиях ограниченного доступа к лекарственным средствам, характерным для России в переходный период, вопрос о резистентности ВИЧ не только не перестает быть актуальным, но и приобретает особое значение. Монотерапия или битерапия с использованием ингибиторов вирусных ферментов может приводить к более быстрому развитию устойчивых вариантов ВИЧ, которые, передаваясь как вертикально, так и горизонтально, способны вызывать новые случаи инфекции. Очевидно, таким образом, что для широкомасштабного внедрения АРВ-терапии в стране необходима информация об уровне лекарственной устойчивости в популяции циркулирующих вариантов вируса, т. е. среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты.

Основным способом анализа лекарственной устойчивости ВИЧ-1 является генотипирование, или выявление мутаций в геноме вируса, ответственных за ее развитие. Подавляющее большинство мутаций устойчивости ВИЧ-1 локализуется в области гена pol, кодирующей протеазу и первые 240 аминокислотных остатков (а.о.) ОТ. Выделяют два вида мутаций устойчивости ВИЧ-1 — первичные и вторичные. Первичные мутации непосредственно вызывают снижение чувствительности вируса к АРВ-препаратам, но при этом, как правило, ухудшают его репликативную способность. Вторичные мутации не влияют на уровень лекарственной устойчивости, но в большей или меньшей степени восстанавливают репликативную способность вируса, несущего первичные мутации (Quinones-Mateu and Arts, 2001). Если селекция первичных мутаций всегда является следствием воздействия лекарственных веществ и в большинстве случаев не зависит от генетического подтипа ВИЧ-1 (Kantor et al., 2005), то вторичные мутации могут появляться в геноме вируса спонтанно, а у некоторых подтипов ВИЧ-1 даже присутствовать постоянно как проявление генетического полиморфизма. Поэтому частота их встречаемости среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты, может быть очень высокой и, как правило, зависит от генетического подтипа ВИЧ-1.

Необходимо отметить, что мутации устойчивости лучше всего изучены в геноме ВИЧ-1 генетического подтипа В, типичного для индустриально развитых стран. Это связано с тем, что именно в этих государствах в наиболее полном объеме обеспечивается лечение и мониторинг его эффективности у лиц, инфицированных ВИЧ-1. Однако, на территории России, как и многих других стран-бывших советских республик, в настоящее время доминирует ВИЧ-1 подтипа A (Bobkov et al., 2004; Vazquez de Parga et al., 2005). В 1996 г. этот вариант вируса, впоследствии названный IDU-A, проник в среду российских потребителей инъекционных наркотиков (ПИН), что вызвало быстрое распространение эпидемии по всей территории страны — сначала в этой группе риска, а затем и среди половых партнеров ПИН. К 2003 г. вариант IDU-A, по некоторым оценкам, вызвал 94% случаев ВИЧ-инфекции в России (Bobkov et al., 2004). Несмотря на это, область гена pol у него к началу настоящей работы, т. е. к 2003 г., оставалась неисследованной. Было опубликовано только восемь последовательностей гена pol IDU-A, но и они были выделены в Молдавии, Белоруссии, Украине (Pandrea et al., 2001; Liitsola et al., 2000; Masharsky et al., 2003). Вместе с тем, для правильной интерпретации результатов генотипирования лекарственной устойчивости необходима максимально полная информация о генетической изменчивости вариантов ВИЧ, циркулирующих в стране.

Цель и задачи работы.

Цель исследования состояла в определении степени изменчивости гена pol и распространенности мутаций лекарственной устойчивости у инфицированных вариантами ВИЧ-1 подтипа, А лиц в России, не принимавших АРВ-препараты, для оптимизации мониторинга и совершенствования терапии ВИЧ-инфекции в России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить нуклеотидные последовательности областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, и частоту встречаемости значащих мутаций гена pol, у инфицированных вариантами ВИЧ-1 подтипа, А лиц в России, не принимавших АРВ-препараты к моменту забора крови.

2. Оценить потенциальное влияние выявленных мутаций в гене pol на лекарственную устойчивость ВИЧ-1 и эффективность АРВ-терапии.

3. Провести филогенетический анализ и определить степень генетической изменчивости областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, у исследуемых вариантов ВИЧ-1 подтипа А.

4. Охарактеризовать возможность применения методов молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа для различения вариантов ВИЧ-1 подтипа А, несущих мутации гена pol.

5. Оцепить способность вариантов ВИЧ-1 подтипа А, несущих мутации гена pol, к передаче от человека к человеку.

6. Изучить закономерности изменения частоты встречаемости основных вариантов ВИЧ-1, несущих мутации гена pol, на протяжении эпидемии ВИЧ-инфекции в разных регионах России в период времени с 1996 по 2005 гг.

Научная новизна и практическая ценность работы.

1. Показано, что варианты ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующие в России среди потребителей инъекционных наркотиков и их половых партнеров, потенциально чувствительны к действию ингибиторов протеазы и ОТ. Эта информация позволяет избежать дорогостоящего тестирования лекарственной устойчивости ВИЧ-1 перед началом АРВ-терапии у пациентов из данных групп риска (если отсутствуют дополнительные указания па возможность инфицирования устойчивым штаммом ВИЧ-1 в конкретном случае).

