Использование различных соединений серы пропионовокислыми бактериями

глубокое изучение физиологических особенностей этих ценных микроорганизмов может выявить новые возможности их использования, а также явиться фактором повышения продуктивности.

Целью данной работы явилось изучение способности пропио-новокислых бактерий использовать различные соединения серы.

Конкретные задачи настоящей работы состояли в следующем:

— изучение принципиальных возможностей пропионовокислых бактерий использовать в качестве источника серы соединения серы различной степени окисленности.

— изучение особенностей потребления различных соединений серы.

— изучение некоторых аспектов транспорта сульфата и его регуляции.

— изучение механизмов ассимиляции элементарной серы.

В результате исследования установлено, что представитель пропионовокислых бактерий Propionibacterium shermanii Обладает широкими возможностями в отношении использования соединений серы различной степени окисленности.

Показано, что потребление сульфата в динамике развития культуры p. shermanii отличалось от потребления других серосодержащих субстратов. Потребление Сульфата Культурой P. shermanii носило осцилляторный характер.

Исследованы некоторые аспекты транспорта сульфата и его регуляции.

Впервые показана способность p. shermanii ассимилировать элементарную серу. Показана энзиматическая природа восстановления элементарной серы в ходе ассимиляции. Установлена локализация редуктазы элементарной серы.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I.

РОЛЬ СЕРЫ В ЖИЗНИ КЛЕТКИ И ЕЁ БИОГЕОХИМИЧЕСКИЙ ЦИКЛ.

Сера является одним из наиболее важных для живого организма элементов. В микробной клетке на её долю приходится около 1% от сухого вещества биомассы (Стейниер и др., 1979). Сера входит в состав белков (в аминокислотах цистеине и метионине) и некоторых коферментов, например, биотина, тиамина, коэнзима, А и липоевой кислоты, sh-группы входят в состав активных центров многих ферментов и выполняют другие важные биологические функции.

Живые организмы могут удовлетворять свою потребность в сере за счёт использования различных природных серосодержащих соединений. Наиболее распространенными источниками неорганической серы в природе являются сульфат и сульфид. Тиосульфат, политионаты имеют меньшее значение (Roy and Trudinger, 1970; Martinez et al. 1983).

Сульфат является источником серы в морях, где его концентрация составляет 0,03 М. Сульфид и сульфат — основные источники серы в пресной воде и литосфере. Большое количество серы содержится в атмосфере. Ежегодно туда поступают громадные количества газообразных серосодержащих соединений в виде h2s и so2, которые образуются либо биологическим путём, либо за счёт сжигания топлива и в меньшей мере за счёт вулканической деятельности. H2s не накапливается в атмосфере, так как в присутствии кислорода быстро окисляется до so2. so2 в свою очередь может окисляться до so^. so2 и so^, растворяясь в воде, образуют кислоты h2so3 и h2so4, которые с осадками возвращаются на землю, вызывая разрушение горных пород и закисление почв, что снижает их плодородие.

Многие микроорганизмы и растения могут потреблять серу в её наиболее окисленной форме в виде сульфата и, постепенно восстанавливая его, включать в органические соединения. Реакции восстановления «дороги» в энергетическом смысле и по мнению Шиффа И Фанкхаузера (Schiff and Fankhauser, 1981), могли быть утеряны животными вместе с утратой способности к фотосинтезу. Поэтому, не имея возможности восстанавливать серу (также как азот и углерод), животные восполняют свои потребности, поедая организмы, которые могут проводить эти реакции (микроорганизмы или растения) и получают азот, серу и углерод в восстановленной форме.

Наряду с процессами восстановления окисленных форм серы, в природе наблюдается окисление её восстановленных форм. Превращения различных форм серы, происходящие в природе под действием биологических агентов, обобщаются в виде цикла серы (рис.1).

Наиболее интенсивное восстановление сульфата, в результате которого происходит образование h2s в широких масштабах, осуществляют сульфатредуцирующие бактерии. Они являются основными продуцентами сероводорода в океанах, морях и озерах (Кондратьева, 1983). Сульфатредуцирующие микроорганизмы восстанавливают сульфат (и некоторые серу), используя его в качестве акцептора электронов, образующихся при окислении органических веществ или н2.

