РНК-полимераза бактерий: иммунология и молекулярная генетика

Актуальность проблемы. Проблема регуляции активности генов является в молекулярной биологии одной из главных. Знание механизмов этой регуляции совершенно необходимо для понимания природы многих принципиальных общебиологических явлений, в частности процесса клеточной дифференцировки, а также для решения практических задач генной инженерии. Важнейшую роль в регуляции экспрессии генов играет первый этап реализации генетической информации — транскрипция. Ферментативный аппарат транскрипции относительно прост и у бактерий состоит по существу из одного фермента — ДНК-зависимой РНК-полимеразы. На многих матрицах этот фермент способен осуществлять все стадии синтеза РНК в отсутствие каких бы то ни было дополнительных факторов: при этом ш уИго образуется точно такая же РНК, как /п zlvo. Даже в том случае, когда в транскрипции участвуют те или иные регуляторные факторы, они лишь помогают или мешают РНК-полимеразе на тех стадиях синтеза РНК, которые она в принципе способна осуществлять и в их отсутствие. Именно поэтому выяснение механизма действия РНК-по-лимеразы дает ключ к пониманию механизмов регуляции транскрипции.

В последние годы благодаря появлению методов клонирования и определения нуклеотидной последовательности ДНК достигнуты значительные успехи в выяснении структуры сигнальных участков нуклеиновых кислот, используемых для регуляции транскрипции. Однако знание структуры одних только регуляторных участков ДНК без знания структуры РНК-полимеразы и других белков, взаимодействующих с ними, совершенно недостаточно для понимания механизмов этой регуляции. Выяснение структуры РНК-полимеразы и функциональной значимости ее элементов стандартными методами белковой химии встречается со значительными трудностями, связанными как со сложностью процесса синтеза РНК, так и с исключительно большими размерами и сложным субъединичным строением РНК-полимеразы. Последнее обстоятельство исключает пока применение к РНК-полимеразе такого прямого метода, как рентгеноструктурный анализ. Все это диктует необходимость привлечения различных нетрадиционных подходов. Наряду с методом аффинных модификаций, наиболее перспективным представляется генетический подход. Действительно, мутации дают уникальную возможность изучения функциональных последствий замен единичных аминокислот в строго определенных положениях полипептидной цепи, причем эти последствия можно изучать не только в пробирке, но и в живой клетке. Идеологически родствен генетическому сравнительный подход, использующий существующие в природе отличия между гомологичными белками, возникшие за счет множества мутаций, накопившихся в, ходе эволюции. Наконец, важную информацию можно получить при использовании в качестве молекулярных ' зондов специфических антител, особенно в сочетании со сравнительным подходом.

Цель и задачи исследования

Основной целью исследования являлась разработка и применение сравнительного, иммунологического и генетического подходов к изучению функциональной роли субъединиц РНК-полимеразы. На первом этапе исследования ставилась задача выяснить, какие субъединицы РНК-полимеразы участвуют в разных стадиях транскрипции. На втором — выяснить функциональную значимость фрагментов субъединиц и отдельных аминокислотных звеньев. Особое внимание уделялось вопросу о том, какие функции РНК-полимеразы требуют эволюционной консервативности структуры соответствующих участков ее молекулы, а какие допускают вариабельность. Конкретные этапы реализации этой программы изложены в тексте.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые применен сравнительный подход к изучению функциональной роли субъединиц РНК-полимеразы. Продемонстрирована структурная и функциональная гомология РНК-полимераз филогенетически далеких видов бактерий. Показано, что в процессе открывания промоторов РНК-полимераза играет активную роль. Впервые показано, что процесс открывания промоторов зависит как ото' —субъединицы, так и от минимального фермента. Совместно с лабораторией Ю. А. Овчинникова (ИБОХ АН СССР) разработан новый метод сравнения пептидных карт близких белков и метод анализа распределения тирозиновых остатков между участками субъединиц, выходящими на поверхность белка и скрытыми в нем за счет межсубъединичных контактов. Продемонстрирована возможность изучения филогенетических связей бактерий путем сравнения антигенной структуры РНК-полимераз. Показана различная скорость эволюционной дивергенции 0 и^уЗ'-субъединиц РНК-полимеразы. Антитела впервые применены для ингибиторного анализа функций субъединиц РНК-полимеразы. Совместно с лабораторией О. В. Рохлина (ВКНЦ АМН СС. СР) впервые получены моноклональные антитела против РНК-полимеразы Е. со?*. Разработаны основы метода локализации индивидуальных антигенных детерминант^{-субъединицы} РНК-полимеразы. С помощью обычных и моноклональных антител продемонстрировано участие уЗи [?> -субъединиц в связывании с ДНК и в элонгации цепей РНК. Впервые продемонстрирована эволюционная консервативность участка РНК-полимеразы, контактирующего с промоторами. Впервые разработан метод обнаружения антигенных детерминант субъединиц РНК-полимеразы, участвующих в контактах с другими субъединицами. Впервые установлено, что функционирование ряда участков РНК-полимеразы совместимо со значительной структурной вариабельностью. Проведены систематические исследования функциональной роли субъединиц РНК-полимеразы генетическими методами.

Впервые введены в практику таких исследований холодочувстви-тельные мутации. С их помощью продемонстрировано участие ри субъединиц во взаимодействии РНК-полимеразы с промоторами и в элонгации цепей РНК, получены данные в пользу того, что контакты РНК-полимеразы с разными промоторами могут различаться. Разработан метод направленного получения мутаций в клонированных генах РНК-полимеразы, позволяющий проводить идентификацию мутаций путем определения нуклеотидной последовательности ДНК. Совместно с лабораторией Е. Д. Свердлова (ИБОХ АН СССР) идентифицированы аминокислотные звенья^{-субъединицы,} существенные для взаимодействия РНК-полимеразы с рифампицином. Найдены производные рифамици-на, способные подавлять РНК-полимеразу некоторых мутантов, устойчивых к рифампицину. Разработанные в. диссертации подходы открывают широкие возможности для дальнейшего исследования функциональной роли различных участков и отдельных аминокислотных звеньев РНК-полимеразы, -могут быть использованы для решения вопросов классификации бактерий, а также при поиске новых производных рифамицинов.

Результаты работы получены как лично автором, так и в соавторстве с Э. С. Каляевой, 0. Н. Данилевской и аспирантами В. В. Бельковым, А. И. Грагеровым, А. Н. Лебедевым, 0. А. Ларионовым и Е. П. Моисеевой, работавшими в ЙМГ АН СССР под руководством автора. Сотрудничество с другими институтами отмечено в тексте.