2. Для вариантов ВИЧ-1 подтипа А, выделенных от не употреблявших АРВ-терапию людей, впервые показана высокая частота встречаемости мутаций гена pol, вызывающих аминокислотные замены V77I, I93L в протеазе и A62V в ОТ и известных ранее для ВИЧ-1 подтипа В как вторичные мутации лекарственной устойчивости. Информация о высокой распространенности этих мутаций в России свидетельствует о необходимости корректировать алгоритмы интерпретации результатов генотипирования лекарственной устойчивости ВИЧ, проводимого в нашей стране у лиц, принимающих АРВ-терапию.

3. Впервые показано, что ВИЧ-1 IDU-A филогенетически гетерогенен. Это выражается в циркуляции (т. е. передаче от одних лиц другим) на территории России четырех вариантов этого вируса, различающихся наличием или отсутствием мутаций V77I в протеазе и/или A62V в ОТ. К ним относятся три варианта, имеющие мутантные /wZ-генотипы Mutv77i/A62v, Mutv77i> MutA62v, и один, являющийся для них «родительским» штаммом дикого типа. Обнаружена монофилетическая природа вариантов Mutv77i/A62v и Mutv77b распространенных в разных регионах России. Ро/-генотип, таким образом, является эпидемиологическим маркером различных циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А. В настоящей работе предложено определять ро/-геиотип, наряду с практиковавшимся ранее определением генетического подтипа ВИЧ-1, в целях эпидемиологических расследований. Для определения pol-генотипа показана возможность использования, помимо определения нуклеотидных последовательностей, одного из двух методов: молекулярной гибридизации на биологических микрочипах или рестрикционного анализа.

4. Показан низкий уровень изменчивости гена pol вариантов ВИЧ-1 IDU-A, а также обнаружены различия в характере генетической изменчивости области, кодирующей протеазу, (pro) и области, кодирующей ОТ (Rt). Информация о низкой гетерогенности этих областей генома вариантов ВИЧ-1 подтипа А, доминирующих на территории России, позволяет осуществить разработку новых генотипических тестов, в том числе, гибридизационных, адаптированных для выявления мутаций лекарственной устойчивости в геноме ВИЧ-1 подтипа А, а также для совершенствования методов молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции. 27 нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1 подтипа А, кодирующей протеазу, депонированы в GenBank под номерами с AY618594 по AY618620.

В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием необходимости мониторинга лекарственной устойчивости ВИЧ-1 и способствовать внедрению средств такого мониторинга в клиническую практику.

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и отдела общей вирусологии ГУ НИИ вирусологии имени Д. И. Ивановского РАМН (Москва, 2006, доклад), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004, доклад), Втором и Третьем Европейских семинарах «Лекарственная устойчивость ВИЧ: от фундаментальной науки к клиническому значению» (Рим, Италия, 2004, и Афины, Греция, 2005, постеры), 15-ой Всемирной конференции по СПИД (Бангкок, Тайланд, 2004, доклад), 12-ом Международном семинаре по динамике и эволюции ВИЧ (Кливленд, США, 2005, постер), 10-ой Европейской конференции по СПИД (Дублин, Ирландия, 2005, постеры). По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Анализ ВИЧ-специфических нуклеотидных последовательностей гена pol позволил установить, что в России среди лиц, инфицированных ВИЧ-1 подтипа, А и не принимавших АРВ-препарты, не выявляются первичные мутации устойчивости, но с высокой частотой встречаются мутации, известные как вторичные мутации устойчивости у ВИЧ-1 подтипа В и выражающиеся в заменах M36I, V77I, I93L в протеазе и A62V в обратной транскриптазе. Частота встречаемости этих мутаций составила 100,0%, 56,9%, 100,0% и 57,1% соответственно.

2. С помощью интерпретации данных гепотипировапия показана потенциальная чувствительность циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа, А к действию ингибиторов протеазы и обратной транскриптазы.

3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена pol позволил идентифицировать четыре варианта ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующих в России. Три из них имеют мутантные ро/-генотипы MutV77i/A62v, MutV77i, MutA62v, к отличительным особенностям которых относятся мутации V77I в протеазе и/или A62V в обратной транскриптазе, и один является «родительским» штаммом дикого типа.

4. Варианты мутантных ро/-генотипов MutV77i/A62v, Mutv77i и MutA62v характеризуются более низким уровнем вариабельности гена pol, чем варианты ВИЧ-1 дикого типа, что в большей степени проявляется в области, кодирующей протеазу (0,74, 0,37 и 0,00 против 1,88 соответственно), чем в области, кодирующей обратную транскриптазу.

1,09, 0,95, 1,23 против 2,06 соответственно).

5. Ро/-гепотип циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа, А сохраняется при передаче в от человека к человеку, что позволяет определять его в целях эпидемиологических расследований в очагах ВИЧ-инфекции. Для определения pol-генотипа ВИЧ-1 подтипа, А показана адекватность применения методов молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа.

6. Варианты ВИЧ-1 подтипа, А ро/-генотипов Mutv77i/A62v и Mutv77i возникли, по-видимому, из одного источника не позднее 1997 г. и распространялись быстрее, чем другие варианты вируса, что в период с 1998 по 2004 гг. сопровождалось ростом частоты их встречаемости в России и к 2005 г. привело к преобладанию вариантов.

Mutv77I/A62V.