В менее широких масштабах восстановление сульфата происходит при ассимиляционной сульфатредукции, которая осуществляется многими микроорганизмами и растениями. В процессе ассимиляционV ной сульфатредукции окисленные соединения серы восстанавливаются до уровня тиолов и используются для биосинтеза различных органических серосодержащих соединений, в частности для биосинтеза цистеина и метионина, включаемых в белки.

При разложении белковых соединений серосодержащие аминокислоты могут претерпевать обратные превращения и окисляться до сульфата. Это основная катоболическая реакция, которая, по всей видимости, происходит во всех живых организмах.

Окисление сульфида через элементарную серу в сульфат осуществляется фотосинтезирующими серными бактериями, которые используют восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов при фотосинтезе, а также хемолитотрофными бактериями семейства Thiobaciiiaceae. Кроме того, установлен участие Beggiatoa и Thiovuium в окислении сульфида и элементарной серы до сульфата.

В природе очень часто происходит сопряжение процессов окисления-восстановления серы, в результате чего образуются тесные взаимосвязи между бактериями, образующими H2s и бактериями его окисляющими. Примером может служить существование смешанных культур сульфатредуцирующих и пурпурных серных бактерий, первые из которых продуцируют h2s, а вторые используют его как донор электронов для фотосинтеза (Кондратьева, 1983).

Биологический круговорот серы неотделим от геохимических процессов, происходящих на Земле. Биологическое воздействие на серу различных микроорганизмов, разложение серосодержащих органических остатков играет важную роль в формировании геологической структуры Земли, в образовании почв. Сульфатредуцирующие бактерии и тиобациллы, по всей видимости, принимали участие в образовании месторождений серы и сульфидных минералов. Последние.

Ассимиляционная сульсрс/т-ре&у/гуир, dHU3nb/f so.

Диссипиляционнс/я сульсрат* редукция.

2- /сульер&тредуцирующие d~cfkmepo<- Ч.

Of'^С \ группы jОкисление хепатросрные и (рототросрные серобактерии.

Рис. I. Круговорот серы в природе исследования сульфатредуцирующих бактерий, выделение новых видов этих организмов, способных окислять ацетат, высшие и низшие жирные кислоты, бензоат (pfennig and widdei, 1982) показали значение сульфатредуцирующих микроорганизмов в процессах полного окисления органической материи в анаэробных условиях.

Глава 2.

АССИМИЛЯЦИОННАЯ СУЛЬФАТ-РЕДУКЦИЯ.

ВЫВОДЫ.

1. P. shermanii обладают широкими возможностями в отношении использования соединений серы. Они используют соединения серы различной степени окисленности: сульфат, сульфит, тиосульфат, сульфид и элементарную серу, что косвенно указывает на то, что перечисленные вещества могут быть интермедиатами пути ассимиляционной сульфатредукции.

2. Установлено, что потребление сульфата клетками p. shermanii в отличие от потребления других серосодержащих соединений, носило осцилляторный характер, т. е. в процессе роста культуры периоды потребления сульфата чередуются с периодами его выделения в среду.

3. Выделение сульфата во внешнюю среду отражает тип регуляции. Регуляция процесса потребления сульфата происходила не по типу ретроингибирования или репрессии, а путём выброса вещества из клетки.

4. p. shermanii способны энзиматически восстанавливать элементарную серу до сульфида. Фермент, осуществляющий восстановление, локализован в мембранной фракции.

— 96 ~.

Заключение

.

Большое значение серы в жизнедеятельности микроорганизмов постоянно привлекало внимание к изучению различных аспектов серного метаболизма. В результате за последние 25 лет были достигнуты большие успехи в изучении процессов, связанных с ассимиляцией серосодержащих соединений. Выяснены принципиально возможные пути ассимиляции сульфата, самого распространенного источника серы. Показаны механизмы регуляции ферментов, составляющих эти пути. Но в области ассимиляции серных соединений есть ещё нерешенные вопросы. Изучение путей ассимиляционной сульфат редукции проводилось на ограниченных группах микроорганизмов. Наиболее полно в этом смысле изучены семейства Rhodospi-rillaceae и Enterobacteriaceae. Другие группы бактерий практически не изучались.

Транспорт сульфата изучался у многих микроорганизмов, представляющих самые разные группы, но полная ясность в понимании этого процесса не достигнута. Транспорт сульфата отличается рядом специфических особенностей, так, например, особенностью этого процесса является связывание со специфическими белками, локализованными в периплазматическом пространстве. Связывание показано только для некоторых грамотрицательных организмов. Является ли эта стадия необходимым этапом, характерным для транспорта сульфата во всех микроорганизмах, предстоит ещё показать.

Транспорт сульфата сложным образом зависит от транспорта других ионов, от энергии трансмембранного потенциала и от рН среды. Эта зависимость лишь отмечена, но суть её практически не раскрыта. Однако, именно изучение транспорта сульфата во взаимосвязи с другими процессами может явиться объяснением ряда его особенностей, в частности, необычной кинетики его потребления.

Большой интерес с точки зрения экологии и физиологии микроорганизмов представляет процесс ассимиляции элементарной серы, который практически не изучался. Существует лишь одно упоминание об использовании элементарной серы представителем истинных гетеротрофов мутантным штаммом Escherichia coii. Представляется интересным выяснить, насколько распространено явление ассимиляции элементарной серы среди гетеротрофов и каким образом этот процесс осуществляется.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 4.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили пропионовокислые бактерии Propionibacterium freudenreichii, ssp. shermanii. В работе использовались также и другие штаммы пропионовокислых бактерий, а именно, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium petersonii и Escherichia coii штамм 52. Микроорганизмы получены из музея кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ.

Среды и условия культивирования.

Пропионовокислые бактерии выращивали на синтетической среде te I следующего состава (в %): лактат На — 2, nh4h2po4 — 0,3, КН2Р04 — 0,1, MgS04 — 0,02, СоС12×6Н20 — 0,0001. MnS04 Had,.

Peel вносились в следовых количествах. Пантотеновая кислота, 3 тиамин и биотин вносились в количествах (мкг/л): 1000, 200 и I, соответственно.

При изучении потребления серосодержащих субстратов исследуемые штаммы микроорганизмов культивировали в среде № 2 следующего состава (в %): лактат на — 2, нн4н2Р04 — 0,3, кн2Р04 — 0,1, MgCl2 — 0,02, CoCig х 6Н20 — 0,0001. Микроэлементы и витамины вносились в указанных выше количествах.

Культура Escherichia coii штамм 52 выращивалась на синтетической среде следующего состава (в г/л): пептон — 5, глюкоза — 0,2, иа2Р04 — 7,5, КН2Р04 — 1,5, (HH4)2S04 — 2, MgS04 — 0,2.

При изучении ассимиляции элементарной серы сера вносилась в среду № 2 в виде тонко размолотого порошка. Колбы инкубировались на качалке (200 об/мин), в результате чего получали тонкую суспензию.

Культивирование проводили в колбах Эрленмейра на 100 мл, которые наполовину заполнялись средой. Инкубация проходила при 30 °C без аэрирования.

Изучение потребления различных соединений серы. При изучении потребления различных серосодержащих субстратов среду fe 2, содержащую в качестве добавки различные соединения серы, засевали истощённым по сере инокулятом. Для истощения запасов эндогенной серы биомассу бактерий, выращенных на среде № I, промывали солевым составом среды № 2, переносили в среду № 2 и дважды на ней пересевали. Определяли динамику потребления серосодержащих субстратов из среды. Определение сульфата.

Сульфат определяли по методу Доджсона (Dodgson, 1961). К 0,2 мл сульфатсодержащего раствора добавляли 3,8 мл 4% трихлор-^ уксусной кислоты (ТХУ), а затем I мл ВаС12-желатины и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Промеряли экстинкцию при.

500 мкм на спектрофотометре. Калибровочная кривая строилась с 2раствором Ka2so4, содержащем от 20 до 200 мкг ионов so^ в пробе. Baci-желатина приставлялась следующим образом: 2 г желатины растворяли в 400 мл воды (60−70°С) и инкубировали при 4 °C 6−12 часов. В этом растворе растворяли 2 г ВаС12 и инкубировали 2−3 часа. Реагент хранили при 4 °C и использовали в течение недели.

Определение сульс&ита.

Сульфит определяли по методу Трюпера и Шлегеля (TrUper & Schlegel, 1964) с фуксинформальдегидом. Исследуемую пробу помещали в мерную колбу на 100 мл содержащую 20 мл 2% раствора ацетата Zn. Затем колбу до 80 мл заполняли дистиллированной водой и приливали 10 мл раствора фуксина (400 мг фуксина на I л 12,5% H2so4). Содержимое колбы хорошо перемешивали и через 10−15 мин добавляли I мл 32% формальдегида. Колбу доводили до метки дистиллированной водой. Через 10 мин после добавления формальдегида измеряли оптическую плотность раствора спектрофотометрически при 570 мкм. Калибровочную кривую строили с раствором Ua2so^, содержащем от 60 до 200 мкг ионов so^ в пробе. Определение сульфида.

Сульфид определяли по методу Трюпера и Шлегеля (тгйрег & Schlegel, 1964). Исследуемую пробу помещали в мерную колбу на 100 мл, содержащую 20 мл 2% раствора ацетата Zn. Затем колбу до 80 мл заполняли дистиллированной водой и приливали 10 мл диме-тил-р-фенилендиамин сульфата (0,2% раствор в 20% HgSO^). Содержимое колбы перемешивали и приливали 0,5 мл ре nh (so) (10% раствор в 2% h2so4). Смесь перемешивали и оставляли стоять 10 минут для развития окраски, после чего содержимое колбы доводили до метки. Оптическую плотность раствора определяли спектрофотометрически при 670 мкм. Калибровочную кривую строили с раст2вором wa2s, содержащим от 10 до 80 мкг ионов s в пробе. Определение тиосульфата.

Тиосульфат определяли по методу Шуна (sh8on, 1959). К 5 мл исследуемой пробы, содержащей от 0 до I мМ тиосульфата, добавляли 10 мл 5 мМ раствора р-хинона. Раствор р-хинона готовили в 0,85 М уксусной кислоте. Инкубировали 2 часа при комнатной температуре, после чего промеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре с фильтром № 3. Калибровочную кривую строили с 2раствором Na2s2o3, содержащем от 40 до 200 мкг ионов s2o^ в мл или от 200 до 1000 мкг ионов s20^ в пробе.

Изучение транспорта сульфата.

Для изучения транспорта сульфата клетки бактерий в экспоненциальной фазе роста, выращенные на среде № I, отделяли центрифугированием (5000 xg, 20 мин 10 С), стерильно отмывали солевым составом среды № 2 и суспендировали в среде № 2. Вновь инкубировали 2 часа при 30 °C для уменьшения уровня внутриклеточного сульфата. Потребление сульфата измерялось при 30 °C в инкубационной смеси, содержащей 5 мл отмытой клеточной суспен.

35 зии (0,9−1,1 мг сух. биомассы/мл, рН 6,8), 10 мкл Na2 so4 (конечная концентрация 0,2 мМ, удельная радиоактивность 4 мкКю/мл).

При изучении влияния возможных ингибиторов в инкубационную.

35 2смесь до внесения so,~ вносились определенные концентрации.

4 35 2проверяемых веществ. Момент внесения so^ считали началом эксперимента. Через определенные интервалы отбирали пробы (0,5 мл), которые помещали в 5 мл раствора солей среды № 2 при 3 °C. Клетки собирали фильтрацией на мембранных фильтрах «Сынпор» № 6 и промывали 5 мл раствора солей среды № 2. Фильтры высушивали при комнатной температуре и помещали во флаконы с 5 мл сцинцил-ляционной жидкости IC-I06. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинцилляционном счетчике Mark.

Изучение выделения сульфата в среду.

Для изучения экскреции сульфата в среду клетки в экспоненциальной фазе роста отмывали от среды № I и суспендировали в.

35 среде № 2 с добавлением на0 so. Концентрация в среде 0,2 мМ.

Удельная радиоактивность 4 мкКю/мл. Инкубировали при 30 С 24 часа. Отбирали аликвоту 10 мл, дважды отмывали раствором солей среды № 2 и переносили: а) в среду № 2, не содержащую сульфат, б) в среду № 2 с добавлением Ha2so^ (2 мМ). Помещение клеток в свежую среду считалось началом эксперимента. Через определенные интервалы времени отбирали пробы по I мл и отделяли клетки на мембранных фильтрах «Сынпор» № 6. Клетки промывали дистиллированной водой объёмом 2 мл. Фильтрат и промывные воды объединяли и добавляли 0,5 мл 11% раствора ВаС12 для осаждения сульфата. Осадок собирали на фильтр «Сынпор» № 8. Измеряли радиоактивность.

Изучение репрессирующего действия цистеина. Для изучения репрессирующего действия цистеина на транспорт сульфата культура выращивалась на среде № 2, куда в качестве источника серы добавлялся цистеин (концентрация в среде 2 ыМ). В качестве посевного материала использовалась суспензия отмытых от сульфата клеток. На 3-й сутки роста клетки отделяли от среды центрифугированием (5000 xg, 20 мин Ю°С), отмывали и вновь суспендировали в среде № 2 с добавлением хлорамфеникола (100 мкг/мл). Потребление сульфата определяли в инкубационной смеси, содержащей 5 мл клеточной суспензии, плотностью 0,95−1,0 мг.

35 сух. биомассы/мл, хлорамфеникол (100 мкг/мл) и ыа2 so4(4 мкКю/мл, конечная концентрация 0,2 мМ). В качестве контроля использовалась стандартная суспензия клеток, выращенных на сульфате. Измерение внутриклеточного пула сульфата. Для изучения динамики изменения внутриклеточного пула сульфата и общего содержания низкомолекулярных органических серосодержащих продуктов среду № 2 засевали клетками с истощённым запасом эндогенной серы. В среду № 2 вносили 3 мМ на so общей.

С. т активностью 40 мкКю. Отбирали пробы (5 мл) в течение развития культуры. Аликвоту 5 мл отмывали дважды раствором солей среды № 2. Из этого количества биомассы экстрагировали кипящей водой фракцию, содержащую неорганический внутриклеточный сульфат и низкомолекулярные органические серосодержащие продукты, руковод.

— 50 ствуясь методами, описанными в работах Сэджела и Джонсона, Бёрнелла И Уотли (Segel and Johnson, 1961; BurnelX & Whatley, 1980). Экстракцию проводили несколько раз и экстракты объединяли. Неорганический сульфат осаждали 5% раствором Baci2 и осадок собирали на мембранных фильтрах «Сынпор» № 8. Фильтры высушивали при комнатной температуре и помещали во флаконы, содержащие 5 мл сцинцилляционной жидкости ЖС-106. Радиоактивность фильтрата после отделения неорганического сульфата соответствовала радиоактивности низкомолекулярных органических серосодержащих продуктов. Аликвоту 0,5 мл помещали во флакон с сцинцилляционной жидкостью 1С-7А. Измеряли радиоактивность.

Определение включения элементарной серы в белки клеток.

Для определения включения элементарной серы в белки клет.

35 о ки выращивали на среде № 2 с s (5 мкКю/мл). Среда засевалась.

35 о истощенным по эндогенной сере инокулятом. Включение s в белки клеток определяли по методу Красильниковой (1981). Отбирали пробы (4 мл) в течение развития культуры. Клетки, содержащиеся в аликвоте, отделялись центрифугированием (5000 х g, 20 мин) и дважды отмывали раствором солей среды № 2. Отмытые клетки обрабатывали горячим спиртом разной концентрации последовательно, используя 96%, 80%, 60% и 40% этанол. Такая 4-х кратная экстракция обеспечивала полное удаление растворимых соединений, содержащихся в клетке. Осадок, представляющий собой смесь нерастворимых клеточных полимеров, гидролизовали 0,65 N наон в течение.

18 часов при 37 °C. Супернатант, представляющий собой гидролизат.

35 о белка, анализировали на присутствие s .

Получение мембранной и цитоплазматической фракций. В середине логарифмической фазы клетки отделяли центрифугированием (5000 xg, 20 мин, 4 С) и дважды промывали 0,1 М фосфатным буфером рН 6,7. Клетки разрушали растиранием в жидком азоте и переводили в 0,1 М Трис-hci буфер рН 7,4, содержащей 10 мМ MgCi2 и I мМ ЭДТА (ТМЭ-буфер). Все последующие процедуры проводили при 4 С. К гомогенату добавляли дезоксирибонуклеазу I (ДНК-азу I, 10 мкг/мл) и после 20 минутной инкубации осколки клеток удаляли центрифугированием при 30 000 xg в течение 15 мин. Бесклеточный экстракт центрифугировали при 100 ООО xg в течение I часа. Полученный супернатант представлял собой цито-плазматическую фракцию. Осадок, содержащий мембранные фрагменты и субчастицы (рибосомы), ресуспендировали в ТМЭ-буфере и центрифугировали при 50 ООО xg в течение I часа. Осадок представлял собой фракцию мембран. Осажденные мембранные фрагменты ресуспендировали в том же буфере до концентрации 0,7−1,0 мг белка на мл и хранили при 4 °C в течение 2−3 дней. Полученные цитоплазмати-ческую и мембранную фракции использовали для определения активности редуктазы элементарной серы.

Получение фракции культуральной жидкости.

Фракцию получали путём осаждения белка из 500 мл культуральной жидкости, полученной после 3-х суточного развития культуры. Белки осаждали сульфатом аммония (80 $ насыщения). Осаждение проводили при 4 °C и при рН 6,7. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, суспендировали в небольшом объёме 0,1 М фосфатного буфера и диализовали в течение 18 часов против двух смен буфера.

Определение активности редуктазы элементарной серы.

Активность редуктазы элементарной серы определяли по методу Фукумори и Яманака (pukumori and Yamanaka, 1979). Определение проводили в анаэробных условиях в атмосфере аргона с восстановленным бензилвиологеном в качестве донора электронов. При наличии активности в тестируемой фракции, восстановление элементарной серы, сопряженное с окислением бензилвиологена, приводит к уменьшению экстинкции раствора. Скорость реакции, т. е. зависимость величины экстинкции от времени, фиксировали спектрофото-метрически при длине волны 550 нм с помощью самописца в спектрофотометре фирмы «Хитачи». Реакционную смесь помещали в анаэробную кювету и освобождались от следов кислорода, продувая смесь аргоном. Для измерения активности использовали реакционную смесь следующего состава: 1,7 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН 6,7, 0,1 мл 0,5 мМ раствора бензилвиологена и 0,02 мл 2°/0 мкМ раствора дитионита. Дитионит восстанавливает бензилвиологен, при этом сам окисляется с высвобождением элементарной серы. Реакцию начинали впрыскиванием тестируемой фракции. Контрольная кювета содержала все компоненты, за исключением тестируемой фракции. Активность редуктазы элементарной серы рассчитывали по формуле: Е = ч с где § - коэффициент экстинкции бензилвиологена при 550 нм, равный 7550 М" 1 см" 1 D — тангенс угла наклона линейного участка зависимости величины экстинкции от времени с — концентрация белка (мг/мл) — коэффициент пересчета на 1-сантиметровую кювету к — фактор разведения Белок определяли с кумасси G-250 по методу Брэдфорда (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.